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文獻翻譯 養(yǎng)殖環(huán)境對人工養(yǎng)殖真鯛脅迫反應的影響 作者： J. Rotllant, L. Tort, D. Monteroc, et al. 翻譯人：水產(chǎn)072 0740430214 劉兆宇摘要:將真鯛分別于白色、灰色和黑色玻璃缸中放置飼養(yǎng)2周。然后白色和黑色缸中的真鯛經(jīng)過擁擠脅迫。第2、9、16和23天分別取血樣，測定血漿可的松、促黑激素和葡萄糖含量，并與不擁擠的（對照組）白色和黑色缸中數(shù)值做對比。結果顯示：白色、灰色和黑色缸中無擁擠脅迫的真鯛可的松值和促黑激素值無顯著性差異，而背景顏色則顯著影響了對促黑激素和促腎上腺皮質激素的體外腎間組織敏感度，黑色缸中真鯛腎間細胞對這兩種促激素幾乎無反應；黑色缸中的擁擠真鯛2天后血漿可的松值顯著升高后恢復正常，而白色缸中擁擠的真鯛血漿可的松升高值相對較低但整個實驗中一直保持該值未恢復；血漿促黑激素在擁擠脅迫下23天內逐步升高，升高程度受養(yǎng)殖背景影響，在白色缸中升高更為明顯。因此，白色養(yǎng)殖環(huán)境中的真鯛似乎能夠減輕脅迫反應，長期養(yǎng)殖下更為明顯。關鍵詞：真鯛；脅迫；擁擠；背景顏色；可的松；促黑激素；血糖1.介紹一般來說，脅迫反應是生物系統(tǒng)對多種不利刺激（成為脅迫因素）的反應。脊柱動物脅迫反應包括許多生理過程，主要通過神經(jīng)-內分泌系統(tǒng)即下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPI）控制，硬骨魚類的HPI即為下丘腦-垂體-腎間組織，最重要的激素包括促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）,促腎上腺皮質激素（ACTH）和可的松。除了促腎上腺皮質激素（ACTH）,其他激素如促黑激素（a-MSH）、生長激素（GH）、催產(chǎn)素、兒茶酚胺也能直接或間接刺激可的松的分泌?？傻乃勺鳛镠PI軸的終產(chǎn)物發(fā)揮多種生理作用。一個用來研究神經(jīng)內分泌聯(lián)系的著名例子是被稱為背景適應的方法。低等脊柱動物（例如硬骨魚和兩棲動物）調整自身皮膚的顏色以適應生活環(huán)境顏色或反射性的變化。控制顏色變化的激素包括由腦垂體分泌的兩類縮氨酸激素，即促黑激素（a-MSH）和黑色素濃縮激素（MCH）.促黑激素由于其促黑作用被廣泛了解。當動物處于黑暗環(huán)境中時，促黑激素細胞被激活，釋放到血液中的促黑激素升高，引起皮膚真皮部的載黑素細胞中色素散布。放置動物于白色背景中，由于促黑激素（a-MSH）釋放的抑制和黑色素濃縮激素釋放（MCH）的增加會引起皮膚中色素的集中和濃縮。有趣的是，在虹鱒魚的實驗結果表明白色缸和黑色缸中虹鱒魚的HPI軸脅迫反應靈敏度不同，被認為是促黑激素受HPI軸控制的證據(jù)，同時也是另一個系統(tǒng)涉及的證據(jù)，尤其是精氨酸類加壓催產(chǎn)素系統(tǒng)。而且，魚類皮膚變黑似乎與脅迫有關。真鯛屬硬骨魚類鯛科，地中海地區(qū)傳統(tǒng)食用對象。作為該地區(qū)新興的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，關于其養(yǎng)殖條件和脅迫反應的知識欠缺卻急需。尤其是HPI軸活動的控制和體色變化的控制之間的相互作用產(chǎn)生了興趣，因為這種魚在養(yǎng)殖條件下皮膚會顯著變黑。人工養(yǎng)殖的鯛科魚類比野生魚類黑的多，而其他養(yǎng)殖魚種如黑鱸和烏頰魚在相同條件下（飼喂相同商業(yè)魚類飼料和在相同養(yǎng)殖設備中飼養(yǎng)），與野生魚種顏色差異不明顯。這種現(xiàn)象在該魚種的傳統(tǒng)養(yǎng)殖地區(qū)產(chǎn)生了一些商業(yè)問題。這種顯示群體行為的黑化是光感受的變化還是這些養(yǎng)殖條件下的感知變化尚有待確定。實際上，其他鯛科魚類如海鯛當受到脅迫時表現(xiàn)出更黑的體色，顯示出特征性的垂直條紋。我們實驗室之前一個研究表明真鯛易受擁擠脅迫，高密度條件下飼養(yǎng)23天的真鯛可的松水平不斷上升可以證明。真鯛脅迫反應和顏色適應之間的關系再無其他可得數(shù)據(jù)。這項研究的目的是：1，證明該種是否能夠對環(huán)境背景調整產(chǎn)生的光條件調節(jié)皮膚顏色；2，探究放置于白色和黑色背景中的真鯛在脅迫反應中的不同；3，研究HPI軸中調節(jié)因子在這些適應過程中的作用。2.材料和方法2.1 實驗動物性別未分化的真鯛，體重80-120g，從兩個實驗魚養(yǎng)殖中心（克里特島海水生物協(xié)會和ICCM）獲得。實驗養(yǎng)殖環(huán)境：光照14h，鹽度3738，水溫16-19,。以4 kg/m的密度養(yǎng)殖在充氣良好的5000l海水容器中（黑色背景）。養(yǎng)殖用水不斷更新（250 l/h）并通過氣石充氣。每天通過自動投餌機投喂商業(yè)干飼料顆粒。2.2 實驗I：養(yǎng)殖背景適應該實驗在ICCM進行，45尾真鯛（體重10014 g）放置于三個不同顏色背景缸中（白色、灰色和黑色），每缸15尾，密度10kg/m。15天適應后，停食24小時，迅速取出并浸與0.033% v/v 的Ethylenglycolmonophenilether該麻醉劑中；用注射器尾部靜脈取血樣，共3分鐘內完成。血樣立即1000g離心10min，血漿-20下保存。白色和黑色缸中真鯛取頭腎并冷卻處理。不同真鯛拍照。2.3 實驗II：擁擠和背景顏色影響該實驗在IMBC進行，共276尾真鯛，體重9012g，分于8個500l實驗海水缸中，4白（W）4黑（B），對照組密度10kg/m（2B,2W）,每缸23尾，擁擠組（2B,2W）每缸46尾（20 kg/m）.第2、9、16、23天，每缸中5尾取出取樣，每個樣本點得到10尾對照和擁擠的真鯛。這樣情況下，養(yǎng)殖缸隨機取樣。每次取樣后調整缸中水位以保證密度恒定。每次取樣前停食24小時。取樣如前述。2.4 體外灌流頭腎（實驗I，每組12尾）取樣后迅速分離，每尾魚頭腎的兩個部分分別放置在灌流儀中用緩沖羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液（羥乙基哌嗪乙硫磺酸15 mM; pH 7.38）灌流，溶液包含NaCl (171 mM), KCl (2 mM), CaCl2 2H2O (2 mM), 0.25% (w/v)葡萄糖和0.03% (w/v)的牛血清白蛋白。該液體介質以75 ul/min的速度通過灌流儀的多管蠕動泵。之前一些其他魚種的結果表明灌流三小時后可的松的釋放基本達到基礎穩(wěn)定水平。因此，3小時左右后，用促黑激素（a-MSH）刺激組織，8小時后20分鐘內用六個濃度的促腎上腺皮質激素（ACTH）中一個刺激組織，兩種激素的濃度對每個樣品都隨機。對于每個孵化期，由于兩種激素作用釋放的最大可的松量通過基礎釋放量的百分比增長表現(xiàn)出來。2.5 生化分析血漿可的松的測定通過已確定的有效的放射免疫法（RIA）進行。促黑激素（a-MSH）的放射免疫法（RIA）基于Van Zoest等人描述的抗體，它與脫分子的、純的或二乙?；〈拇俸诩に兀╝-MSH）的交叉反應性都為100%。為了驗證真鯛促黑激素的測定實驗，測定了標準曲線和血漿系列稀釋濃度之間的平行性（數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)）。測定極限為每管1.6 pg，組內和組間變異系數(shù)分別為3.1和5.2。而且促黑激素（a-MSH）的放射免疫法（RIA）之間已經(jīng)被證實能夠測定許多硬骨魚類組織中所有二乙酰化的激素。血漿葡萄糖通過基于葡萄糖氧化酶的商業(yè)比色試劑盒測定。2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果采用平均值標準差表示，采用SPSS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。三重變量分析（密度、時間、背景顏色）以檢測結果。但有明顯影響時，同組能采用單一變量，SNK檢測以評價不同組間可能的差異。當各組基本不均勻時，采用MannWhitney和KruskalWallis檢測，顯著性水平為0.05。.3 結果3.1實驗1 背景顏色適應 圖1顯示了真鯛在白色和黑色養(yǎng)殖環(huán)境背景中適應15天后的結果。黑色素主要集中在真鯛背部，頭部和鰭。白色、灰色和黑色缸中無脅迫的真鯛血漿可的松和促黑激素測量值之間無顯著性差異（表1）。白色缸中真鯛腎間組織中受促黑激素和促腎上腺皮質激素刺激的可的松釋放量與使用濃度相關（圖2A,B），黑色缸中 真鯛腎間組織明顯對促腎上腺皮質激素（圖2A）和促黑激素（圖2B）相對不敏感。白色缸和黑色缸中未經(jīng)刺激的基礎可的松釋放量間無顯著性差異（數(shù)據(jù)未顯示）。白色缸中真鯛反應的半數(shù)有效值促黑激素總計210-8M，促腎上腺皮質激素總計1.310-9. 3.2 實驗2 擁擠脅迫和背景顏色的作用 根據(jù)實驗樣品，背景顏色和擁擠脅迫都引起血漿可的松數(shù)值的明顯變化。白色缸對照組中真鯛的血漿可的松至第16天都無變化，但第23天后數(shù)值相比第2天的測量值升高。相反，黑色缸中對照組一直沒有變化。（圖3A） 黑色缸中擁擠脅迫引起血漿可的松的短暫上升。擁擠2天后，血漿可的松上升到62.714.6ng/ml，無脅迫組為4.81.5 ng/ml（p 0.01）。之后可的松水平下降但仍比無脅迫組值高。白色缸中真鯛可的松水平2天后也上升，且實驗期間一直維持在較高水平，結果，23天后白色缸中真鯛的可的松水平比相對地黑色缸中真鯛可的松水平高。 至于血漿促黑激素水平，直到實驗16天不論白色缸還是黑色缸中擁擠或不擁擠的真鯛之間無顯著性差異（圖3A,B）。而白色缸中擁擠組在第23天促黑激素水平比不擁擠的對照組高（p 0.05），比黑色缸中擁擠組也高。 葡萄糖值對于擁擠脅迫和背景顏色也有差異（圖3A,B），黑色缸中擁擠組第9天后葡萄糖值相比對應不擁擠組短暫上升，但如可的松水平一樣，白色缸中真鯛血漿葡萄糖水平不平穩(wěn)。23天擁擠后，白色缸中真鯛血漿葡萄糖水平高于黑色缸。4.討論 該項研究中真鯛來自兩個不同地區(qū)（亞特蘭大和地中海東岸），不同的基礎促黑激素水平是意料之中，原因不得而知，可能與這兩個實驗中唯一的不同有關：由于位置不同，對照密度下的白色缸中的真鯛血漿可的松水平高于黑色缸（亞特蘭大，15d）,或低于黑色缸（地中海，16d）?；蛘呤?，這種差異可能與實驗中應用的順序抽樣方法有關。明顯的是，白色缸中擁擠真鯛的血漿可的松顯著的高可能與不同組真鯛腎間可的松產(chǎn)生細胞的促生素反應性之間顯著不同有關。灌流實驗表明在適應黑色背景15后促黑激素和促腎上腺皮質激素的刺激活性基本消失。種間體外腎間組織對這兩種激素的敏感性比較表明促腎上腺皮質激素的反應性與已報道的鮭鱒魚的半數(shù)有效值0.810-9M和羅非魚的0.910-9非常相近。相反，促黑激素的半數(shù)有效值則比羅非魚的（1.110-7）相對要高.這種差異是因為種間相關性還是二乙?；俸诩に氐氖褂没蛘呤丘B(yǎng)殖條件下種的差異還有待商榷。有趣的是，真鯛腎間組織相對較高的促黑激素反應性不僅體現(xiàn)在半數(shù)有效濃度上，在所獲得的促腎上腺皮質激素和促黑激素劑量反應曲線的相似最大刺激表現(xiàn)更為明顯，這表明兩種促激素通過相同的受體機制，至少對真鯛來說是這樣。結果顯示腎間組織促激素靈敏性的下降在黑色環(huán)境中飼養(yǎng)15天的真鯛上發(fā)生，在白色背景中的真鯛則有升高，對促腎上腺皮質激素來說尤其明顯。至于所涉及的機制，在灌流實驗中白色缸和黑色缸中真鯛血漿促黑激素和可的松水平的相似性排除了拮抗和反饋的可能。這也許也說明了促腎上腺皮質激素靈敏性的下降，并且有證據(jù)有效表明未脅迫的白色適應和黑色適應魚類有相同的血漿促腎上腺皮質激素水平。在如鮭鱒類得種類中，垂體的黑促素細胞通過快速分泌行為的變化響應背景顏色的變化，在黑色背景環(huán)境中更為活躍。其他硬骨魚類黑促素細胞不能對背景顏色的變化產(chǎn)生任何明顯的細胞反應，例如瑪麗魚和鲇魚。這些研究人員認為，在這些魚種中，生理顏色變化并不依賴與血漿促黑激素濃度的變化。顯然，真鯛是這些魚種的一個， 它們調節(jié)身體顏色以響應環(huán)境顏色的變化，但這種調整不涉及循環(huán)系統(tǒng)中促黑激素水平的相應變化。相反的，在白色背景中所觀察到的血漿促黑激素高水平與已改變的體色不一致。其他魚種的類似差異被認為是促黑激素可能有其他作用而非體色調節(jié)的證據(jù)，例如，參與內分泌應激反應。所得數(shù)據(jù)與Balm等人和Lamers等人對羅非魚的研究結果一致，對于真鯛和羅非魚，促黑激素的效能低于促腎上腺皮質激素，但人們認為魚類需要促黑激素的這種作用以調整在一些如PH處理等長期脅迫中可的松的超高水平。盡管涉及機制有待解決，但白色背景和黑色背景中血漿葡萄糖，促黑激素和可的松水平的差異表明背景顏色確實影響真鯛對擁擠脅迫的反應。黑色缸中對照組真鯛血漿可的松水平與之前非脅迫的鯛科魚類測定結果相一致，這表明我們進行的擁擠脅迫研究屬于適度脅迫。真鯛進行擁擠脅迫后最明顯的影響是第2天的可的松和第9天的葡萄糖。之后，恢復過程非常明顯，黑色擁擠缸中真鯛的可的松和葡萄糖水平都有下降。相反，白色缸中擁擠組真鯛在第2天可的松的上升低于黑色擁擠組，但是可的松水平不像黑色組那樣會下降。因此，這表明白色背景中擁擠組對擁擠的適應沒有發(fā)生。23天后白色擁擠組和黑色擁擠組在血漿可的松、促黑激素和葡萄糖水平之間的一致差異表明具有促腎上腺皮質激素作用的縮氨酸在可的松的分泌和而后中間新陳代謝的作用。目前研究已經(jīng)確認了由如群體相互作用等脅迫條件所激活的神經(jīng)內分泌系統(tǒng)之間的相互作用關系，這些在背景適應中都有涉及。鮭鱒類血漿促腎上腺皮質激素和可的松水平的上升表明對于黑色背景的適應能夠促進內分泌應激反應。其中涉及的激素可能包括黑色素集中激素（MCH）,一種由促黑激素控制的神經(jīng)垂體多肽類激素，黑色素集中激素在黑色適應魚類中的分泌明顯低于白色適應的魚類，黑色素集中激素可能是一種涉及調整脅迫和背景顏色反應的激素。白色缸中真鯛對擁擠初期的低可的松水平反應可能證實了之前鮭鱒魚類的研究結果，更長的處理時間會產(chǎn)生明顯的對比效果。因此，該研究表明HPI軸與HP-載黑素細胞軸之間的相互作用可能并不僅僅取決于已被證明的脅迫的性質，還有可能取決于處理時間的長短。這些考慮對水產(chǎn)養(yǎng)殖實際應用方面有重大作用。我們關于真鯛的實驗結果表明要盡量避免白色養(yǎng)殖背景，特別是在高密度養(yǎng)殖的情況下，因為這會干擾持續(xù)脅迫條件下HPI軸正常活動的控制，從而會增加慢性脅迫對行為方面、新陳代謝方面和免疫方面的危害。感謝 這項研究工作由歐盟支持，授權號Q5RS2000-31629，J. Rotllant從葡萄牙獲得授權。參考文獻:1Arends, R.J., Rotllant, J., Metz, J.R., Mancera, J.M., Wendelaar Bonga, S.E., Flick, G., 2000. a-MSH acetylationin the pituitary gland of the sea bream (Sparus aurata L.) in response to different backgrounds, confinement and air exposure. J. Endocrinol. 166, 427 435.2Baker, B.I., 1963. Effect of adaptation to black and white backgrounds on the teleost pituitary. Nature 198, 404.3Baker, B.I., Ball, J.N., 1970. Background adaptation and the teleost pituitary. J. Endocrinol. 48, 26 27.4Baker, B.I., Race, T.A., 1981. Difference in concentrations of plasma cortisol in the trout and the eel following adaptation to black or white backgrounds. J. Endocrinol. 89, 135 140.5Baker, B.I., Bird, D.J., Buckingham, J.C., 1985. Salmonid melanin-concentrating hormone inhibits corticotrophin release. J. Endocrinol. 106, R5R8.6Ball, J.N., Batten, T.F.C., 1981. Pituitary and melanophore responses to background in Poecilia latipinna (Teleostei): role of the pars intermedia PAS cells. 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