PCR引物的設計原則.doc

PCR引物的設計原則： 引物應用核酸系列保守區(qū)內設計并具有特異性。 產物不能形成二級結構。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性 引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。2.避開產物的二級結構區(qū) 某些引物無效的主要原因是引物重復區(qū)DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區(qū)域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。3.長度 寡核苷酸引物長度為1530bp，一般為1827mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因為38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74),不能保證產物的特異性。4.G+C含量 G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.堿基隨機分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6.引物自身 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結構引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。7.引物之間 兩引物之間不應具有互補性，尤應避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話，應盡量使其G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。8.引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3端不能發(fā)生錯配。 在標準PCR反應體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四種dNTP各200mol/L）以質粒（103拷貝）為模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯配對擴增產物的影響是有一定規(guī)律的。AA錯配使產量下降至1/20，AG和CC錯配下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。9.引物的5端 引物的5端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。10.密碼子的簡并 如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。11. 引物3端不能選擇A，最好選擇T。 引物3端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。12. 引物5 端和中間G值應該相對較高，而3 端G值較低。 G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用5 端和中間G值相對較高，而3 端G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA 聚合反應。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進行分析）13. 引物應具有特異性。 引物設計完成以后，應該對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。關于BLAST（使用方法以后將會講解）的作用應該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設計的這個引物，在已經發(fā)現(xiàn)并在GENBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那么這個引物的特異性就很差，