高效液相色譜教程.doc

。高 效 液 相 色 譜我國藥典收載高效液相色譜法項(xiàng)目和數(shù)量比較表：方法項(xiàng)目數(shù)量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鑒別934150檢查1240160含量測定760117387鑒于HPLC應(yīng)用在藥品分析中越來越多，因此每一個(gè)藥品分析人員應(yīng)該掌握并應(yīng)用HPLC。I概論一、液相色譜理論發(fā)展簡況色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)HPLC有以下特點(diǎn)：高壓壓力可達(dá)150300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。高速流速為0.110.0 ml/min。高效可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快通常分析一個(gè)樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。柱子可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相（常用CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。1液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510m。適用于分離分子量2001000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5（28），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.510范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高中中低流動(dòng)相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。二、塔板理論1塔板理論的基本假設(shè)塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設(shè)為：1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。2） 樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。3） 流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過程不符，如色譜過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評(píng)價(jià)色譜柱柱效。2色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h(yuǎn)和峰面積A）根據(jù)塔板理論，流出曲線可用下述正態(tài)分布方程來描述：Ce或Ce由色譜流出曲線方程可知：當(dāng)ttR時(shí)，濃度C有極大值，Cmax。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)（即一定），峰高h(yuǎn)與組分的量C0（進(jìn)樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，越?。ㄖг礁撸?，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。由流出曲線方程對(duì)V(0) 求積分，即得出色譜峰面積ACmaxC0?？梢夾相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C0，因此是常用的定量參數(shù)。把Cmaxh和Wh/22.355代入上式，即得A1.064Wh/2h，此為正常峰的峰面積計(jì)算公式。三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論）1液相色譜速率方程1956年荷蘭學(xué)者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論速率理論。它把色譜過程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過程，研究過程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（HAB/uCu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：H2dpsup 5(2psup 5(2psup 5(2f2影響柱效的因素1）渦流擴(kuò)散（eddy diffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A2dp，dp為填料直徑，為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻越大。HPLC常用填料粒度一般為310m，最好35m，粒度分布RSD5%。但粒度太小難于填充均勻（大），且會(huì)使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，越小?？偟恼f來，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無填料，A0。2）分子擴(kuò)散（molecular diffusion）。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u2Dm/u。u為流動(dòng)相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長（u小），展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的影響較大。Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-410-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對(duì)Dm進(jìn)行校正。一般在0.60.7左右，毛細(xì)管柱的1。3）傳質(zhì)阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時(shí)間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu又分為三項(xiàng)。流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗HmCmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致?？拷畛漕w粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗HsmCsmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對(duì)峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。高柱溫可以增大Dm，但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。固定相傳質(zhì)阻抗HsCsd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí)Hs可以忽略。從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：進(jìn)樣時(shí)間要短。填料粒度要小。改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。適當(dāng)?shù)牧魉佟Ｒ訦對(duì)u作圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時(shí)，H最小。一般在液相色譜中，uopt很?。ù蠹s0.030.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時(shí)間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。較小的檢測器死體積。3柱外效應(yīng)速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應(yīng)（色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：22柱內(nèi)2柱外2其它柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對(duì)接宜呈流線形，檢測器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。研究表明柱外死體積之和應(yīng)VR/。其次，希望將樣品直接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體積VR/2。柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子k小的組分（如k2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時(shí)，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影響相對(duì)較小。IIIHPLC系統(tǒng)HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計(jì)算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。一、輸液泵1泵的構(gòu)造和性能輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)0.5%，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.110 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min；輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150300 kg/cm2；液缸容積??；密封性能好，耐腐蝕。泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400 kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.20.3%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。各品牌輸液泵的基本參數(shù)：項(xiàng)目Waters 515型HP 1100型LC-10ATvp型Elite P200 II型檢定要求流速范圍0.001100.001100.0019.9990.014.99調(diào)節(jié)精度0.0010.0010.0010.01流量精密度RSD 0.1%0.15%（0.3%）0.3%0.5%1.5%流量準(zhǔn)確度2.0%5.0%2.0%最高壓力4000 Psi40 MPa39.2 MPa40.0 MPa密封圈壽命流動(dòng)相的脈沖2泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作：防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2m或0.45m）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：沒有流動(dòng)相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時(shí)可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時(shí)，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn)行。3梯度洗脫HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡?；旌先軇┑恼扯瘸ｋS組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓1030倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。二、進(jìn)樣器早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。1隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價(jià)格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到12%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。2停流進(jìn)樣。可避免在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降510%左右），但耐高壓（3540MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的510倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45m濾膜過濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過高的壓力將使柱頭損壞。為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。4自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。三、色譜柱色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10m等，柱效理論值可達(dá)516萬/米。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對(duì)于同系物分析，只要500即可；對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般1030cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。1柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.220m(510m)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑25mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長1030cm；窄徑柱（narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑12mm，柱長1020cm；毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.20.5mm；半制備柱，內(nèi)徑5mm；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長1030cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。2柱的發(fā)展方向因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長310cm，填料粒徑23m。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省流動(dòng)相；靈敏度增加；樣品量少；能使用長柱達(dá)到高分離度；容易控制柱溫；易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1100l/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。3柱的填充和性能評(píng)價(jià)色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度20m時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒20m時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法，Waters專利；軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在5%或10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。一份合格的色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對(duì)稱度和柱壓降等。4柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）。應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100200l四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出12mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH29范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔45天開機(jī)沖洗15分鐘。四、檢測器檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。1分類1）按原理可分為光學(xué)檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學(xué)檢測器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。2）按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。3）按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān)。4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。2性能指標(biāo)1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動(dòng)相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動(dòng)）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會(huì)影響測定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時(shí)所給出的信號(hào)大小。對(duì)濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mVml/g。對(duì)質(zhì)量型檢測器，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mVs/g。3）檢測限(detection limit)檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí)，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)（通常用2倍或3倍噪音表示）時(shí)進(jìn)入檢測器的某組分的量（對(duì)濃度型檢測器指在流動(dòng)相中的濃度注意與分析方法檢測限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml；對(duì)質(zhì)量型檢測器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。檢測限是檢測器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進(jìn)樣量（濃度型檢測器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比。也可, 用響應(yīng)信號(hào)的最大與最小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.12.0A。定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號(hào)與樣品量最好呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定量測定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。但實(shí)際上沒有一臺(tái)檢測器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常ABCx，B為響應(yīng)因子，當(dāng)x=1時(shí)，為線性響應(yīng)。對(duì)大多數(shù)檢測器來說，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1，實(shí)際上通常只要x=0.981.02就認(rèn)為它是呈線性的。線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時(shí)測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。幾種檢測器的主要性能：UV熒光安培質(zhì)譜蒸發(fā)光散射信號(hào)吸光度熒光強(qiáng)度電流離子流強(qiáng)度散射光強(qiáng)噪音10-510-310-9線性范圍105104105寬選擇性是是是否否流速影響無無有無溫度影響小小大小檢測限(g/ml)10-1010-1310-1310-9g/s10-9池體積(l)21071梯度洗脫適宜適宜不宜適宜適宜細(xì)管徑柱難難適宜適宜適宜樣品破壞無無無有無5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10l。在使用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到12l甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張問題就會(huì)很嚴(yán)重。而且這時(shí)池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì)，否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。3紫外檢測器(ultraviolet detector)UV檢測器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器，當(dāng)檢測波長范圍包括可見光時(shí)，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測器進(jìn)行微量分析。但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會(huì)提高背景噪音，降低靈敏度（實(shí)際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生漂移。注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A1時(shí)的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。中國藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241250nm范圍內(nèi)不得過0.20，在251300nm范圍內(nèi)不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過流動(dòng)池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動(dòng)池的光徑長度L成正比：AlglgECL式中I0為入射光強(qiáng)度，I為透射光強(qiáng)度，T為透光率，E為吸收系數(shù)。UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系統(tǒng)來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種?？勺儾ㄩL檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測器，它可以對(duì)每個(gè)洗脫組分進(jìn)行光譜掃描，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后，得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質(zhì)），色譜用于定量。常用于復(fù)雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。4與檢測器有關(guān)的故障及其排除1）流動(dòng)池內(nèi)有氣泡如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會(huì)在基線上出現(xiàn)許多線狀“峰”，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動(dòng)池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動(dòng)池破裂。2）流動(dòng)池被污染無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當(dāng)溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。3）光源燈出現(xiàn)故障紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要更換光源燈。4）倒峰倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動(dòng)相。如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測器時(shí)，無吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動(dòng)相不同所引起的。五、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號(hào)，再手工測量計(jì)算。其后，使用積分儀計(jì)算并打印出峰高、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù)。80年代后，計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速、簡便、準(zhǔn)確、精密和自動(dòng)化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：采集、處理和分析數(shù)據(jù)；控制儀器；色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。六、恒溫裝置在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在0.10.5之間，檢測器的恒溫要求則更高。溫度對(duì)溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對(duì)分離選擇性影響不大；還可使流動(dòng)相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡。色譜柱的不同工作溫度對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時(shí)溫度會(huì)引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)分離有影響；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大?？偟恼f來，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對(duì)分離的影響并不顯著，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作。在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動(dòng)相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時(shí)溫度對(duì)保留值的影響很大。不同的檢測器對(duì)溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動(dòng)超過0.5時(shí)，就會(huì)造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在0.001左右，微吸附熱檢測器也要求在0.001以內(nèi)。IV固定相和流動(dòng)相在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實(shí)現(xiàn)最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)HPLC分析方法建立和優(yōu)化的任務(wù)之一。本章著重討論填料基質(zhì)、化學(xué)鍵合固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及其選擇。一、基質(zhì)（擔(dān)體）HPLC填料可以是陶瓷性質(zhì)的無機(jī)物基質(zhì)，也可以是有機(jī)聚合物基質(zhì)。無機(jī)物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁。無機(jī)物基質(zhì)剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機(jī)聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機(jī)聚合物基質(zhì)剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機(jī)基質(zhì)中，導(dǎo)致填料顆粒膨脹，結(jié)果減少傳質(zhì)，最終使柱效降低。1基質(zhì)的種類1）硅膠硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強(qiáng)度外，還提供一個(gè)表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質(zhì)填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點(diǎn)是在堿性水溶性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為28。硅膠的主要性能參數(shù)有：平均粒度及其分布。平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值越大。含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強(qiáng)，對(duì)溶質(zhì)的吸附作用越大。端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價(jià)格較便宜，缺點(diǎn)是渦流擴(kuò)散項(xiàng)及柱滲透性差；后者無此缺點(diǎn)。硅膠純度。對(duì)稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。2）氧化鋁具有與硅膠相同的良好物理性質(zhì)，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會(huì)在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。不過現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了在水相中穩(wěn)定的氧化鋁鍵合相，并顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。3）聚合物以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機(jī)填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)。使用任何流動(dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng)堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質(zhì)本質(zhì)上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強(qiáng)，但它可以通過適當(dāng)?shù)墓δ芑揎椬兂捎H水性的。這種基質(zhì)不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復(fù)沖洗。所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢，所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對(duì)于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì)。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。2基質(zhì)的