第七屆挑戰(zhàn)杯大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽作品申報(bào)書

序號(hào)： 編碼： 第七屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽作品申報(bào)書 作品名稱：中宇宙法研究土霉素殘留對(duì)底泥細(xì)菌耐藥性的影響 學(xué)校全稱： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 申報(bào)者姓名 （集體名稱）： 陳曉梅 類別：自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文 科技發(fā)明制作A類 科技發(fā)明制作B類 第七屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽組委會(huì)制二00二年九月說 明1申報(bào)者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說明各項(xiàng)內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2申報(bào)者在填寫申報(bào)作品情況時(shí)只需根據(jù)個(gè)人項(xiàng)目或集體項(xiàng)目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報(bào)者可根據(jù)情況填寫C表。3表內(nèi)項(xiàng)目填寫時(shí)一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報(bào)書可復(fù)制。4序號(hào)、編碼由各高校根據(jù)作品種類填寫。5學(xué)術(shù)論文、社會(huì)調(diào)查報(bào)告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請(qǐng)附中文本），請(qǐng)以4號(hào)楷體打印在A4紙上，附于申報(bào)書后，學(xué)術(shù)論文及有關(guān)材料在8000字以內(nèi)，社會(huì)調(diào)查報(bào)告在15000字以內(nèi)（文章版面尺寸14.522cm左右）。6各高校的作品（數(shù)量參照“作品數(shù)額分配方案”）各一式四份分別按規(guī)定的時(shí)間用特快專遞寄至省競(jìng)賽組委會(huì)辦公室。7作品申報(bào)書須按要求由各校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一寄送。8其他參賽事宜請(qǐng)向本校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)咨詢。9寄送地址：廣州市東山區(qū)寺貝通津一號(hào)大院團(tuán)省委學(xué)校部“挑戰(zhàn)杯”競(jìng)賽組委會(huì)。聯(lián) 系 人：唐 銳、黃廉東聯(lián)系電話：（020）87778918、87185614傳 真：（020）87778918、87185613郵政編碼：510080 A1申報(bào)者情況（個(gè)人項(xiàng)目）說明：1必須由申報(bào)者本人按要求填寫，申報(bào)者情況欄內(nèi)必須填寫 個(gè)人作品的第一作者（承擔(dān)申報(bào)作品60%以上的工作者）； 2本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為對(duì)申報(bào)者情況的確認(rèn)。姓 名陳曉梅性別女出生年月1980年2月申報(bào)者情況學(xué)校全稱華南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)學(xué)歷本科生專 業(yè)獸醫(yī)年級(jí)99級(jí)學(xué)制五年入學(xué)時(shí)間99年9月作品全稱中宇宙法研究土霉素殘留對(duì)底泥細(xì)菌耐藥性的影響畢業(yè)論文題目通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院99（2）班郵政編碼510642單位電話85280233常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生宿舍五山區(qū)A-415郵政編碼510642住宅電話38676321合作者情況姓 名性別年齡學(xué)歷所在單位資 格 認(rèn) 定學(xué)校學(xué)籍管理部門意見 是否為2003年7月1日前正式注冊(cè)在校的全日制非成人教育、非在職的各類高等院校中國(guó)學(xué)生（含?？粕⒈究粕脱芯可?。是 否若是，其學(xué)號(hào)為：1999311205 （部門蓋章） 2002年 11月8日院系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖?本作品是否為課外學(xué)術(shù)科技或社會(huì)實(shí)踐活動(dòng)成果 是 否 負(fù)責(zé)人簽名： 2002年11月9 日B1申報(bào)作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1必須由申報(bào)者本人填寫；2本部分中的科研管理部門簽章視為對(duì)申報(bào)者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3作品分類請(qǐng)按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱中宇宙法研究土霉素殘留對(duì)底泥細(xì)菌耐藥性的影響作品分類（D）A機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動(dòng)化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技術(shù)（包括計(jì)算機(jī)、電信、通訊、電子等） C數(shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等） D生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健 康、衛(wèi)生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化 工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路用中宇宙法，即人工模擬池塘生態(tài)系統(tǒng)來研究不同濃度鹽酸土霉素對(duì)池塘生態(tài)系統(tǒng)中底泥弧菌的耐藥特性的影響，同時(shí)了解耐藥菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的交叉耐藥性。為尚處于初步起始階段的抗生素環(huán)境安全評(píng)價(jià)工作提供基本的數(shù)據(jù)。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處人工建立池塘生態(tài)系統(tǒng)的中宇宙法有明顯的科學(xué)性和創(chuàng)新性；有代表性地選擇畜牧和水產(chǎn)上應(yīng)用較為廣泛的土霉素來研究抗生素殘留對(duì)環(huán)境微生物的耐藥性影響在國(guó)內(nèi)以至國(guó)際上具有一定的前瞻性和先進(jìn)性。作品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義該作品用中宇宙法研究土霉素對(duì)底泥細(xì)菌的耐藥性影響，很好的模擬池塘生態(tài)環(huán)境，克服了田間試驗(yàn)所存在干擾因素多的缺點(diǎn)，研究的內(nèi)容涉及抗生素殘留對(duì)環(huán)境微生物耐藥性的影響，提供可作為今后抗生素殘留環(huán)境安全評(píng)價(jià)工作的基本數(shù)據(jù)。學(xué)術(shù)論文文摘人工模擬多個(gè)池塘生態(tài)環(huán)境，即中宇宙來研究不同濃度的鹽酸土霉素對(duì)池塘生態(tài)系統(tǒng)中底泥弧菌的耐藥特性的影響，同時(shí)了解耐藥菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的交叉耐藥性。從而為尚處于起始階段的抗生素環(huán)境安全評(píng)價(jià)工作提供基本的數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，施藥前中宇宙E中能分離到大量的特征弧菌，而在用藥后則分離不到特征弧菌；這可能是因?yàn)楦邉┝康乃幬餁缌嗽撎卣骷?xì)菌。中宇宙B、C、D中的特征弧菌均明顯地對(duì)土霉素產(chǎn)生耐藥性。但是從各宇宙在用藥前后的耐藥率比較看，耐藥率并沒有同藥物濃度之間呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性，這一現(xiàn)象同ORelly(2001)等的報(bào)道是一致的，其原因可以解釋為藥物在底泥環(huán)境中能夠與金屬離子結(jié)合而抑制其活性，使耐藥率與用藥濃度之間無法形成有效的規(guī)律性。本試驗(yàn)中在用藥后第70d分離所得的弧菌對(duì)土霉素的耐藥率呈明顯的上升趨勢(shì)且耐藥水平也有升高的趨勢(shì)。該現(xiàn)象可以解釋為：底泥中藥物不易發(fā)生降解和轉(zhuǎn)移，長(zhǎng)期的藥物存在可以對(duì)弧菌誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性并誘導(dǎo)出高水平耐藥株。交叉耐藥性試驗(yàn)表明：誘導(dǎo)出的耐藥株對(duì)四環(huán)素類藥物具有明顯的交叉耐藥現(xiàn)象。其中對(duì)四環(huán)素是完全交叉耐藥，而對(duì)強(qiáng)力霉素和米洛霉素為高水平交叉耐藥。存在以上區(qū)別可能是這些藥物不同的耐藥機(jī)制所致。 作品在何時(shí)、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會(huì)議上或報(bào)刊上發(fā)表及所獲獎(jiǎng)勵(lì)無鑒定結(jié)果請(qǐng)?zhí)峁?duì)于理解、審查、評(píng)價(jià)所申報(bào)作品具有參考價(jià)值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄1.陳杖榴，楊桂香，孫永學(xué)等. 獸藥殘留的毒性與生態(tài)毒理研究進(jìn)展. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（1）：8891.2.Halling-Serensen, S.Nors Nielsen, P.F.Lanzky et al. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances on the environment-a review. Chemosphere,1998,36:357393. 3.Michael Teuber. Veterinary use and antibiotic resistance. Current Opinion in Microbiology,2001,4:493499.4.Nygaard, B.T.Lunestad, H.Hektoen et al. Resistance to oxytetracycline, oxolinic acid and furazolidone in bacteria from marine sediments. Aquaculture,1992,104:3136.5.Erve.P, Herve.L.B, Louis.P. Experimental study on the decontamination kinetics of seawater polluted by oxytetracycline contained in effluents released from a fish farm located in a salt-marsh. Aquaculture,1993,112:113123.6.R.Hirsh, T.Ternes, K.Haberer et al. Occurrence of antibiotics on the aquatic environment. The Science of the Total Environment,1999,225:109118.7.Sara.G, Bengt-Erik.B. Chemicals and biological products used in south-east Asian shrimp farming, and their potential impact on the environment a review. The Science of the Total Environment,2001,280:93131.8.Michael J.B, Dean C.L. The use of temporary pond microcosms for aquatic toxicity testing: direct and indirect effects of endosulfan on community structure. Aquatic Toxicology,1998,41:1011249.S.Vaughan, P.Smith. Estimation of the influence of a river sediment on the biological activity of oxytetracycline hydrochloride. Aquaculture,1996,141:6776.10.B.Samuelsen, V.Torsivik, A.Ervik. Long-range changes in oxytetracycline concentration and bacterial resistance towards oxytetracycline in a fish farm sediment after medication. The Science of the Total Environment,1992,114:253611.A.OReilly, P.Smith. Use of indirect conductimetry to establish predictive no effect concentrations of oxytetracycline and oxolinic acid in aquatic sediments. Aquaculture,2001,196:1326.申報(bào)材料清單（申報(bào)論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）申報(bào)論文一篇科研管理部門簽章以上情況屬實(shí) 2002年11 月8日C.當(dāng)前國(guó)內(nèi)外同類課題研究水平概述 說明：1.申報(bào)者可根據(jù)作品類別和情況填寫； 2.填寫此欄有助于評(píng)審。目前，國(guó)外關(guān)于抗生素殘留對(duì)環(huán)境微生物的耐藥性影響的研究尚處于較為初步的狀態(tài)。但隨著研究的深入，已經(jīng)越來越引起人們的關(guān)注。目前的研究主要是進(jìn)行田間試驗(yàn)。但田間試驗(yàn)由于影響因素較多，使各學(xué)者的研究成果之間存在較大的差異。因此已經(jīng)有少部分學(xué)者轉(zhuǎn)向了用微宇宙法或中宇宙法進(jìn)行研究，以獲得更為確切的、可比性更強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為抗生素殘留的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)。國(guó)內(nèi)這方面的研究較為空白，尚未見有公開發(fā)表的研究文獻(xiàn)。D.推薦者情況及對(duì)作品的說明說明：1由推薦者本人填寫； 2推薦者必須具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報(bào)作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）； 3推薦者填寫此部分，即視為同意推薦； 4推薦者所在單位簽章僅被視為對(duì)推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓 名楊桂香性別女年齡37 職稱副教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室郵政編碼510642單位電宅電話85282730推薦者所在單位簽章楊桂香是我院副教授 （簽章） 2002年11月9日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述該申報(bào)作品是陳曉梅同學(xué)在本人和藥理學(xué)博士生俞道進(jìn)的指導(dǎo)下，利用課余時(shí)間和暑期在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室和室外建立的池塘生態(tài)環(huán)境進(jìn)行艱苦的持之以恒的摸索和試驗(yàn)的研究成果。 請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)對(duì)抗生素殘留對(duì)環(huán)境微生物耐藥性的研究在國(guó)際上尚處于初步階段。該作品在國(guó)內(nèi)這方面的研究還是空白的背景下產(chǎn)生，具有前瞻性，為仍處于起始階段的抗生素環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供了基本的數(shù)據(jù)。特別是在室外建立中宇宙的方法表現(xiàn)了技術(shù)的創(chuàng)新性。其它說明推薦者情況姓 名葉啟薇性別女年齡52職稱高級(jí)實(shí)驗(yàn)師工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郵編510642單位電話85280237住宅電話（020）85280839推薦者所在單位簽章葉啟薇是我院高級(jí)實(shí)驗(yàn)師 簽章日期 2002年11月9日 請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述在楊桂香副教授和博士生俞道進(jìn)的指導(dǎo)下，陳曉梅同學(xué)利用暑期和課余時(shí)間持之以恒的在獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室和室外試驗(yàn)基地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其吃苦耐勞和刻苦鉆研的精神得到了藥理教研室眾多老師的好評(píng)。 請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)該作品有兩個(gè)突出特點(diǎn)：一、研究抗生素殘留對(duì)環(huán)境微生物耐藥性的影響，站到了一個(gè)生態(tài)保護(hù)的高度，為環(huán)境安全評(píng)價(jià)工作提供基本數(shù)據(jù)，目前這方面的研究在國(guó)內(nèi)比較少見；二、具有創(chuàng)新思維，運(yùn)用中宇宙法進(jìn)行研究克服了田間試驗(yàn)的多種干擾因素。其它說明 學(xué)校組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)確認(rèn)并蓋章以上情況屬實(shí) （團(tuán)委代章）2002年11月9日 校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門確認(rèn)蓋章同意上報(bào)。 2002年11月9 日 校評(píng)審委員會(huì)初評(píng)意見 評(píng)委簽名： 年 月 日 校組織協(xié)調(diào)委員會(huì)審定意見 （簽章） 年 月 日E全省組織委員會(huì)秘書處資格和形式審查意見組委會(huì)秘書處資格審查意見 審查人（簽名） 年 月 日組委會(huì)秘書處形式審查意見 審查人（簽名） 年 月 日組委會(huì)秘書處審查結(jié)果合格 不合格 負(fù)責(zé)人（簽名） 年 月 日F參賽作品打印處中宇宙法研究土霉素殘留對(duì)底泥細(xì)菌耐藥性的影響陳曉梅（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣州 510642）摘 要：人工模擬多個(gè)池塘生態(tài)環(huán)境，即中宇宙來研究不同濃度的鹽酸土霉素對(duì)池塘生態(tài)系統(tǒng)中底泥弧菌的耐藥特性的影響，同時(shí)了解耐藥菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的交叉耐藥性。從而為尚處于起始階段的抗生素環(huán)境安全評(píng)價(jià)工作提供基本的數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞：中宇宙、鹽酸土霉素、底泥、耐藥性、交叉耐藥性前 言隨著集約化畜牧業(yè)的發(fā)展，抗生素的應(yīng)用也越來越多。這些抗生素能防治疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，但是應(yīng)用于動(dòng)物的抗生素能以原形或代謝物形式隨糞便排泄到環(huán)境中。由于抗生素的生物活性，進(jìn)入環(huán)境中的抗生素可作用于環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的各個(gè)層面，并最終將對(duì)人類的生存環(huán)境和健康造成不利影響13。目前普遍認(rèn)為在抗生素殘留對(duì)環(huán)境的諸多影響中，抗生素對(duì)環(huán)境細(xì)菌的耐藥性的選擇和誘導(dǎo)以及這種耐藥性在時(shí)空上的傳播是其最重要的一面，同時(shí)也是與人類公共衛(wèi)生關(guān)系最為密切的一面4。水環(huán)境作為畜牧和水產(chǎn)用藥的最終歸宿地，常常積累了大量的抗生素殘留，因此水環(huán)境可能作為環(huán)境耐藥細(xì)菌的重要儲(chǔ)庫(kù)而在研究上具有特殊重要的意義57。目前國(guó)際上普遍采用模擬生態(tài)系統(tǒng)的方法來研究外來化學(xué)物質(zhì)對(duì)環(huán)境的影響。其中，中宇宙是指體積大于1m3的模擬生態(tài)系統(tǒng)8，9。該方法可以很好地模擬田間環(huán)境同時(shí)可以排除田間試驗(yàn)的各種干擾因素，使試驗(yàn)結(jié)果具有更好的可比性。本試驗(yàn)選擇在畜牧和水產(chǎn)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的土霉素來研究其對(duì)模擬池塘生態(tài)系統(tǒng)中的底泥弧菌的耐藥特性的影響，以期為今后的抗生素殘留環(huán)境安全性評(píng)價(jià)工作積累基本數(shù)據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 藥物和試劑鹽酸土霉素，江西國(guó)藥股份有限公司，批號(hào)：0202060， 含量84.9%鹽酸四環(huán)素，四川制藥，批號(hào)：PX-2TCH 2246B, 988.8/mg強(qiáng)力霉素，上海五洲，批號(hào)：HS0130, 842/mg米洛霉素，蘇州立達(dá)，批號(hào)：TE27, 1000/mgTCBS瓊脂，批號(hào)200207104，廣東環(huán)凱微生物科技公司營(yíng)養(yǎng)肉湯，批號(hào)20020403，杭州天和微生物試劑有限公司1.1.2 儀器水平搖床，HS 250 B型，馬來西亞IKA公司電子分析天平，AE160型，瑞士Mettler公司1.2 方法1.2.1 池塘中宇宙模擬生態(tài)系統(tǒng)的建立1.2.1.1 中宇宙的建立和調(diào)試建立6個(gè)高為1m，體積為5.3m3的水泥壁小池塘；等份加入未曾接觸過抗生素的養(yǎng)魚池底泥，同時(shí)加入等體積的水，自然光照，適當(dāng)添加水至系統(tǒng)成熟。1.2.1.2 測(cè)試指標(biāo)及系統(tǒng)成熟的標(biāo)志系統(tǒng)成熟前每周測(cè)定溶解氧、pH值、水溫等參數(shù),每周用黑白瓶法測(cè)定系統(tǒng)晝夜呼吸率以推算P/R值。不同系統(tǒng)各項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)小于20%30%即可認(rèn)為系統(tǒng)穩(wěn)定。1.2.1.3 實(shí)驗(yàn)分組及用藥在系統(tǒng)中符合要求的5口池塘進(jìn)行試驗(yàn)，分別設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組和四個(gè)用藥組。鹽酸土霉素用藥濃度分別相當(dāng)于土霉素0.8g/ml、4.0g/ml、20.0g/ml、100g/ml。先將藥物溶解于潔凈桶中，全池潑灑并適當(dāng)混勻。各中宇宙藥物濃度如下：表1 各中宇宙藥物濃度中宇宙ABCDE用藥濃度0g/ml0.8g/ml4.0g/ml20.0g/ml100g /ml1.2.2 水體中底泥樣品的采集和弧菌的分離培養(yǎng)1.2.2.1 采樣器的制作根據(jù)Samuelsen（1992）的文獻(xiàn)10制作底泥采樣器。1.2.2.2 采樣的時(shí)間和方法在用藥前一天、用藥后第21d、用藥后第70d分別在各中宇宙中分10個(gè)點(diǎn)采集柱狀泥樣，緩慢地將泥柱推入潔凈的白瓷盤中。1.2.2.3 水體底泥樣品的處理取并列排放于白瓷盤的10個(gè)泥柱的前2cm于封口膠袋中混合均勻，分別取出15g于250ml的滅菌錐形瓶中，加入100ml的滅菌蒸餾水，于水平搖床上以275rpm振蕩10min后，靜置10min，再將上清液傾入另一250ml的滅菌錐形瓶。1.2.2.4 弧菌的分離培養(yǎng)方法將上述各中宇宙的上清液用滅菌蒸餾水稀釋101000倍。取0.2ml稀釋液緩慢加入事先制備好的TCBS瓊脂上，用無菌三角形玻璃推刀將稀釋液推至均勻。再將上述TCBS瓊脂倒置,在25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。在TCBS培養(yǎng)基上長(zhǎng)成的深綠色、半透明、外圈有白暈的中等大小的菌落為優(yōu)勢(shì)菌落。挑取優(yōu)勢(shì)菌落分別接種于5ml滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48h。1.2.3 土霉素對(duì)弧菌耐藥性的影響1.2.3.1 鹽酸土霉素藥液的配制準(zhǔn)確稱取適量鹽酸土霉素于100ml容量瓶中，加蒸餾水定容，充分混勻，配成濃度為1280g/ml的儲(chǔ)備液，4冰箱中保存。臨用前以0.22um的濾膜除菌。1.2.3.2 藥物敏感性試驗(yàn)取10ml滅菌試管6支。將菌液用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至約為105個(gè)細(xì)菌/ml，除第一管加入稀釋菌液1.8ml外，其余各管均加入1.5ml，然后向第一管加入1280g/ml鹽酸土霉素0.2ml，混勻后，吸出0.5ml加入到第二管。同樣方法依次稀釋到第5管，棄去0.5ml，第6管為藥物空白對(duì)照管。6支試管的藥物濃度分別為：128g/ml、32g/ml、8g/ml、2g/ml、0.5g/ml、0ug/ml。稀釋完畢后，蓋好試管，置25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后觀察結(jié)果。每株受試細(xì)菌分別做2次重復(fù)。1.2.3.3 結(jié)果判斷取出試管逐支搖勻后觀察。若培養(yǎng)液中含有絮狀物沉淀或不澄明的管判為有細(xì)菌生長(zhǎng)；以澄清透亮的管判為無細(xì)菌生長(zhǎng)。無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。如果6支試管全部有細(xì)菌生長(zhǎng)，則說明池塘生態(tài)中的弧菌對(duì)土霉素的MIC128g/ml（第1管的藥物濃度）。1.2.4 耐藥菌交叉耐藥試驗(yàn)1.2.4.1 各種藥液的配制按1.2.3.1的方法配制濃度為1280g/ml的四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米洛霉素的儲(chǔ)備液。視情況進(jìn)行不同的稀釋。1.2.4.2 交叉耐藥性試驗(yàn)選取以上藥物敏感試驗(yàn)中的敏感弧菌和耐藥弧菌分別研究其對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米洛霉素的敏感性，以考查底泥耐藥弧菌對(duì)同類藥物的交叉耐藥程度。取10ml滅菌試管9支。將菌液用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至約為105個(gè)細(xì)菌/ml。除第一管加入稀釋菌液1.8ml外，其余各管均加入1.5ml，然后向第一管分別加入1280g/ml藥液0.2ml，混勻后，吸出0.5ml加入到第二管。同樣方法依次稀釋到第8管，棄去0.5ml，第9管為藥物空白對(duì)照管。那么，這9支試管的藥物濃度分別為：128g/ml、32g/ml、8g/ml、2g/ml、0.5g/ml、0.125g/ml、0.031g/ml、0.008g/ml、0g/ml。稀釋完畢后，蓋好試管，置25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后觀察結(jié)果。每種藥物對(duì)于每株受試細(xì)菌分別做2次重復(fù)。1.2.4.3 結(jié)果判斷取出試管逐支搖勻后觀察。若搖蕩試管發(fā)現(xiàn)有絮狀物沉淀或不澄明的管判為有細(xì)菌生長(zhǎng)；以澄清透亮的管判為無細(xì)菌生長(zhǎng)。無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。如果9支試管全部有細(xì)菌生長(zhǎng)，則說明：池塘生態(tài)中弧菌對(duì)該抗生素的敏感度128g/ml（第1管的藥物濃度）。2 結(jié)果2.1 土霉素對(duì)中宇宙弧菌耐藥性的影響2.1.1 用藥前中宇宙A、B、C、D、E中的弧菌對(duì)土霉素耐藥情況見表2：表2 用藥前各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC時(shí)菌株數(shù)中宇宙試驗(yàn)菌株數(shù)各MIC值的菌株數(shù)128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA3543331210B363123261C381312301D373426211E58043530162.1.2 用藥后第21d中宇宙E分離不出特征弧菌，中宇宙A、B、C、D中弧菌對(duì)土霉素耐藥情況見表3：表3 用藥后21天各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC時(shí)菌株數(shù)中宇宙試驗(yàn)菌株數(shù)各MIC值的菌株數(shù)128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA230703121B25821671C293163115D26111102112.1.3 用藥后第70d中宇宙E分離不出特征弧菌，中宇宙A、B、C、D中弧菌對(duì)土霉素耐藥情況見表4：表4 用藥后70天各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC時(shí)菌株數(shù)中宇宙試驗(yàn)菌株數(shù)各MIC值的菌株數(shù)128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA390002334B4011270020C340188323D4034202202.1.4 以中宇宙D在用藥前的10株弧菌和用藥后第21d分離得到的14株弧菌來研究其對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米洛霉素的交叉耐藥性，其試驗(yàn)結(jié)果見表5：表五 四環(huán)素類藥物交叉耐藥試驗(yàn)結(jié)果藥物名稱時(shí)間各MIC值的菌株數(shù)12812832820.50.1250.0310.008四環(huán)素用藥前000002800用藥后176000000強(qiáng)力霉素用藥前000000910用藥后0002111000米洛霉素用藥前0000001000用藥后002273000注：1280.008的單位為g/ml。2.2 對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的分析2.2.1 以MIC=2g/ml為基準(zhǔn)，則敏感度大于16g/ml的菌株為耐藥菌株。以這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來分析用藥前后弧菌對(duì)土霉素敏感程度，反映了土霉素明顯誘導(dǎo)中宇宙中弧菌的耐藥性。表6 細(xì)菌耐藥率變化表中宇宙用藥前用藥后第21天用藥后第70天試驗(yàn)株耐藥株耐藥率試驗(yàn)株耐藥株耐藥率試驗(yàn)株耐藥株耐藥率A351028.57%23730.43%3900%B36616.67%251144.0%403895.0%C38513.16%291034.48%302686.67%D371129.73%262284.62%403690.0%E58712.07%注：用藥后在E中宇宙中分離不到優(yōu)勢(shì)弧菌。用t檢驗(yàn)比較用藥前和用藥后21天的耐藥菌株數(shù)，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組（A）在用藥前后的耐藥率差異不顯著（P0.05）；而用藥組除E組分離不出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌外，用藥前后的耐藥率均差異極顯著（P0.01）。2.2.2 以MIC=0.125g/ml為基準(zhǔn)，則敏感度大于1.000g/ml的菌株為耐藥菌株。用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來比較和分析池塘生態(tài)中弧菌在用藥前后對(duì)不同的四環(huán)素類藥物的敏感程度，可以明顯觀察到交叉耐藥現(xiàn)象。表7 細(xì)菌交叉耐藥試驗(yàn)結(jié)果藥物名稱用藥前用藥后第21天試驗(yàn)株耐藥株耐藥率試驗(yàn)株耐藥株耐藥率四環(huán)素1000%1414100%強(qiáng)力霉素1000%141392.86%米洛霉素1000%141178.57%3 討論在實(shí)驗(yàn)過程中，施藥前中宇宙E中能分離到大量的特征弧菌，而在用藥后則分離不到特征弧菌；這可能是因?yàn)楦邉┝康乃幬餁缌嗽撎卣骷?xì)菌。中宇宙B、C、D中的特征弧菌均明顯地對(duì)土霉素產(chǎn)生耐藥性。但是從各宇宙在用藥前后的耐藥率比較看，耐藥率并沒有同藥物濃度之間呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性，這一現(xiàn)象與ORelly（2001）等11的報(bào)道是一致的，其原因可以解釋為藥物在底泥環(huán)境中能夠與金屬離子結(jié)合而抑制其活性，使耐藥率與用藥濃度之間無法形成有效的規(guī)律性。本試驗(yàn)中在用藥后第70d分離所得的弧菌對(duì)土霉素的耐藥率呈明顯的上升趨勢(shì)且耐藥水平也有升高的趨勢(shì)。該現(xiàn)象可以解釋為：底泥中藥物不易發(fā)生降解和轉(zhuǎn)移，長(zhǎng)期的藥物存在可以對(duì)弧菌誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性并誘導(dǎo)出高水平耐藥株。交叉耐藥性試驗(yàn)表明：誘導(dǎo)出的耐藥株對(duì)四環(huán)素類藥物具有明顯的交叉耐藥現(xiàn)象。其中對(duì)四環(huán)素是完全交叉耐藥，而對(duì)強(qiáng)力霉素和米洛霉素為高水平交叉耐藥。存在以上區(qū)別可能是這些藥物不同的耐藥機(jī)制所致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)蝿┝拷o予不同濃度的土霉素都能對(duì)池塘生態(tài)系統(tǒng)中特征性耐藥弧菌具有明顯的選擇作用，且由于藥物長(zhǎng)期存在于底泥環(huán)境，不容易發(fā)生降解和轉(zhuǎn)移，使底泥中可以長(zhǎng)期維持高水平的耐藥菌的存在。對(duì)于多劑量給藥本實(shí)驗(yàn)并沒有進(jìn)行研究，但多劑量給藥所造成的環(huán)境危害性必然更加嚴(yán)重。有研究認(rèn)為細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性的三個(gè)主要機(jī)制都是通過質(zhì)粒介導(dǎo)的。細(xì)菌中的土霉素耐藥質(zhì)粒能夠在不同的氣單胞菌和大腸桿菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并最終在特定的地理區(qū)域的人和水環(huán)境之間傳播。這些充分說明了抗生素的大量使用使環(huán)境不僅成為耐藥基因的儲(chǔ)庫(kù)，也成為耐藥基因擴(kuò)散和演化的媒介。本試驗(yàn)結(jié)合目前國(guó)際上的相關(guān)報(bào)道說明了在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上廣泛使用的土霉素對(duì)環(huán)境有潛在的不利影響。人們?cè)谑褂猛撩顾氐瓤股厮幬飦眍A(yù)防、治療動(dòng)物疾病的同時(shí)，不僅僅要考慮其對(duì)動(dòng)物機(jī)體病原菌的抗藥性的影響，還要考慮隨糞便或者尿液排泄到環(huán)境中的抗生素藥物對(duì)環(huán)境可能產(chǎn)生的負(fù)面作用。致 謝本研究和實(shí)驗(yàn)過程是在獸醫(yī)藥理研究室楊桂香副教授和博士研究生俞道進(jìn)同志的悉心指導(dǎo)和關(guān)懷下完成的。實(shí)驗(yàn)過程還得到了高級(jí)實(shí)驗(yàn)師葉啟薇老師、研究生李西瑞、吳潔珊等的關(guān)心和趙健文同學(xué)的協(xié)助。謹(jǐn)此表示最衷心的感謝！主要參考文獻(xiàn)1.陳杖榴，楊桂香，孫永學(xué)等. 獸藥殘留的毒性與生態(tài)毒理研究進(jìn)展. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（1）：8891.2.Halling-Serensen, S.Nors Nielsen, P.F.Lanzky et al. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances on the environment-a review. Chemosphere,1998,36:357393. 3.Michael Teuber. Veterinary use and antibiotic resistance. Current Opinion in Microbiology,2001,4:493499.4.Nygaard, B.T.Lunestad, H.Hektoen et al. Resistance to oxytetracycline, oxolinic acid and furazolidone in bacteria from marine sediments. Aquaculture,1992,104:3136.5.Erve.P, Herve.L.B, Louis.P. Experimental study on the decontamination kinetics of seawater polluted by oxytetracycline contained in effluents released from a fish farm located in a salt-marsh. Aquaculture,1993,112:113123.6.R.Hirsh, T.Ternes, K.Haberer et al. Occurrence of antibiotics on the aquatic environment. The Science of the Total Environment,1999,225:109118.7.Sara.G, Bengt-Erik.B. Chemicals and biological products used in south-east Asian shrimp farming, and their potential impact on the environment a review. The Science of the Total Environment,2001,280:93131.8.Michael J.B, Dean C.L. The use of temporary pond microcosms for aquatic toxicity testing: direct and indirect effects of endosulfan on community structure. Aquatic Toxicology,1998,41:1011249.S.Vaughan, P.Smith.