生化分析翻譯作業(yè).doc

2.1.1吸光光度法(280nm)使用注意事項(xiàng)吸光光度法操作起來十分快捷方便，因?yàn)椴⒉恍枰砑宇~外的試劑或進(jìn)行預(yù)處理。沒有蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)需要準(zhǔn)備。吸光光度法不消耗蛋白質(zhì)，吸光度與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。由于不同的蛋白質(zhì)和核酸俱有各自不同的吸收特性，因此對(duì)未知成分的物質(zhì)或蛋白質(zhì)的混合物，吸光光度法可能有較大誤差。溶液中任何對(duì)紫外光有吸收的非蛋白成分都會(huì)干擾測(cè)定。細(xì)胞和組織樣品中往往含有會(huì)干涉測(cè)定的不溶性或有色成分。吸光光度法最常見的用途是監(jiān)視層析柱分?jǐn)?shù)，或是應(yīng)用在需要快速估測(cè)、蛋白質(zhì)濃度的誤差可以忽略不計(jì)的場(chǎng)合。吸光度法在操作時(shí)，常用牛血清白蛋白或其他純蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行標(biāo)定。原理溶液中的蛋白質(zhì)在280和200nm處對(duì)紫外光有最大吸收值。含芳環(huán)的氨基酸是造成280nm處吸收峰的主要原因，200nm處的吸收峰由肽鍵引起。二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)都會(huì)影響吸收，所以pH、離子強(qiáng)度等，均可對(duì)吸收光譜產(chǎn)生影響。儀器設(shè)備除了標(biāo)準(zhǔn)溶液以外，還需要紫外分光光度計(jì)和石英比色皿。分析未知的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的混合物。使用下面的公式來粗略估算蛋白的濃度。大多數(shù)分光計(jì)的光路長(zhǎng)度為1cm。濃度（mg/ml）=280nm處吸光度除以光路長(zhǎng)度（cm.）已知吸光系數(shù)的純蛋白質(zhì)。對(duì)于1cm的光路，使用下列公式。濃度的單位是采用mg/ml、%或體積摩爾濃度，取決于操作所使用的系數(shù)。濃度=280nm處的吸光度除以吸光系數(shù)可按下列關(guān)系式轉(zhuǎn)換單位：Mg蛋白/ml=蛋白除以10=質(zhì)量除以蛋白質(zhì)分子的摩爾濃度可能遭核酸污染的未知樣品。使用下列公式來估算蛋白質(zhì)濃度：濃度（mg/ml）=（1.55x280nm處吸光度）-（0.76x260nm處吸光度）注意事項(xiàng)冷溶液會(huì)使試管起霧，熱溶液會(huì)釋放氣泡，從而干擾讀數(shù)。對(duì)于濃縮溶液（吸光度大于2）可簡(jiǎn)單地對(duì)其進(jìn)行稀釋。常用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的吸光系數(shù)：牛血清白蛋白（BSA）：63牛，人，或兔IgG：138雞卵清蛋白：70參考文獻(xiàn)Layne,E.SpectrophotometricandTurbidimetricMethodsforMeasuringProteins.MethodsinEnzymology3:447-455.1957.Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990.吸光度測(cè)定（205nm）使用注意事項(xiàng)參見波長(zhǎng)在280nm處吸光度測(cè)定的注意事項(xiàng)。此方法與測(cè)定280nm處的吸收一樣方便。因?yàn)楹怂嵩?05nm處的吸收非常小，如果樣品被核酸過度污染，這種方法可能是首選的測(cè)量方法。設(shè)置波長(zhǎng)有點(diǎn)棘手，因?yàn)?05nm正好處于蛋白質(zhì)吸收峰的肩部。原理見280nm處吸光度測(cè)量的討論。步驟含0.01十二烷基聚乙二醇醚的緩沖液，以防蛋白質(zhì)在塑料或玻璃表面的吸附。對(duì)于在205nm處的檢測(cè)這是必要，因?yàn)橄∪芤旱膿p失更高。紫外燈預(yù)熱（約15分鐘）。調(diào)整波長(zhǎng)為205nm只用緩沖溶液校準(zhǔn)吸光度至零測(cè)量蛋白質(zhì)溶液吸光度分析蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=31（在205nm處的吸收）。注意冷溶液會(huì)使試管起霧，熱溶液會(huì)釋放氣泡，從而干擾讀數(shù)。溶液必須比280NM處吸光度檢測(cè)中使用的更稀。205nm處蛋白質(zhì)的吸光更為強(qiáng)烈，根據(jù)推測(cè)也有更少的蛋白質(zhì)間的變異。除了需要設(shè)置一個(gè)準(zhǔn)確的波長(zhǎng)，雜散光也是一大問題。為了避免這些問題，使用10微克/微升牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。設(shè)定緩沖溶液吸光度為零，通過內(nèi)插法確定未知樣品的濃度（濃度在0至10微克/微升之間）。因?yàn)樵?至10微克/微升區(qū)間內(nèi)，吸光度和濃度呈線性關(guān)系。通過確定210nm處（消光系數(shù)的范圍從20到24）的吸光度，需要準(zhǔn)確設(shè)置波長(zhǎng)的難題可以避免。但是，這在緩沖體系中反應(yīng)不敏感，也更多變。參考文獻(xiàn)Scopes,RK.Scopes,RK.AnalyticalBiochemistry59:277.1974.Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990.未知濃度蛋白質(zhì)消光系數(shù)的測(cè)定使用注意事項(xiàng)適用于可用于未知消光系數(shù)的純蛋白質(zhì)溶液。儀器設(shè)備除了標(biāo)準(zhǔn)溶液以外，紫外分光光度計(jì)和石英比色皿都是必需的。步驟將溶液稀釋30倍在205nm處檢測(cè)，配置含0.01十二烷基聚乙二醇醚的緩沖液，以防蛋白質(zhì)在塑料或玻璃表面的吸附。分析使用下面的公式確定205nm處的消光系數(shù)：E（205nm）=27+120（280nm處吸光度除以205nm處吸光度）在205nm的讀數(shù)必須乘以使用公式前的稀釋倍數(shù)。接下來，確定蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度（M）=205nm處吸光度除以定205nm處的消光系數(shù)現(xiàn)在可以確定280nm處的消光系數(shù)：E(280nm)=蛋白質(zhì)濃度（M）除以280nm處吸光度注意不正常的苯基丙氨酸含量會(huì)極大程度上推翻結(jié)果。該技術(shù)的準(zhǔn)確性取決于氨基酸的平均組成。參考文獻(xiàn)Scopes,RK.AnalyticalBiochemistry59:277.1974.Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990.Hartree-Lowry和改進(jìn)Lowry蛋白測(cè)定法使用注意事項(xiàng)Lowry分析（1951年）是一種常用的蛋白檢測(cè)法。有時(shí)候，它是為精確測(cè)定細(xì)胞組分、色譜組分、酶制劑中蛋白質(zhì)的最好方法。由于建立在同樣理論基礎(chǔ)上的二喹啉甲酸分析法（BCA）只需一步即可完成，所以需要兩部反應(yīng)的Lowry分析被指出已經(jīng)過時(shí)了（Stoscheck，1990年）。.但是，改進(jìn)后的Lowry分析完全是在室溫下進(jìn)行的。Hartree版的Lowry分析法，是對(duì)Lowry分析法最新的改進(jìn)。它使用較少的試劑，提高了對(duì)一些蛋白質(zhì)的響應(yīng)靈敏度，減少了與某些鹽溶液不相溶的可能性，提供了更線性的響應(yīng)。Hartree-Lowry分析法是第一位的方法。原理在堿性條件下，二價(jià)銅離子形成含有肽鍵的化合物而被還原成一價(jià)。一價(jià)銅離子和酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的活潑基團(tuán)，與Folin試劑反應(yīng)生成不穩(wěn)定的產(chǎn)品，呈現(xiàn)鉬/鎢藍(lán)色。儀器設(shè)備除了標(biāo)準(zhǔn)溶液以外，紅外分光光度計(jì)和濾光片都是必需的。還可能用到玻璃或（更便宜的）聚苯乙烯試管Hartree-Lowry實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟：反應(yīng)物：試劑A由2克四水合酒石酸鈉鉀，100克碳酸鈉，500毫升1N的氫氧化鈉組成，加H20稀釋至一公升（即最終濃度為7mM鈉鉀酒石酸鹽，0.81M碳酸鈉，0.5N氫氧化鈉）?？墒褂?至3個(gè)月。試劑B由2克四水合酒石酸鈉鉀，1克五水和硫酸銅，90毫升H20，10毫升1N的氫氧化鈉組成（即最終濃度為70mM鈉鉀酒石酸，40mM硫酸銅）?？墒褂?至3個(gè)月。試劑C為1vol Folin-Ciocalteau 加15vol水稀釋。檢測(cè)準(zhǔn)備一系列含0.3 mg/ml牛血清白蛋白和未知物的緩沖液，使得濃度從30 to 150 micrograms/ml（0.03至0.15毫克/毫升）。在各個(gè)試管里加入1.0ml上述標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和0.90ml試劑A，然后混合。在50C水浴加熱10min，然后冷卻到室溫。在各個(gè)試管里依次加入0.1ml試劑B，混合均勻后在室溫條件下恒溫10min迅速在各個(gè)試管里依次加入3ml試劑C,混合后在50C的水浴里恒溫反應(yīng)10min，然后冷卻到室溫。然后定容至5ml。在1cm的試管中測(cè)量650nm處的吸光度。分析準(zhǔn)備一個(gè)吸光度和微克蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（反過來也行）。從曲線上確定數(shù)值。從蛋白質(zhì)試樣的體積和稀釋倍數(shù)來確定原始試樣的濃度。修改的Lowry實(shí)驗(yàn)步驟（室溫）試劑將20g碳酸鈉溶解在260ml水中，0.4克5水硫酸銅溶解于20毫升水中，0.2g酒石酸鈉鉀鹽于20ml水中?；旌线@三種溶液來制備銅試劑。準(zhǔn)備100毫升1的十二烷基硫酸鈉溶液（SDS）。準(zhǔn)備1M氫氧化鈉溶液（4/100毫升）。混合3倍的銅試劑和1份SDS和1份氫氧化鈉。溶液穩(wěn)定的2-3個(gè)星期。如果 生成白色沉淀，加熱溶液至37C。如果有黑色沉淀生成，則丟棄不用。如果三試劑分別儲(chǔ)存用前混合，更好?；旌?0ml2N Folin試劑于90ml水中，制成0.2N的Folin試劑。保存于黃色試劑瓶中，溶液能穩(wěn)定保存數(shù)月。檢測(cè)用緩沖液稀釋試樣至約0.025-0.25 mg/ml。如果試樣濃度無(wú)法估計(jì)，建議準(zhǔn)備2-3個(gè)稀釋度范圍跨越一個(gè)數(shù)量級(jí)。每份稀釋度準(zhǔn)備400微升。建議每個(gè)稀釋度準(zhǔn)備三份。準(zhǔn)備一個(gè)400微升緩沖區(qū)的參考。準(zhǔn)備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白試液。方法是：稀釋0.25 mg/ml牛血清白蛋白試液，加40400微升0.25 mg/ml牛血清白蛋白試液于13 x 100 mm試管中與緩沖液混合在400微升的試管中。加400微升的Lowry，完全混合。在室溫下反應(yīng)10min?？焖偌尤?00微升0.2 N Folin試劑，立刻渦旋混合。完全混合必須要迅速完成以避免試劑在于蛋白質(zhì)反應(yīng)之前發(fā)生分解反應(yīng)。在室溫下反應(yīng)30min以上。使用玻璃或聚苯乙烯試管測(cè)量750nm處的吸光度。如果結(jié)果過高，則應(yīng)該在500nm處測(cè)量。評(píng)論：修改后的Lowry法吸光度測(cè)定只需要10分鐘內(nèi)完成。而以前的原始方法卻需要通過顏色的變化來準(zhǔn)確測(cè)定時(shí)間。這個(gè)改進(jìn)對(duì)影響因素敏感程度降低，對(duì)蛋白質(zhì)的敏感程度比以前更高。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中可以用大尺寸的試管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但是會(huì)浪費(fèi)更多的蛋白質(zhì)。色氨酸酪氨酸和半胱氨酸殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量異?；蚋呋虻停瑫?huì)各自造成或多或少的誤差。參考文獻(xiàn)Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951. Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978. Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990). Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972). 縮二脲測(cè)定蛋白質(zhì)使用注意事項(xiàng)：縮二脲法與Lowry法原理相似，但它涉及到一個(gè)單一的反應(yīng)20分鐘。很少有干擾劑（銨鹽作為一個(gè)這樣的代理）。萊恩（1957）報(bào)告指出：此方法比用洛瑞或紫外線法偏差小，但是，需要消耗更多的材料。雙縮脲是用于蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的材料中很好的一個(gè)，產(chǎn)量是沒有問題的。Bradford法更快，更敏銳。原則：在堿性條件下，含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)在反應(yīng)試劑里與銅鹽形成雜紫色。設(shè)備除了標(biāo)準(zhǔn)液的處理用品，還需要一種可見光分光光度計(jì)。在450nm區(qū)有最大的傳輸。玻璃或聚苯乙烯（便宜）試管也需要。程序試劑：雙縮脲試劑的配制：2.25克酒石酸鉀鈉（282.22），0.75克5水硫酸銅（249.68），1.25克碘化鉀（166.0），溶解在100 ml 0.2 M NaOH (40.0)。用蒸餾水稀釋至250毫升（當(dāng)然可以按需要按比例增加或減少用量）。如果有黑色沉淀物則拋棄不用。檢測(cè)在不同的檢測(cè)中，試劑樣品的量可以按體積比縮放。使用前將分光光度計(jì)預(yù)熱15分鐘。準(zhǔn)備牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，最好使用校準(zhǔn)系數(shù)在280處的吸光度和消光系數(shù)。根據(jù)已知的用9毫升試劑和1毫升樣品的敏感范圍是110mg的蛋白質(zhì)。實(shí)際的敏感范圍可能超出上限。準(zhǔn)備一個(gè)盛有1ml緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)樣品管。如果有可能的話，用緩沖液稀釋未知物至1到10毫克/毫升，須有一個(gè)稀釋范圍，如果實(shí)際濃度無(wú)法估計(jì)。每個(gè)測(cè)定管用1毫升樣品。每管加9毫升雙縮脲試劑，立刻渦流混合并靜置20分鐘。在550納米處讀數(shù)。分析準(zhǔn)備一個(gè)吸光度和微克蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（反過來也行）。從曲線上確定數(shù)值。從蛋白質(zhì)試樣的體積和稀釋倍數(shù)來確定原始試樣的濃度。評(píng)論：顏色是穩(wěn)定的，但所有的讀數(shù)應(yīng)在10分鐘內(nèi)完成。與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)一樣，這些縮二脲可縮小體積使用更小試管，消耗較少的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)含量異常高或低的氨基酸與芳香族化合物將有或高或低讀數(shù)。參考文獻(xiàn)Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949. Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957. Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940. Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269. Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946Bradford蛋白檢測(cè)使用注意事項(xiàng)Bradford蛋白檢測(cè)非?？?，和Lowry法檢測(cè)使用的蛋白質(zhì)量差不多。此方法非常準(zhǔn)確，而且超出范圍的試樣也可以在幾分鐘內(nèi)被檢測(cè)。Bradford蛋白檢測(cè)被推薦作為一般的使用，尤其是在凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量和assesing蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。試驗(yàn)材料包括顯色劑，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)， Bio-Rad公司提供的說明書。下面介紹的方法涉及到100 l的樣品和5毫升顯色劑。范圍約5到200微克蛋白，取決于燃料質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)中用5毫升實(shí)驗(yàn)室中制備的顯色劑，敏感范圍為5至接近100微克蛋白。在微測(cè)定實(shí)驗(yàn)中按比例縮小容器體積（用1 ml的小試管）。原則Coomassie Brilliant Blue G-250的酸液與蛋白質(zhì)重現(xiàn)相結(jié)合時(shí)在465 nm 到 595 nm處的最大吸光度。離子相互作用和疏水作用穩(wěn)定了染料的陰離子形式，引起了明顯的顏色變化。該實(shí)驗(yàn)方法是很有用的，因?yàn)槿玖系鞍椎膹?fù)合體的消光系數(shù)在10倍的濃度范圍內(nèi)是連續(xù)的。設(shè)備除了標(biāo)準(zhǔn)液的處理用品，還需要一種可見光分光光度計(jì)。在595nm區(qū)有最大的傳輸。位于可見光譜的邊界（沒有特種燈或需要過濾器）。玻璃或聚苯乙烯（便宜）試管可以使用，但會(huì)受到顯色劑污染，建議使用一次性試管。程序試劑：Bradford試劑：在50 ml 95%的乙醇中溶解100毫克Coomassie Brilliant Blue G-250，加100毫升85（w/v）的磷酸。稀釋至1升，當(dāng)染料完全溶解，過濾器在使用前通過Whatman #1 paper?？梢杂? M NaOH如果試樣不容易在染色劑里溶解。Bradford試劑是淺棕色的。需要反復(fù)過濾來保證試劑中除去藍(lán)色物質(zhì)。Bio-Rad的濃縮液是昂貴的，但是很多被應(yīng)用的染色劑已經(jīng)為了最大的效率而明顯的被篩選?！白灾啤彼巹┕ぷ鞯暮芎茫ǔＪ菦]有Bio-Rad的