黑曲霉利用香蕉提取物生產(chǎn)檸檬酸.doc

中文譯文黑曲霉利用香蕉提取物生產(chǎn)檸檬酸摘要： 將香蕉提取物作為碳源進(jìn)行檸檬酸生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)。使用的是微生物黑曲霉菌株。 對不同類型的生物反應(yīng)器進(jìn)行了測試：泡沫柱反應(yīng)器和攪拌反應(yīng)器，對于攪拌反應(yīng)器兩種不同類型的葉輪在不同轉(zhuǎn)速的條件下進(jìn)行了研究：六片槳葉的渦輪槳和賴特寧架A310渦輪。在測試過程中對各個(gè)參數(shù)進(jìn)行了測量：生化性能（生物量w/v和霉的直徑）、化學(xué)性能（總糖和檸檬酸的濃度）和物理性能（溶解氧分壓DOT；氧攝取率OUR；粘性；氣體/液體的體積傳質(zhì)系數(shù)，)。結(jié)果表明檸檬酸的產(chǎn)量與微生物的形態(tài)有嚴(yán)格的聯(lián)系；霉必須以顆粒的形式生長，如在泡沫柱反應(yīng)器總提供溫和的環(huán)境中進(jìn)行；另外，隨著機(jī)械的攪拌，霉的顆粒狀態(tài)被破壞，霉的形態(tài)變?yōu)榻z狀，并且檸檬酸的產(chǎn)量明顯減少。對發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行討論，以達(dá)到更好的了解影響擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的主要因素。關(guān)鍵詞：檸檬酸、黑曲霉、混合、泡沫柱反應(yīng)器、攪拌器、葉輪、農(nóng)業(yè)產(chǎn)品、物理參數(shù)注釋： 溶解氧濃度（千克/立方米） 平衡溶解氧濃度（千克/立方米） 校準(zhǔn)溶解氧濃度（千克/立方米） D 葉輪直徑（mm） D 顆粒的平均直徑mm DOT 溶解氧分壓 DOT* 平衡溶解氧分壓 溶解氧分壓的變化在圖表2區(qū)域c中(1/s) 溶解氧分壓在圖表2的區(qū)域a中 平均流速梯度 體積傳質(zhì)系數(shù)（1/s)N 攪拌轉(zhuǎn)速（每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)） 功率數(shù) 抽號OUR 氧攝取率（千克/立方米小時(shí)）P 檸檬酸濃度（千克/立方米） 體積功耗（瓦/立方米）Q 體積氣體流速RI 流變指數(shù)S 底物濃度（千克/立方米）T 時(shí)間（秒，小時(shí)，天）T 溫度（）X 生物量濃度(千克/立方米） 生物產(chǎn)量 檸檬酸產(chǎn)量 液體表觀粘度備注： o 初始條件 f 最后條件簡介： 最近在先進(jìn)的工業(yè)國家，檸檬酸消耗量的增加主要是在食品和制藥工業(yè)（約占到總需求的70%）方面，以及用于生物降解，用于生物降解的這種性能表明檸檬酸能夠代替磷作為洗滌劑從而能控制環(huán)境的污染。這些需求似乎預(yù)測在將來檸檬酸有一個(gè)更大的需求。在這種情況下，利用農(nóng)業(yè)殘留物作為碳源生產(chǎn)檸檬酸似乎是對于檸檬酸生產(chǎn)和廢物回收處理這兩個(gè)問題解決的恰當(dāng)選擇。在關(guān)于經(jīng)過深層通風(fēng)發(fā)酵進(jìn)行檸檬酸生產(chǎn)的報(bào)告中，由選定的黑曲霉或者念珠菌進(jìn)行碳源（葡萄糖、蔗糖糖漿、甘蔗和甜菜糖蜜、水解淀粉）的生物氧化。最廣泛應(yīng)用的工業(yè)微生物是黑曲霉，因?yàn)樗茉跇O端的PH=2時(shí)生產(chǎn)能力仍然能夠增長，并且不產(chǎn)生有毒物質(zhì)，同時(shí)能夠抑制黃曲霉。使用最廣泛的工業(yè)原料是甜菜糖蜜，這種甜菜糖蜜是蔗糖生產(chǎn)的副產(chǎn)品。然而，在最幾年，隨著制糖過程的能力的提高，糖漿中的糖分的總量減少，所以糖漿的發(fā)酵能力也降低了。所以在最近幾年，人們提出了用水解淀粉進(jìn)行生產(chǎn)的新的工藝。在這種情況下，可以考慮利用農(nóng)業(yè)廢棄物。對于黑曲霉來說，蔗糖、果糖和葡萄糖都是最好的發(fā)酵碳源，而這些糖類又是成熟水果的主要成分。這表明可以使用水果作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。之前，通過使用黑曲霉進(jìn)行的農(nóng)業(yè)廢棄物（尤其是香蕉屬）的生物氧化已經(jīng)表明使用單孢子技術(shù)的可行性?，F(xiàn)在我們工作的目的是檢查在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)器中進(jìn)行的檸檬酸的生產(chǎn)，然后來確定與利用香蕉提取物來進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸之間存在的主要的問題。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，不同類型的反應(yīng)器（充入空氣或者氧氣的鼓泡器，配置不同類型的葉輪的攪拌器）已經(jīng)被用來創(chuàng)造這種可以產(chǎn)生顆粒的生產(chǎn)條件，這種生產(chǎn)條件是擴(kuò)大檸檬酸產(chǎn)量所必需的。研究方法：發(fā)酵培養(yǎng)基和微生物之前的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉B60似乎是用香蕉類原料生產(chǎn)生產(chǎn)檸檬酸的最佳菌株。在這里提到的黑曲霉B60已經(jīng)使用過了；1989年，皮特發(fā)現(xiàn)這種微生物應(yīng)該保存在麥芽瓊脂培養(yǎng)基，放置在40的環(huán)境中。 孢子培養(yǎng)需要在溫和的舒和約翰遜培養(yǎng)基中，通過使用三次連續(xù)的傳輸媒介。第四次轉(zhuǎn)移的分生孢子通過加入10ml 0.2%的生理鹽水來生產(chǎn)孢子懸浮液，這是用來制備接種的菌株的，接種的孢子懸浮液的量為2個(gè)孢子/立方米。在揺瓶的條件下，經(jīng)過48小時(shí)后，形成的為微生物顆粒要用無菌水沖洗5次，然后接種到反應(yīng)器中，使得反應(yīng)器中孢子濃度達(dá)到5個(gè)/立方米。 塞西精制的發(fā)酵培養(yǎng)基：香蕉在蒸餾水中煮沸搗碎2小時(shí)，糖類從中提取出來，然后混合物在轉(zhuǎn)速為5500的條件下離心分離出懸浮固體，隨后為了抑制如鐵離子，尤其是錳離子等重金屬離子，向溶液中加入黃血鹽。表1給出了測試的香蕉提取物的組成。 表格1 香蕉提取物的組成總糖 g/l110氮 ppm400磷 ppm200鎂 ppm130鋅 ppm1鐵 ppm0.1銅 ppm缺失錳 ppm0.010PH5.5反應(yīng)器： 在批量處理過程中，我們用到了兩種不同類型的反應(yīng)器：一種是攪拌式反應(yīng)器（STR),扎爾伯G14可加入10L的發(fā)酵液；另一種是容量為2L的泡沫柱反應(yīng)器（BCR）。在這兩種反應(yīng)器中，溫度控制在（301）的范圍內(nèi)，測定PH值和DOT值。在攪拌式反應(yīng)器中要控制攪拌速度。 測試了攪拌式反應(yīng)器的兩種不同的葉輪對于發(fā)酵過程的影響：六片槳葉的渦輪槳和賴特寧架A310渦輪槳。它們用到了兩種不同的進(jìn)氣裝置：噴射器在距離底部55mm的徑向渦輪和鉆孔在距離底部77mm的軸流式渦輪。 在表格2中，列出了葉輪的主要的結(jié)構(gòu)和功能的特性。PH的測定使用探針，同時(shí)氧氣的測量是通過測定氧氣的探針。泡沫柱反應(yīng)器是由4個(gè)樹脂玻璃制成的管子組裝而成的，其直徑為60mm，高度為30mm，每個(gè)管子都有一個(gè)小孔，能夠接收到測定PH和溶解氧以及溫度感應(yīng)器帶來的信息。在容器中，安裝樣品管子。通過一個(gè)燒結(jié)的有一個(gè)1640um氣孔，直徑為70mm,厚度4mm的玻璃圓盤，氣體在此擴(kuò)散。柱子的上部有一個(gè)旋轉(zhuǎn)的泡沫破壞器；PH的測量通過一個(gè)漢納8424探針，同時(shí)氧氣的測量是用一個(gè)96/s的537型氧氣計(jì)探針測量。圖表1是兩個(gè)反應(yīng)器的示意圖：分析和其他測量： 在發(fā)酵的過程中，測量了幾個(gè)參數(shù)：總糖濃度的測定是通過費(fèi)林試劑法，檸檬酸的濃度是通過酶學(xué)方法，生物量是通過顆粒直徑和干重濃度進(jìn)行測定。第一次的平均值為30100顆粒直徑測量在100倍顯微鏡下或直接由口徑測量而來，后者通過稱重在5500轉(zhuǎn)速的條件下運(yùn)行15分鐘后的10毫升樣本，用10毫升自來水沖洗三次，然后在105攝氏度的條件下干燥24小時(shí)。 物理測定的方法：溶解氧分壓，通過將氧探針插入發(fā)酵液中；氧攝取率和氣體/液體提及傳質(zhì)系數(shù)，通過蘋果電腦獲得前端動(dòng)態(tài)的手段。我們通過停止氧氣的進(jìn)料（空氣或者純氧氣）以及記錄溶解氧分壓隨時(shí)間的變化來評估氧攝取率；這個(gè)裝置能夠記錄在2Hz的頻率下溶解氧分壓的值。圖表2中顯示了溶解氧分壓的一個(gè)典型曲線。 供氣時(shí)，氧平衡可以寫作： （1） 假定沿著反映路徑的氣相組成為常數(shù)。量氧計(jì)測量了溶解氧分壓的值；飽和條件下的百分?jǐn)?shù)；可以表示為溶解氧的函數(shù)以及校準(zhǔn)飽和狀態(tài)： （2）忽略了在測量期間的變化。 當(dāng)停止進(jìn)氣時(shí)，方程式（1）的第二個(gè)元素變?yōu)?，方程式可以變?yōu)?（3） 假設(shè)氧攝取率不依賴于圖表2中的(在連續(xù)區(qū)域c中）；考慮到溶解氧分壓，在停止通氣（圖表2中的a區(qū)域）前，測量校準(zhǔn)的溶解氧分壓的值。氣液傳質(zhì)系數(shù)可以表示為： （4） 圖表1：攪拌式反應(yīng)器和泡沫柱反應(yīng)器的剖視圖（A）攪拌式反應(yīng)器a取樣管 b排氣噴嘴 c探頭和氣體噴嘴 d管壁 e氣體分布器 f水平拉桿 g換熱器擋板 h恒溫水進(jìn)口 i攪拌器 l恒溫水出口 m溫度探測器（B）泡沫柱反應(yīng)器a氣體出口管 b消泡器 c探頭和氣體噴嘴 d氣體出口管 e氣體分布器 f取樣管圖表2 ：在一個(gè)氧攝取率的條件下，典型的溶解氧分壓的變化 1氣體入口停止時(shí)間 2氣體入口開始時(shí)間 a發(fā)酵區(qū)域 b脫氣區(qū) c直線下降區(qū)域 d限制區(qū)域 e通氣區(qū)域 如果在發(fā)酵過程，氧探頭校準(zhǔn)氣相相同，那么=并且DOT*=100。 在方程式4中方程式1的瞬間狀態(tài)可以不必考慮，因?yàn)檫@被證實(shí)是可以忽略不計(jì)的。圖表2中實(shí)際的曲線的形狀取決于記錄裝置的弛豫時(shí)間，即探頭的反應(yīng)時(shí)間和攪拌系統(tǒng)的反應(yīng)能力。 已經(jīng)證實(shí)了空隙時(shí)間與沒有關(guān)聯(lián)。Koizumi and Aiba 發(fā)現(xiàn)：在直線區(qū)域的曲線斜率，氧攝取率和的測定幾乎不受弛豫時(shí)間的影響。 為了測定和，運(yùn)用了兩種不同的方法：一種是依賴于壓力測量的物理方法，第二種是依賴于測定液相中氧氣的濃度的酶學(xué)方法。第一種方法更加準(zhǔn)確，但是需要數(shù)量較大的樣本（100ml）；酶學(xué)方法只需要20ul的樣品，但是操作復(fù)雜，不易重現(xiàn)。由于以上原因，我們采用第一種方法。圖表3是一個(gè)使用設(shè)備的示意圖：圖表3：測量的實(shí)驗(yàn)裝置A氣體區(qū)域 B液體區(qū)域a儲(chǔ)氣氣球 b 溫度探頭 c玻璃盤 d底閥 e電磁攪拌器1恒溫槽出水口 2氣體流動(dòng)管 3壓力計(jì) 4真空泵在不同糖濃度的條件下測量，結(jié)果在表格3中。按照奎克的觀點(diǎn)，他可能能夠確定與糖濃度的關(guān)系，正如表格4中所表示的系時(shí)候的香蕉提取物。在每一個(gè)發(fā)酵過程的開始和結(jié)束都要測量。 液體培養(yǎng)基的表觀粘度可以通過儀器來確定。該方法實(shí)在一直旋轉(zhuǎn)速度的前提下，依賴于扭轉(zhuǎn)阻力測量的。溫度的控制是在300.5的恒溫槽中進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)測試 表格4列出了攪拌式反應(yīng)器和泡沫柱反應(yīng)器的操作條件。實(shí)驗(yàn)用泡沫柱反應(yīng)器進(jìn)行了測試，重復(fù)使用了純氧來確定更高的氧分壓的影響。用同樣的發(fā)酵培養(yǎng)液來測試這6個(gè)所有項(xiàng)目；發(fā)酵培養(yǎng)基是從單一的香蕉批次中獲得的，然后再添加化學(xué)成分達(dá)到表格1中列出的成分。通過在120的條件下加熱完整的培養(yǎng)基0.5h,以達(dá)到滅菌的目的。對于所有的測試，采用同時(shí)抽樣的方法，前48h取出15120ml的發(fā)酵樣品（根據(jù)測量的參數(shù)），之后每4個(gè)小時(shí)，然后每12個(gè)小時(shí)取出發(fā)酵液。測量每個(gè)樣品的總糖和檸檬酸的濃度，生物量干重和顆粒平均直徑。也要測量下面的屋里參量：PH值，DOT，OUR和，同時(shí)液體表觀粘度也要每隔24小時(shí)測量一次。表格5中是每個(gè)試驗(yàn)的初始條件。表格3：在不同發(fā)酵培養(yǎng)基中氧氣的飽和值 表格4：試驗(yàn)過程的物理?xiàng)l件表格5：試驗(yàn)的初始條件表格6：試驗(yàn)的主要結(jié)果結(jié)果和討論：在表格6中顯示了用不同的反應(yīng)器配置進(jìn)行的留個(gè)試驗(yàn)獲得的主要結(jié)果。使用泡沫柱反應(yīng)器獲得了檸檬酸的最高產(chǎn)量：50%的發(fā)酵糖可以轉(zhuǎn)化為檸檬酸。用攪拌式反應(yīng)器獲得了最低的產(chǎn)量；事實(shí)上，攪拌式反應(yīng)器的產(chǎn)量值表明徑向槳攪拌器不論是高速還是低速都會(huì)造成檸檬酸產(chǎn)量的明顯降低（大約4.5%）。然而，使用軸向槳攪拌器的檸檬酸產(chǎn)量依賴于入口的攪拌速率：在低速400rpm時(shí)產(chǎn)量為26.4%，高速700rpm時(shí)，產(chǎn)量為10.6%。關(guān)于生物產(chǎn)量，表格6表明產(chǎn)量幾乎不受攪拌的影響：幾乎所有的試驗(yàn)的值都達(dá)到了16%18%。一個(gè)更加詳細(xì)的關(guān)于在攪拌式反應(yīng)器與泡沫柱反應(yīng)器的形態(tài)的研究結(jié)果表明：像在泡沫柱反應(yīng)器這樣的溫和的條件下，接種的菌種可以繼續(xù)生長成小團(tuán)的球狀和分支的菌絲。另一方面，在攪拌式反應(yīng)器中，機(jī)械攪拌會(huì)引起菌種的破壞，所以菌種會(huì)生長成絲狀。生物的形態(tài)對于發(fā)酵液(培養(yǎng)基和菌種）的流動(dòng)性影響很大：在攪拌式反應(yīng)器開始運(yùn)動(dòng)后，發(fā)酵液粘度很明顯的增加，然而的值卻下降，在某些情形下會(huì)為0，如圖表6所示。觀察到顆粒類型的形態(tài)的菌體時(shí)，值總是遠(yuǎn)大于0，檸檬酸產(chǎn)量總是很高。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明溶解氧濃度在調(diào)節(jié)代謝途徑中起到了重要的作用。圖表7表明：數(shù)據(jù)1和數(shù)據(jù)6時(shí)糖類、檸檬酸和生物量的濃度的變化：在數(shù)據(jù)1中，可以看到糖類生產(chǎn)其他的、沒有被探測到的物質(zhì)，而不是檸檬酸。關(guān)于在發(fā)酵過程中的生物量的習(xí)性，圖表8、9、10表明了在發(fā)酵過程中主要的特征量的變化。圖表8中：在發(fā)酵過程的第一個(gè)1530h內(nèi)，微生物特別活躍，氧氣的消耗量也增加；隨后，氧氣的消耗量會(huì)減少到一個(gè)常數(shù)值。這種現(xiàn)象似乎是不受反應(yīng)器配置的影響；可以假定是一些化學(xué)因素影響了微生物來解釋這種現(xiàn)象，例如道森提出的氮源缺乏。圖表9：在生產(chǎn)檸檬酸過程中的第一天發(fā)酵過程，微生物特別活躍，隨后微生物的活性變?nèi)?，在某些情況下會(huì)停止。反應(yīng)器的配置能明顯地影響這種現(xiàn)象：在較高的速率下（曲線2，3，4）的特定的生產(chǎn)力在4060小時(shí)內(nèi)會(huì)下降到0；在較低的剪切力下（曲線1，5，6），當(dāng)?shù)谖鍧舛鹊陀?0kg/m時(shí)，生產(chǎn)力會(huì)下降到0。關(guān)于微生物的生長量受液體表觀粘度的影響，圖表10中表明了流變指數(shù)(RI)在發(fā)酵過程的變化。 圖表11表明值的變化:與去他的試驗(yàn)隨時(shí)間的變化曲線相類似。在值迅速減少的第一個(gè)時(shí)期觀察到，它們的值在發(fā)酵過程中幾乎不變。 結(jié)論所用黑曲霉B60和香蕉提取物作為碳源生產(chǎn)檸檬酸。發(fā)生在實(shí)驗(yàn)室的生物反應(yīng)器中的試驗(yàn)給了我們進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸有用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。涉及到微生物生長形態(tài)的結(jié)果：球狀微生物是獲得檸檬酸生物積累的必要條件。麥茲和庫森強(qiáng)調(diào)：用球狀黑曲霉進(jìn)行的生產(chǎn)依賴于很多因素，如重金屬。但是發(fā)酵的類型起到最重要的作用。事實(shí)上，在這三個(gè)攪拌系統(tǒng)的試驗(yàn)中，氣泡渦輪槳、軸向渦輪將和徑向渦輪槳。通常來說第一個(gè)最為有效。這些結(jié)果與恰茲用不同的培養(yǎng)基得到的結(jié)果一致；但是結(jié)果卻與戈麥茲的結(jié)果不一致，他是通過將攪拌器的速度從450rpm增大到1000rpm獲得了較好的球狀結(jié)構(gòu)和較高的檸檬酸產(chǎn)量。在最好的情況下，在發(fā)酵的最后階段檸檬酸的密度為45kg/m，檸檬酸的產(chǎn)量為40.9%。通過使用純氧氣代替空氣，檸檬酸的產(chǎn)量會(huì)增加到50%。因此，氧氣供應(yīng)是另一個(gè)重要的因素：在微生物的生長和檸檬酸生產(chǎn)中，氧氣必須充足。任何氧氣供應(yīng)的中斷都可以引起檸檬酸生產(chǎn)系統(tǒng)的不可逆的減產(chǎn)。因此，值尤其重要，這不僅與微生物的生存能力有關(guān)，也與檸檬酸生產(chǎn)量的增長有關(guān)。圖表4：溶解氧濃度平衡的條件與糖濃度的關(guān)系。香蕉提取培養(yǎng)基，30，760mmHg 圖表5：發(fā)酵7天后菌種的菌絲 致謝： 這個(gè)試驗(yàn)的進(jìn)行獲得了MPI40%的資金支持。參考文獻(xiàn)Bartolomew, W. H., Karow, E. O., Slat, M. R. & Wilhelm,R. H. (1950). Oxygen transfer and agitation in submerged fermentation: mass transfer of 02 in submerged fermentation of Streptomyces griseus. Ind. Eng. Chem., 42, 1801-10. Dawson, M. W., Maddox, I. S., Boag, I. F. & Brooks, J. D. (1988). Application of fed-batch Culture to citric acid production by A. niger: the effect of dilution rate and dissolved oxygen tension. Biotechnol. Bioeng., 32,220-26. Gomez, R., Schnabel, I. & Garrido, J. (1988). Pellet growth and citric acid yield of Aspergillus niger 110. Enzyme Microbiol. Technol., 10, 188-91. Hixon, A. W. & Gaden, E. L. (1950). Oxygen transfer in submerged fermentation. Ind. Eng. Chem., 42, 1792-1801. Hossain, M., Brooks, J. D. & Maddox, I. S. (1984). The effect of the sugar source on citric acid production by A. niger.Appl. Microbiol. Biotechnol., 19, 393-7. Jordan, J., Ackerman, E. & Berger, R. L. (1956). Polarographic diffusion coefficient of oxygen defined by activitygradient in viscous media. J. Am. Chem. Soc., 78, 2979-83. Koizumi, J. & Aiba, S. (1984). Reassessment of the dynamic method. Biotech. Bioeng., 26, 1131-33. Metz, B. & Kossen, N. W. (1977). The growth of molds in the form of pellets - A literature review. Biotech. Bioeng.1 9, 781-99. Milsom, P. H. & Meers, J. L. (1983). Citric acid. In Comprehensive Biotechnology, Vol. 3, ed. M. Moo Young. Pergamon Press, Oxford, pp. 665-80. Mislivich, P. B. (1981). Mycotoxine production by conidial fungi. In Biology of Conidial Fungi, ed. G. T. Cole & B. Kendrik. Academic Press, New York, pp. 37-74. Perquin, L. H. C. (1938). Dissertation, Technical University of Delft, Netherlands. Pitt, J. I. (1985). Media and incubation condition for Penicillium and Aspergillus taxonomy. In Advances in Penicillium and Aspergillus Systematics, ed. R. A. Samson & J.I. Pitt. Plenum Press, New York, pp. 93-103. Qazi, G. N., Gaind, C. N., Chaturvedi, S. K., Chopra, C. L.Tfiiger, M. & Onken, U. (1990). Pilot-scale citric acid production with Aspergillus niger under several conditions. J. Ferment. Bioeng., 69, 72-4. Quicker, G., Schumpe, A., K6nig, B. & Deckwer, W. B. (1981). Comparison of measured and calculated oxygen solubilities in fermentation media. Biotechnol. Bioeng., 23, 635-50. Rohr, M., Stadler, P. J., Saltzbrunn, W. O. S. & Kubicek, C. P. (1979). An improved method for characterization of citrate production by conidia of Aspergillus niger Biotechnol. Letters, 1, 281-6. Rohr, M., Kubicek, C. P. & Kominek, J. (1983). Citric acid. In Biotechnology, Vol. 3, ed. H. J. Rehem & G. Reeds. Verlag Chemie, Basel, pp. 419-54. Sassi, G. (1990). Produzione di acido citrico da scarti agroalimentari. PhD Thesis, Politecnico di Torino, National Library, Roma. Sassi, G., Ruggeri, B., Specchia, V., Scannerini, S. & Gianetto, A. (1989). Citric acid production from agricultural wastes: a biochemical feasibility test by A. niger v. Tieghem. Minerva Biotechnol., 1, 23-32. Shu, P. & Jo