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VYSIS說明書試驗程序原理 21 黃 Y 黃 X 綠在原位雜交X綠光探針centromerregion是一種在一個細胞標本里能看見特定的核酸序列(尤其是DNA)的技術， (FISH) 包括精確的單股熒光標記DNA探針的退火 與目的基因互補. 探針熒光的DNA 位點能通過直接的檢測用熒光顯微鏡看到。羊水標本包括間期細胞用標準的細胞遺傳學方法附著在玻片上。樣本標本DNA變性，然后與 CEP x/y and LSI 21 探針雜交。在雜交后，多余的和未結(jié)合的探針被一系列洗滌所除掉。 染色體和核DNA用特殊的染料被復染，復染劑 DAP發(fā)藍光. 用裝上適合的激動劑與發(fā)射濾器的熒光顯微鏡觀察 CEP X/Y 和 LSI 21 DNA 探針雜交，能看到強烈的橘黃光和綠色的熒光信號和藍色的復染核。 通過顯微鏡檢查 21 X, and Y染色體點計，熒光染色區(qū)域明亮地突出于核的DNA普通的藍色熒光(通過DAPI復染) . FISH 程序能使核的 21,X,and Y染色體點計可見。CEP X/Y DNA 探針是一種綠光和橘黃光混合物，直接標記熒光的DNA探針，分別在X和Y染色體的DXZ1 和DYZ3 區(qū)。LSI 21 DNA 探針是一種橘黃色光直接標記的熒光DNA 探針，包含特異性 DNA 序列對應位于21號染色體21q22.13 到 21q22.2 區(qū)的D21S259 和D21S342 基因座.所有探針混合物都在雜交緩沖液中經(jīng)過了預變性以便于應用。本試驗設計目的是用熒光原位雜交法探測和量化21,X,and Y染色體 。 試劑和儀器提供的材料本試劑盒包括四種試劑，夠約20次測試。 成分組成容量 儲藏LSI 21 DNA 探針:E.coli大腸桿菌質(zhì)粒 (探針經(jīng)過預變性 )橘黃光標記DNA 探針與阻斷DNA 和雜交緩沖液預混合（右旋糖酐硫酸鹽,甲酰胺， SSC）200ul/ 小瓶(10ng/ul)-20 避光CEP X/Y DNA 探針(探針經(jīng)過預變性 )綠光熒光標記X探針和橘黃光標記Y 探針，與阻斷DNA 和雜交緩沖液預混合 （右旋糖酐硫酸鹽,甲酰胺，SSC）200ul/小瓶（15ng/ul20避光DAPI II復染劑125ng/Ml DAPI在 苯二胺 二氫氯化物, ,甘油 和緩沖液中600ul/1小瓶-20避光NP-40去離子去污劑4ml/ 2小瓶20到2520x SSC氯化鈉和檸檬酸鈉66g/ 1包裝同上探針對照玻片男性，羊水細胞（正常） 固定的生物標本 得自正常男性羊水細胞加于玻璃顯微鏡玻片 5 片(10靶區(qū))20 干燥產(chǎn)前篩查陽性探針對照玻片。 固定的生物標本 得自人成纖維細胞系加于玻璃顯微鏡玻片5slides（10靶區(qū)）同上儲存和處理儲存未開封的試劑盒做為一個整體在 -20 避光，避濕 . 20 x SSC 應單獨儲存于室溫。儲存探針對照玻片在一個密封的容器中在-20，應用干燥劑防潮. 每一個未開封的試劑盒成分的失效日期標于獨立的標簽上。這些儲存條件適用于所有開封及未開封的組成部分。 需要但未提供的材料實驗室試劑超純甲酰胺儲存于 +4 至多一個月（從收到起，具體看制造商的建議的詳細信息）濃縮鹽酸(12N) HCL1N 氫氧化鈉純凈水(蒸餾或去離子的or Milli-Q). 儲存于室溫中carmoys 固定劑 (3:1 甲醇:醋酸)drierite干燥劑1x 胰蛋白酶 /EDTA (0.05% 胰蛋白酶,0.53Mm EDTA -4Na 于 Hanks 平衡鹽溶液中without Cacl2,Mgcl2.6H2O and M gSO4-7H2O)0.56%氯化鉀實驗室器械熒光顯微鏡（裝備建議的濾光器） 定相對照光學顯微鏡預先清潔的顯微鏡玻片玻片加溫器(45 -50 ) 22mm x22mm玻璃蓋玻片 (1-10ul)微升消毒槍頭聚丙烯微離心管(0.5ml or 1.5ml) 定時器磁力攪拌器 渦流微離心機 量筒水浴(672 和731)空氣孵化器恒溫箱(37)菱形頭劃線器濕室 鉗子（鑷子）無菌注射器(5ml)Coplin 缸(6) 建議型號 :wheaton 產(chǎn)品.No.900620 垂直染缸PH 計和 PH 試紙校準的溫度計金屬試管架橡膠粘固劑0.45um 孔過濾器顯微鏡器材和濾光器顯微鏡 : 需要epi- 照明熒光顯微鏡觀察熒光 ,應該檢查以確定正確操作一臺顯微鏡判斷適合的普通DNA 染色，如 DAPI propidium lodide, and 阿的平可能不適合FISH , 應該常規(guī)顯微鏡清潔和制造商的技術顧問做定期的調(diào)整。注意: 通常 ,推測的試劑失敗在一次原位試驗中可能實際為熒光顯微鏡功能失?；蛭催_最佳標準或者是應用了不正確的濾光器設置去看一個成功的雜交試驗。 激發(fā)光源: 激發(fā)燈是激發(fā)熒光團為熒光的光源. 除非激發(fā)燈正確排列，否則最適宜的圖象不會產(chǎn)生。對于CEP and LSI探針100瓦的水銀燈是建議的激發(fā)光源. 燈的建議最長使用時間是200小時。記錄燈泡的使用小時數(shù)，在超過額定的小時數(shù)以前更換。 物鏡: 物鏡的選擇在亮度、分辨度、圖象的綜合質(zhì)量上有很大的影響， 當使用100瓦的水銀燈去看CEP 測定結(jié)果時，使用油浸熒光物鏡和數(shù)字光圈0.75。一個40x物鏡與10x目鏡結(jié)合，適合瀏覽（細看）及常規(guī)的FISH分析。當需要高度擴大倍率時，63x或100x油浸achromat （色盲患者）型物鏡能取得很好的效果。浸油：用于油浸目鏡的浸油應該表明用于低自動熒光尤其用于熒光顯微鏡。 濾光器 多波段和單波段熒光顯微鏡濾光器，（最適于該試劑盒）可在公司購得。可用于大多數(shù)型號顯微鏡。CEP X/Y 和 LSI 21, 綠色和三波段 DAPI/Green/Orange 濾光器均可購于公司. 橘黃光信號將發(fā)粉橘色，綠光信號將發(fā)黃綠色，所有其他DNA經(jīng)DAPI染色將發(fā)藍色熒光 。所用試劑的準備20x SSC制備PH 5.3的20x SSC66g 20Xssc200ml 純凈水共250ml徹底混合,在室溫下用PH meter 測PH ,必要時用濃鹽酸調(diào)整PH值到5.3,總?cè)萘吭?50ml,用0.45um 濾紙(filter) ,儲存在有該容器中在室溫下最多6個月.變性溶液70% 甲酰胺 in 2x SSC PH7.0-8.0,49ml 甲酰胺7ml 20X SSC PH5.314ml 純凈水總?cè)萘?70ml充分混勻,放在玻璃coplin 缸中,在室溫下用帶有玻璃PH電極的PH 計測PH確保PH 在7.0-8.0之間.在2-8攝氏度儲存在有蓋容器內(nèi),在一周內(nèi)使用.每次用前檢查PH酒精洗滌溶液用100%酒精和純凈水,配制稀釋液(v/v)70%,85%,100%三種濃度.儲存在室溫下蓋緊.稀釋溶液可于一周內(nèi)使用,除非蒸發(fā)或者由于過度使用而稀釋.注意:需要額外的試劑處理標本和玻片制備過程,詳情參見特殊程序部分.0.4X SSC/0.3NP-40洗滌溶液950ml 純凈水20ml 20xSSC PH5.33ml NP-40總?cè)萘?1000 ml 徹底混勻，必要時用1N NaOH 調(diào)PH至7.0-7.5，用帶有玻璃PH電極的PH 計測PH。用純水調(diào)中容量到1升，用0.45um孔的過濾器過濾，儲存未用的溶液在有蓋容器內(nèi)在室溫下可用6個月。每天結(jié)束試驗后丟棄用過的溶液0.1NP-40 in 2x SSC100ml 20 SSC PH 5.3849ml 純水1ml NP-40總?cè)萘?000ml徹底混勻，必要時用1N NaOH 調(diào)PH至7.0-7.5，用帶有玻璃PH電極的PH 計測PH。用純水調(diào)中容量到1升，用0.45um孔的過濾器過濾，加70ml到copplin 缸中保持在室溫。存儲未用的溶液在有蓋容器內(nèi)，室溫下可用6個月，每天結(jié)束試驗后丟棄用過的溶液。警告及注意事項1. 用于in vitro 診斷2. 探針對照玻片取自認培養(yǎng)羊水細胞已經(jīng)被固定多次在75甲醇/25醋酸中。因為不可能知道哪一步被污染，所有人的標本和對照玻片都應該小心處理， 標本處理原則可由美國疾病控制與預防中心獲得。3. 由于使用vysis公司提供或建議以外的試劑。雜交條件可能被顛倒。4. 如果在玻片的變性，雜交，和信號點計過程不遵守所有的程序，可能引起不可接受的或者錯誤的結(jié)果。5. DAP2 復染劑包含DAPI 和 1，4苯二胺自由基DAPI 是一種誘變劑在positive genotoxic 效應的基礎上，避免吸入，攝入或接觸皮膚。1，4苯二胺 是一種皮膚和呼吸致敏物，避免吸入，攝入或接觸皮膚。詳情參見MSDS 。6. 暴露于光下，熒光團容易photobleached，為限制這種降解，在減弱的光下處理所有包含熒光團的溶液，包括處理玻片雜交的所有步驟， 進行所有不需要光的操作步驟（保溫階段，洗滌等）在減弱的光下，避免直接的光照在熒光團上。詳情參見MSDS7. 探針混合物包含甲酰胺，致畸物。避免接觸皮膚和粘膜，詳情參見MSDS8. 強烈建議用校準的溫度計，測量溶液的溫度，水浴，和恒溫箱因為這對產(chǎn)品發(fā)揮最好的效能很重要9. 根據(jù)你單位關于有害物降解的原則降解所有有害材料 。標本采集，處理，儲存，和玻片標本采集和處理由未經(jīng)培養(yǎng)的羊水制備玻片標本 1 離心2-5ml 整個羊水（AF）樣本，1000轉(zhuǎn)5分鐘。羊水樣本不應該表現(xiàn)為血性或者褐色2. 在2-5ml 1x 胰蛋白酶/EDTA 中，混懸細胞團在37攝氏度水浴至少15分鐘。3. 離心懸液1000 轉(zhuǎn) 5分鐘4. 在2-5ml 0.56 氯化鉀中混懸細胞團，37攝氏度水浴20分鐘5.加0.8-2ml 固定液（3：1甲醇：冰醋酸）6.離心懸液1000轉(zhuǎn)5分鐘， 在1ml 新鮮的固定劑混懸細胞團。儲存固定的標本在4攝氏度至少30分鐘，或者直到進行FISH長期儲存，在固定液中存放在-20攝氏度7在把細胞放在玻片上之前，調(diào)整細胞懸液的容量，根據(jù)細胞團的大小，必要時，尤其實儲存了很長時間下（大于1個月），在制備玻片前用 固定液洗滌細胞團。8.制備FISH用的玻片，直接滴細胞懸液到1或2張冷的玻片上制作兩個雜交區(qū)，（每個區(qū)15-20ul細胞團） 試驗程序熒光原位雜交程序摘要標本DNA變性1. 濕化雜交室（一個帶一張濕吸墨紙的 密封容器 或者紙巾大約1*3英寸。貼在容器的側(cè)壁），預熱37度，通過把它放在37度恒溫箱中 ，在玻片制備前2. 加變性溶液到coplin缸中，方在73加減1度水浴中至少30分鐘，在使用前查看溶液溫度3. 每次用前校驗變性溶液的PH在7.0-8.0，通過把制備好的玻片浸在變性溶液中在73加減1度5分鐘，使標本DNA變性，不要變性超過每次每缸4片玻片。4. 用鉗子，從變性溶液中拿出玻片，立即放進70酒精洗滌溶液中，在室溫。搖動玻片使除掉甲酰胺，允許玻片立在酒精洗液中1分鐘5. 從70酒精中拿出玻片，用85和100酒精重復步驟46. drain 多余的酒精從玻片上，用玻片底邊接觸一個吸墨水紙用實驗室wipe擦干底面7. 在準備好加探針溶液以前將玻片放在45-50度玻片加熱裝置，不超過2分鐘，注意：如果在探針還沒有準備好，而玻片已經(jīng)超過2分鐘預熱，玻片應該繼續(xù)在100酒精中。在加熱以前不要讓空氣吹干玻片。探針制備1. 允許探針在室溫加熱，因而降低粘度從而精確的吸取2. 渦流混合，短暫旋轉(zhuǎn)試管（1-3秒），在微離心機中讓內(nèi)容物到達試管底部，再次輕輕渦流混合。注意：探針已經(jīng)過預變性，適合加入到變性的玻片上的目標區(qū)， 雜交1. 加入10ulCEP X/Y 探針混合到玻片上的雜交區(qū)，10ul LSI 21 探針混合到玻片的另一個雜交區(qū)，立即放一個22mm*22mm的蓋玻片在探針溶液上使溶液均勻散布在蓋玻片下，避免氣泡，否則會影響雜交。注意：在房蓋玻片前不要吸取探針溶液在多目標區(qū)上，2. 用稀釋的橡膠膠水密封蓋玻片：擠橡膠膠水于一個5ml 注射器，擠少量膠水在蓋玻片外圍，覆蓋蓋玻片和玻片，在蓋玻片周圍形成密封。3. 將玻片放在預熱的雜交室內(nèi)并蓋緊蓋子，37度恒溫6-24小時。雜交后洗滌1. 加入0.4X SSC /0.3NP-40到coplin 缸，將缸放在73加減1度的水浴中至少30分鐘預熱溶液或者直到溶液溫度達到73加減1度。在每洗一批前，洗滌溶液的溫度必須恢復到73加減1度，2. 加2X SSC /0.1%NP-40到第二個coplin 缸中，放在室溫下，每天用完后丟棄兩缸溶液。3. 去掉橡膠膠水密封和蓋玻片，立即將玻片放在盛有0.4x SSC /0.3NP-40在73加減1度，。擺動玻片大約3秒，重復其他的玻片，然后恒溫2分鐘。每次洗滌不要超過4個玻片，。如果超過4個玻片，每次使用前校驗溶液溫度在73加減1度。注意：在把