新型液相微萃取結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定尿樣中的利多卡因.doc

新型液相微萃取結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定尿樣中的利多卡因 任貽軍，張紅琳，高逢喜（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院藥劑科,湖北荊州）摘要應(yīng)用新型液相微萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)快速分析尿樣中的利多卡因?？疾炝溯腿?、體積、萃取時(shí)間、pH 值及鹽效應(yīng)對(duì)液相微萃取的影響,建立了液相微萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)分析尿樣中利多卡因的方法。在優(yōu)化條件下,對(duì)濃度從0.02到2.0mg/L的利多卡因標(biāo)準(zhǔn)溶液系列萃取后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,利多卡因的色譜峰面積在所測(cè)濃度范圍內(nèi)與濃度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y = 365.2x + 4.962,相關(guān)系數(shù)為0.999，檢出限為0.01mg/L，RSD小于4.4%(n=5)。樣品回收率為106.1%。通過液相微萃取后,能有效地去除尿樣中的干擾物質(zhì),獲得了較高的選擇性。該方法簡(jiǎn)單、方便、靈敏、消耗有機(jī)溶劑少,是尿樣中利多卡因檢測(cè)的一種有效方法。關(guān)鍵詞利多卡因,液相微萃取,試劑管，高效液相色譜1 引言高效液相色譜（HPLC）常用于生物樣品中藥物有效濃度的檢測(cè)，但生物樣品組分復(fù)雜，內(nèi)源性干擾物質(zhì)多，樣品不適應(yīng)直接進(jìn)樣分析。需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚?。常用的前處理方法主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取等?996 年Cantwell 等提出了液相微萃取(L PME) 技術(shù)1 ,因其萃取效率高、消耗有機(jī)溶劑少,且具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn),近幾年發(fā)展迅速,主要用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，食品分析，生物樣品中的藥物檢測(cè)等。利多卡因(lidocaine)是臨床應(yīng)用較廣的酰胺類局部麻醉藥物之一,其有效濃度范圍為15 mg/L 。當(dāng)血藥濃度超過5 mg/L 時(shí)可發(fā)生驚厥等毒性反應(yīng),低于約用量的10 %以原形隨尿排出。因此,監(jiān)測(cè)尿液中利多卡因的含量對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥和減少毒副反應(yīng)有重要意義。對(duì)生物樣品中利多卡因濃度檢測(cè)常用的前處理方法有液液萃取2、固相萃取3、液相微萃取4等。液液萃取、固相萃取有操作繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，大量消耗有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的液相微萃取液滴不穩(wěn)定，在萃取過程中容易從針尖上掉落。本文用試劑管做支撐，建立了一種新的液相微萃取技術(shù)結(jié)合HPLC方法直接檢測(cè)尿樣中利多卡因，利用該技術(shù)處理尿樣后不僅可以消除干擾,同時(shí)對(duì)利多卡因進(jìn)行了富集,該方法具有操作簡(jiǎn)單，方便，靈敏度高，穩(wěn)定性好以及消耗有機(jī)溶劑少等優(yōu)點(diǎn)。2 實(shí)驗(yàn)部分2. 1 儀器與試劑安捷倫高效液相色譜系統(tǒng) ,由G1379A在線脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1314AVWD檢測(cè)器、G1316A柱溫箱、7725手動(dòng)進(jìn)樣閥、25L微量進(jìn)樣器組成。鹽酸利多卡因注射液(泗水希爾康制藥有限公司),乙腈為色譜純,其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。2. 2 色譜條件色譜柱: Venusil,XBP-C18 柱(5m ,250 mm 4. 6 mm i. d. ),檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,進(jìn)樣量20L。流動(dòng)相:乙腈：0. 01 mol/ L磷酸二氫鉀（以磷酸調(diào)pH為3.5）（27.3：72.7）。2. 3 萃取方法在抗生素藥瓶中加入攪拌磁子和8mL 、pH為11.0的樣品溶液,用25L微量進(jìn)樣器抽取20L有機(jī)溶劑放入試劑管,再將試劑管用樣品溶液封蓋，放入藥瓶中，密封。溶液攪拌速度為800轉(zhuǎn)/分,萃取50min后,用進(jìn)樣器吸取有機(jī)溶劑直接進(jìn)樣分析。3 結(jié)果與討論3. 1 萃取溶劑的選擇本試驗(yàn)考察了9種有機(jī)溶劑,從水溶性和液滴的穩(wěn)定性兩方面考慮選取萃取劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)N,N二甲酰胺,正辛醇，正庚烷的密度比水小不易操作；鄰苯二甲酸二丁酯的粘度大，用進(jìn)樣器吸取不方便。通過考察二氯甲烷，環(huán)氧氯丙烷，四氯化碳，甲苯，氯仿的萃取效果,發(fā)現(xiàn)四氯化碳萃取后的峰面積最大。因此,四氯化碳被選為萃取溶劑。3. 2 溶劑體積對(duì)萃取效果的影響不同體積的四氯化碳萃取20分鐘后進(jìn)樣分析,結(jié)果顯示,萃取后利多卡因的峰面積隨液滴體積的增大而增大。由于受20uL定量環(huán)的限制，本試驗(yàn)萃取劑體積選用20uL.3. 3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響LPME是一個(gè)樣品的富集平衡過程,萃取時(shí)間是非常重要的影響因素。本實(shí)驗(yàn)研究了萃取時(shí)間對(duì)利多卡因萃取的影響,結(jié)果顯示,萃取后利多卡因的峰面積隨萃取時(shí)間開始迅速增大,隨后增大趨勢(shì)減緩，80分鐘后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),峰面積還在上升?？紤]到萃取時(shí)間的選擇既要保證較高的靈敏度又要節(jié)約時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)的萃取時(shí)間選擇為50分鐘。3. 4 pH值對(duì)萃取效果的影響利多卡因是堿性藥物,pa 值為7. 9 。在溶液pH 值高于pKa 值時(shí),利多卡因會(huì)以中性分子的形式被萃取到有機(jī)液滴中。本實(shí)驗(yàn)研究了溶液pH 值對(duì)萃取效果的影響,結(jié)果表明,隨著料液pH 值的升高,利多卡因的萃取效率先增加后減少,當(dāng)pH 值為11. 0時(shí)萃取效率最大。3. 5 方法的線性范圍、檢出限和精密度在優(yōu)化條件下,對(duì)濃度從0.02到2.0mg/L的利多卡因標(biāo)準(zhǔn)溶液系列萃取后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,利多卡因的色譜峰面積在所測(cè)濃度范圍內(nèi)與濃度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y = 365.2x + 4.962,相關(guān)系數(shù)為0.999, 檢出限為0.01mg/L , RSD小于4.4%(n = 5) 。3. 6 實(shí)際尿樣的檢測(cè)取病人使用利多卡因5小時(shí)后的尿樣4mL，用4mL去離子水稀釋，1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為11，用四氯化碳萃取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該LPME 技術(shù)可以選擇性地、高效地富集尿樣中的利多卡因。測(cè)得樣品的回收率為106.1%。參考文獻(xiàn)：1 M.A.Jeannot,F.Cantwell. Anal.Chem. 68(1996)2236.2 A.S.Gross,A.Nicolay,A.Eschalier. J.Chromatogr.B 728(1999)107.3 L. Kang, H.W. Jun, J.W. McCall. J.Pharm.Biomed.Anal.19(1999)737.4 M.Ma,S.Y.Kang,Q.Zhao,B.Chen,S.Z.Yao. J.Pharm.Biomed.Anal.40(2006)128.A new liquid phase micro-extraction method coupled with HPLC for the determination of lidocaine in human urine Ren yi-jun, Zhang hong-lin，Gao feng-xi (Jingzhou hospital, Tongji medical college, Huazhong university of science and technology, jingzhou 434020, china) Abstract A method for determining lidocaine in human urine using a new single-drop LPME based on PCR tube in conjunction with HPLC-UV detection was developed. There are several parameters which determine the mass transfer such as the extraction solvent, drop and sample volumes, extraction time , pH and ionic strength, stirring rate . These parameters were chosen to optimize the performance in the current study. The method was validated with respect to precision, accuracy and specificity. The respective inter-day precision values were calculated to be below 4.4 %. The mean absolute recovery was 106.1%. The calibration graphs obtained by plotting the peak-height ratios against the concentrations of lidocaine added to the blank plasma were highly linear over the range 0.02-2.0mg/L, and the correlation coefficient for each calibration graph invariably exceeded 0.999. The mean regression equation is y=365.2x+4.962, where y is the concentration of lidocaine in human urine, and x is the peak area. The detection limits in urine were