DNA指紋圖譜技術(shù).doc

DNA指紋圖譜技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用pace等于1986年首次利用rrna基因確定環(huán)境樣品中的微生物，通過對5s rrna基因的序列分析來研究微生物的生態(tài)和進(jìn)化。該方法很快被用于微生物多樣性研究領(lǐng)域。由于5s rrna基因相對較小，攜帶信息相對較少，因而揭示微生物群落多樣性的能力有限。相比之下，隨后開展的16s rrna基因序列分析為微生物多樣性研究提供了更多信息，且效率更高。目前16s rrna基因序列分析已廣泛應(yīng)用于微生物多樣性的研究。16s rrna基因序列分析是主要基于已建立的微生物16s rrna基因序列數(shù)據(jù)庫，用以確定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并使序列探針用于識別未知菌成為可能。當(dāng)然序列探針的確定也可根據(jù)分子標(biāo)記方法，如rapd方法進(jìn)行。利用16s rrna基因序列研究微生物多樣性可采用不同的策略。目前一般常用以下幾種方法。一、變性梯度凝膠電泳（dgge）和溫度梯度凝膠電泳（tgge ）1993年muyzer等將dgge技術(shù)引入環(huán)境微生物學(xué)多樣性的研究。隨后該技術(shù)被廣泛用于比較不同生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落的多樣性及監(jiān)測特定微生物種群的動態(tài)變化，dgge和tgge的原理是根據(jù)含有不同序列的dna片段（16s rrna基因擴(kuò)增產(chǎn)物）在具有變性劑梯度或溫度梯度的凝膠上由于其解鏈行為的不同而導(dǎo)致遷移率的不同，部分解鏈的dna片段在凝膠中的遷移速率低于完全螺旋形式的dna分子，從而含有不同堿基序列的dna片段就得到有效分離。結(jié)合pcr擴(kuò)增標(biāo)記基因或其轉(zhuǎn)錄物（rrna和mrna）的dgge方法能直接顯示微生物群落中優(yōu)勢組成成分。由于它可同時對多個樣品進(jìn)行分析，使之非常適合研究微生物群落的時空變化，而且可以通過對酶切條帶進(jìn)行序列分析，或通過與獨(dú)特的探針雜交鑒定群落組成，可以方便地了解環(huán)境被干擾后的微生物群落變化或某種指示微生物的命運(yùn)。oliver等用dgge方法考察了農(nóng)田微生物的變化情況，認(rèn)為環(huán)境變化對農(nóng)田微生物的多樣性有很大影響。但是dgge/tgge技術(shù)也存在一定的局限性。其缺陷之一是只能分離約500 bp大小的dna片段，這限制了作為下一步用于雜交分析的探針設(shè)計(jì)。并且研究報道有些種類細(xì)菌16s rdna在dgge上不只顯示1條帶，而不同種細(xì)菌的16s rdna序列在dgge上也可能因?yàn)榫哂邢嗤慕怄溞袨槎荒鼙环珠_。即便存在以上的一些局限性，dgge/tgge仍是分析微生物群落多樣性較為敏感的方法之一。二、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（sscp）sscp是對16s rrna基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析的另一種簡便有效的方法。該技術(shù)最初用來檢測人類dna的基因多態(tài)性，lee等在1996年首次報道將sscp技術(shù)應(yīng)用到環(huán)境樣品微生物群體多樣性分析。不同堿基序列的單鏈dna分子構(gòu)象不同，dna片段變性成單鏈后受到凝膠不同分子篩作用力最終使不同dna片段得到分離。電泳結(jié)束后可以將不同的條帶切下并測序，或采用特異性探針進(jìn)行雜交，進(jìn)而顯示該特定微生物類群的動態(tài)變化。holly等利用sscp技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)在植物根際土壤中大量存在古菌crenarchaeot，該類微生物以往一直被認(rèn)為只存在于極端嗜熱環(huán)境當(dāng)中。但是sscp技術(shù)重現(xiàn)性較差，易受膠濃度和電泳溫度等條件的影響。另外，sscp能夠有效分離的dna序列過短，為150-400 bp。三、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性dna（rapd ）由williams建立的rapd技術(shù)，因具有操作簡便、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)以隨機(jī)寡核苷酸（5-10 nt）作為引物，擴(kuò)增得到的多態(tài)性片段較短，更方便檢測兩個同源或異源等位基因的有無，適用于種內(nèi)和亞種更為細(xì)致的分類。張巒等在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，采用rapd分子標(biāo)記技術(shù)研究了重金屬鎘和多環(huán)芳烴菲復(fù)合污染對土壤中微生物群落dna序列多樣性的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)15 d和30 d后，鎘-菲單一和復(fù)合污染均導(dǎo)致土壤微生物群落dna序列的豐度、均度和多樣性指數(shù)增加。重復(fù)性不好是該技術(shù)存在的主要問題，而dna模板的質(zhì)量與數(shù)量、mgcl2和引物濃度的變化都有可能導(dǎo)致得到不同的圖譜。另外，從條帶圖譜中無法得到任何微生物系統(tǒng)發(fā)育信息。四、限制性片段長度多態(tài)性（rflp ） 和擴(kuò)增核糖體dna限制性分析rflp方法和ardra方法也常用于微生物群落的分析。通常用引物pcr擴(kuò)增得到16s rdna片段，被限制酶切割，然后再進(jìn)行電泳形成不同長度的片斷進(jìn)行分析。其所獲得的譜帶更為簡單，易于分析，不受菌株是否純培養(yǎng)的限制，不受宿主的干擾，具有特異性強(qiáng)，效率高的特點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于新物種的發(fā)現(xiàn)、微生物分類及鑒定、共生菌、病原菌的微生物遺傳多樣性的檢測等。后來有人利用ardra方法考察兩種不同農(nóng)田土壤的微生物群落時，發(fā)現(xiàn)兩者無顯著差異。張于光等利用rflp方法對三江源地區(qū)不同的植物類型的土壤中固氮微生物群組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)所有土壤樣品中分別具有1-2個優(yōu)勢微生物種群。但是該技術(shù)所能獲得的信息量相對較少，并且難以用來評估物種的豐度和均度。五、末端限制性片段長度多態(tài)性（t-rflp ）t-rflp是rflp/ardra方法的進(jìn)一步發(fā)展，所不同的是在pcr擴(kuò)增16s rrna基因過程中，其中一個引物用熒光標(biāo)記，在計(jì)算機(jī)程序自動分析時僅分析熒光標(biāo)記的末端限制片段，這樣使得限制片段長度多態(tài)性圖譜更為簡化，并且每個可見的條帶都代表一個“核型”或一個分類單元。此法能夠得到一個群落的特征指紋圖譜，可用于比較不同群落的相似性和由于污染造成的群落結(jié)構(gòu)在時間和空間上的改變。pett等利用t-rflp技術(shù)考察氧化還原電位對土壤菌群的影響，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4 d的好氧/厭氧處理與未處理的土壤樣品菌群結(jié)構(gòu)相似，而經(jīng)過持續(xù)12 h的厭氧或好氧處理的土壤樣品得到的分子條帶則明顯不同，在所有樣品的179種條帶圖譜中只有3種是普遍存在的，同時還發(fā)現(xiàn)土著菌群對氧化還原電位的變化具有耐受性。c