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第四十九章基因治療藥物 基因治療(gene thepy)是指改變細胞遺傳物質為基礎的醫(yī)學治療。通過一定基因轉移載體將正?；蛴兄委焹r值的目的基因或核酸分子導靶細胞，從而達到防治疾病的效果c，基因治療藥物或基因藥物通常指攜帶目的基因或核酸分子的載體或遺傳修飾的體細胞，而基因工程藥物(g蚰毋ghg)是指有治療價值的目的基因導細菌、酵母或哺乳動物細胞或轉基因動植物等宿主細胞進行表達并經(jīng)分離和純化獲得蛋白質產(chǎn)物(包括活性蛋白質和多肚藥物、重組疫苗及單克隆抗體)。白1990年9月世界上第1例腺昔脫氟酶缺乏所致的重癥聯(lián)臺免疫缺陷病患者接受基因治療臨床試驗u來，基因治療基礎和臨床研究取得了巨大進展，適應證從先天性遺傳病擴展至惡性腫瘤等獲得性疾病?；蛑委熕幬镏亟M腺病毒一p53(recombined p53 adenoids)和重組人5型朦病毒(一mbi dType-5 adeno14101)在我國正式批準上市?；蛑委熥鳛橐环N壘新的治療手段，盡管在有效性、安全性和可操作性等方面仍面l臨著諸多棘手問題，但隨著人類基因組計劃(hugenomic project，I-IGP)的完成和后基因組研究的開展，以及小干涉RJqA($malltnterfenng RNA，siRNA)等生物技術的應用基因治療有望取得突破性進展。 第一節(jié)基因治療概論 (一)基因治療類型 基因治療接基因操作方式分為兩類一類為基因增強(g跏gmnon)和基因失活(辨眥lnaon)?；蛟鰪姴娣Q基因修飾，將目的基因導病變靶細胞或其他靶細胞，目的基因的表達產(chǎn)物能修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得以加強，目前基因治療多采用這種方式?；蚴Щ盍x稱為基因封閉如利用反義(anse)寡核苷酸特異地封閉基因表達，抑制特定基因的表達；通過核酶(nb。zyme)在細胞內特異性降解靶基因的轉錄產(chǎn)物，控制特定基因的表達；應用stRNA使基因沉默從而調節(jié)特定蛋白功能。另，類為基因修正(辨一)和基因置換(窖eePl托nt)，將缺陷基因的異常序列進行矯正或對缺陷基因精確地原位修復，不涉及基因組的其他任何改變。通過同源重組(h10剛呲omhlnat)即基因打靶(g蝴恤g)技術將外源正常的基因在特定的部位進行重組，M而使缺陷基因在J泉位特異性修復由于日前同源重組頻率太低而無法用于臨床。 基因治療按靶細胞類型x可分為生殖細胞(se枷一ne c elI)基因治療和體細胞(刪一e11)基因治療。廣義的生殖細胞基固治療以精于、9日于、早期胚胎細胞作為治療對象。從理論上講，直接對生殖細胞進行基因治療是可行的并能徹底根除遺傳病，但由于當前基因治療拉沭還不成熟，以及涉殛一系列倫理學問題，生殖細胞基因治療仍屬禁區(qū)。在現(xiàn)有的條件下，基因治療僅限于悻細胞，基因型的改變只限某一類體綱胞，其影響也只限某個體的當代。 f二基因治療條件 基因治療是通過外源性遺傳物質(目的基因)導人人體靶細胞而治療疾病的方法。因此目的基因的準備、靶細胞的選擇以及基因轉移的途徑是基因治療的必備條件。 1目的基因的準備基因治療首先必須獲得目的基因，并對表達調控進行詳細研究。根據(jù)基因治療不同需要，目的基因可以選擇互補DMA(c。【Ipl“qDNA，cDNA)t也可以選樣染色體基因組DNA(gmlc DNA)；可以是人體正常的基因，也可隊是人體基因組所不存在的野生型基因。供轉移的目的基因必須保持結構及功能的完整性以保證在靶細胞中正常表迭其功能。目的基因本身一般不含啟動子等調控序列，導人靶細胞后很難進行表達。田此，必須將目的基因重組于含有調控序列的質?；虿《镜谋磉_載悼唧一)的合適位置，再導細胞，在特定調控序列指導下進行表達。 2靶細胞的選擇根據(jù)基因治療嗣的選擇不同的俸細胞作為靶細胞。生殖細胞作為基因轉移的靶細胞倥在動物(轉基因動物)中進行，用來生產(chǎn)治療藥物或建立疾病動物模型等，基因治療的合適靶細胞應容易從體內取出和回輸能在體外增殖并經(jīng)得起體外基因操作，能高效表達外源基因以及具有較長的存活期。目前常用的靶細胞有骨髓干細胞(c e11)、肝細胞、成纖維細胞、淋巴細胞腫瘤細胞、肌細胞和內皮細胞等n近年來已越來越多地將卅繇基因直接導入體內相應的靶組織器官，如腦、肺、肝及骨骼肌等。 3基因治療的途徑按不同疾病和導人基因的不同性質予以選擇u科wm途徑：這是指將含外源基因的載體在體外導人人體自身或異體細胞(或異種細胞)，這種細胞被稱為“基因工程化的細胞”，經(jīng)體外細胞擴增后，輸回人體。這種方法易干操作，由于細胞在擴增過程中，對外源的添加物質經(jīng)大量稀釋井易于清除；同時，人體細胞尤其是自體細胞，加工后應用于人體自身，一般來說易于解決安全性問題。但在l、lk化方面，除載體系統(tǒng)外小易形成規(guī)模，而且必須有固定的臨床基地。叫基因轉移選徑比較經(jīng)典、安全而且效果較易控制，但是步驟多、技術復雜、難度太，不容易推廣；m訂啪途徑；這是將外源基因裝配于特定的真核細胞表達載體，原位(m Hfu)或直接導人體內。這種載體可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸DNA。這種方式的導人無疑有利lf大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。但是，對這種方式導人的治療基因以及其載體必須證明其安全性，而且導t凡悻內之后必須能進A靶細胞，有效地表達井達到治療目的。m訂vo基因轉移途徑操作簡便，類似傳統(tǒng)給藥方法容易推廣，這類基因轉移途徑目前雖然尚未成熟，存在療效持續(xù)時間短，免疫排斥及安全性等一系列問題，但它是基因轉移的方向，只有珊wyo基因轉移途徑成熟了，基因治療才能真正走向l臨床同時意味著基因藥物時代的全面到來。 第二節(jié)基因轉移方法 基因治療應根據(jù)不同的靶細胞和細胞基因轉移系統(tǒng)的特點來選擇不同的轉移方法。例如，處于分裂相的腫瘤細胞可用逆轉錄病毒載體轉移系統(tǒng)；肌肉組織由于其特殊的結構特別適用于裸I)N直接注射法等。理想的基因治療載體應具有以下特點：必須易于高滴度大規(guī)樓商品化生產(chǎn)；載體的持續(xù)穩(wěn)定性：即在一定耐期內能夠持續(xù)表選或者精確地調控遺傳物質；載體的免疫惰性：載體成分在導人后不搬活宿主的免疫反應；載體的組織靶向性：即載體能定向地進人特定的細胞類型；載體對導入的遺傳物質的太小沒有限制；載體帶有合適的調控序列，可以有效地轉導、調節(jié)和表達外豫遺傳物質；載體在細胞分裂中完成分裂和分泌，或者整臺到靶細胞染色體特異性基因位點上，以避免對宿主染色體及生理條件下內源基因調節(jié)區(qū)域的隨機整合，載體對分裂和來分裂細胞的感染：大量細胞(如神經(jīng)元。肝細胞和肌細胞)是分裂后期細胞所以需要能夠有效地轉人非分裂細胞的載體。，不同類型的載體具有不同特點，現(xiàn)在還沒有載體能達到所有的要求。 目前基因轉移方法大體分為非病毒介導和病毒介導兩大類。前者包括脂質體介導法、受體介導擊、裸DNA直接注射法等理化方法，后者包括以逆轉錄病毒載體腺相差病毒載體、慢病毒載體為代表等整合型載體和腺病毒為代表非整臺型載體介導的生物方法。 第三節(jié)基因治療應用 I一)遺傳病基因治療 遺傳病是遺傳物質(DNA)發(fā)生變化而引起的疾病，分為單基因病、多基因病和染色體病?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的遺傳病有6457種，絕大多數(shù)缺乏有效治療手段。基因治療最初設想是將具有正常功能的外源基因導遺傳病患者的細胞里取代或補充缺陷基因使其恢復正常功能而達到治療遺傳嶄的目的。目前遺傳病基因治療的首選病例是某些單基因遺傳病，這是因為其缺損的基因已確定，時致病基因的結構、功能(如定位、測序、調控)及蛋白質產(chǎn)物等都有較深入的研究和認識。迄今已有12種遺傳性疾病，如腺苷脫氨酶(ad蛐e d“eADA)缺乏導致重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征(scID)、家族性高膽固醇血癥(6rdld hyp。虻hol】aFH)又稱高B一脂蛋白血癥、囊性纖維化(cdc邱，cF)、Gher病(戈謝病)、血友病(hefnllphilia)和地中海貧血(halas mia)等。盡管生殖細胞基因治療是根治遺傳病的最終目標，但由于目前基因治療理論和技術不完備以及倫理學問題，遺傳病基因治疔仍限于體細胞。 I二)惡性腫瘤基因治療 從臨床角度和腫瘤發(fā)病機制來看。理想的腫瘤基因治療模式無非是將有突變的基因修復或用正常的基因替換即病因性基因治療。但是，就目前的技術手段實際上尚難以實現(xiàn)?，F(xiàn)在常用的基因治療策略主要包括免疫性基因治療、溶瘤腺病毒基因治療、自殺基因治療和輔助性基因治療。 1免疫性基因治療由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在著機體免疫系統(tǒng)對腫幅細胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫癌細胞本身的免疫性不強(如MHc表達不足)，也可藹【于抗原遞呈細胞(AP(：)不能提供足夠的共刺激信號(如B7)，或者機體免疫因子分泌不足等。因此可以通過“下四種方法糾正機體腫瘤免疫的耐受狀態(tài)：Llj將某些細胞因子(如IL一2、TNFa等)的基因轉染到機體免疫細胞(如TIL、IAK細胞及細胞毒淋巴細胞)中，以提高機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和反應能力。這些細胞因子的基因治療在定程度卜克服了細胞因于注射疔去需反復多次應用副作用嚴重等缺點，療效也有提高。腫瘤免疫細胞因子基因治療因其簡單、有效、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法；由于腫瘤細胞存在功能性MHc I類抗原和(或)其刺激信號表迭不足，可以將一些與免痤識別有關的基因(如HL_、B7等)轉染到體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，經(jīng)鈷照射滅活其致瘤性后再植腫埔患者體內；或者將表達HLB7的病毒載體或質粒DNA與脂質件復臺物直接性射到瘤體內，以增強腫瘤細胞對機體免疫系統(tǒng)的免疫原性，誘導宿主的免疫反應：制備腫瘤DNA瘤苗即將編碼特異抗原的基因直接注人體，通過其在機體內的表達從而可以激發(fā)機體對編碼抗原的免疫反應。如應用癌胚抗原(cEA)制備的腫瘤DNA瘤苗在宴驗中顯示出一定的效果；樹突狀細胞(ddri ceuDc)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原提呈細胞，廣泛分布于除腦以外的全身各臟器，能攝取、加工抗原，表達高水平MHC：分子、共刺激分子、黏附分子，并分泌高水平Thl型細胞園子lL一12，具有很強的抗原提呈能力，可有效激發(fā)T淋巴細胞應答。用腫瘤抗原編碼基因修飾DC、腫瘤mRNA刺激DC：、細胞因子修飾Dc等方琺增強Dc的抗原提里能力是近來腫瘤免疫基因治療研究的熱點。 2病因性基因治療 目前腫瘤病因性基因治療主要針對癌基因和抑蝎基因，其策略是抑制、阻斷癌基因的表達或者替代、恢復抑癌基因的功能。針對癌基因治療：采用反義寡核苷酸、核酶和sRNA抑制癌基因的表達將有可能使腫瘤的基圖表達調控回復到正常并使細胞重新分化或者誘發(fā)其凋亡(印。pt0螂)。由于轉錄是遺傳信息放大的過程，因此對于癌基因的表達抑制來說更為有效，該方法衛(wèi)稱反基因(an“薩ne)策略；針對抑癌基因治療：替代或恢復由于缺失或突變而壬失的抻癌基因(uPpor辟ne)的正常功能是腫痛病因性治療的策略之 。重組腺病毒p53抗癌注射液已在我國批準用于頭頸部腫瘤等治療，與放療和化療聯(lián)合應用產(chǎn)生協(xié)同作用。利用抑癌基因治療腫熘在體外常能取得較好的療效。在體內由于腫瘤俸積較大。內環(huán)境又十分復雜以及基因轉移效率的限制，其確切療效尚有待進一步觀察。 3溶瘤腺病毒屬腫瘤裂解性病毒(olydc vis)其特點如下：由于具有復制性，因此所需的病毒顆粒較??；能擴展至鄰近胂墑細胞，作用的范圍較廣；溶瘤腺病毒可產(chǎn)生溶瘤和抗腫瘤免疫反應。但溶瘤腺病毒由_f能夠復制也就存在著不安全的因素。近年來對腺病毒生物學的研究取得突破性的進展，研究出能夠選擇性地在腫瘤細胞中專一復制的腺病毒。，主耍分為兩類：一類應用外源的腫榴特異性啟動子控制腺病毒復制基因Ela表達，獲得條件復制性溶瘤腺病毒(c臥d)。另一類利用腫瘤細胞生物學特性，如腺病毒復制時抵抗宿主細胞凋亡可能榧關的ElB55K蛋白發(fā)生變異或缺失時。病毒復制的宿主細胞就會發(fā)生凋亡從而復制不能完成。，我國批準上市的重組人5型臁病毒是基因組改造后的溶瘤腺病毒，其早期基因EIB區(qū)用lf編碼55kD蛋白的一段827 bPDN被刪除，并通過基因序列的點突變，產(chǎn)生終止密碼子而阻止E1855kD蛋白的表達使其選擇性地在P53蛋白異常的腫瘤細胞中增殖，進而特異性地裂解腫瘤細胞可產(chǎn)生溶瘤作用并激發(fā)機體抗腫瘤免疫反應。主要用于鼻咽癌等頭頸部腫瘤治療。 4自殺基因治療一些來自病毒或細菌的基因具有一些特殊的功能，其表達產(chǎn)物可將原先對哺乳動物細胞無毒的或毒性極低的前藥(pmd嗚)轉換成毒性產(chǎn)物，導致這癌細胞的死亡-這類基因即稱為“自殺基因”(suidde gene)或“藥物敏感基因”。根據(jù)細胞白殺機制，將自殺基因作l為治療性且的基因應用于腫瘤治療的研究稱為腫瘤的自殺基因療法。由于當前對腫瘤形成的分子機制尚未完全闡明以及治療中目的基因表達調控研究滯步不前設計腫瘤細胞特異性自殺機制的基因治療方案對于腫瘤治療仍具有重大的理論和宴際應用價值。 (”自殺基因治療中酶和前藥：目前常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶(Hsvtk)基目、水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶(VzVd)口和胞噼啶脫氨酶(cD)基因，其中尤以郴vn最為常用。哺乳動物細胞含有基因。只能催化脫氧胸苷磷酸化成為脫氧胸苷酸而f磚v女基園產(chǎn)物還可催化棱苷類似物更昔洛韋(GcV)的磷酸化。這種磷酸化核苷能滲入細胞DNA干擾細胞分裂時DNA合成導致細脆死亡。腫瘤細胞導入mV基因后表達Hsv女，從而獲得對Gcv舯敏感性而“自殺”正常組織不受影響。 (2)自殺基目特異性控制；腫瘤自樂基因療法的應用首先解決的問題是自殺基因在腫瘤細胞中的高效及特異表達。自殺基因必須局限于腫瘤細胞“選擇性殺傷腫瘤細胞，解決這一同題的方案有=種：利用免疫脂質休，受體介導法等進行定向基因轉移或直接瘤內注射；利用腫瘤細胞生物學特性如腫瘤細胞和正常細胞分裂的差別，逆轉錄病毒介導m卜Tx基因治療腦腫瘸選擇性就是利用逆轉錄病毒只能轉雜分裂相的腫轡細胞而神經(jīng)細胞相對靜止：利用腫瘤特異表達的調控序列如酪氨酸酶，甲胎蛋白(FP)和癌胚抗原(cEA)等，如在自殺基因的上游安插這些特異的轉錄調節(jié)序列，則可竇現(xiàn)自殺基因的特異性者達，從而較好地克服了傳統(tǒng)化療藥物非選擇性問題。 (3)旁觀者效應(by札柚dn e蠡ct)：旁觀者效應指在用外源性自殺基因轉染腫瘤細胞后，束被轉染的腫瘤細胞可因鄰近的少數(shù)腫瘤細胞攜帶有自殺基目而被前體藥物殺傷，此敢應產(chǎn)生與自殺基目種婁、腫瘤細胞的類型和數(shù)量有關。TKGcV系統(tǒng)的旁觀者效應比較明顯和確定。由于日前基因轉移效率不夠高探討提高旁觀者效應的手段有可能為自殺基因療法提供十新的思路，當然這有籟于旁觀者效應機制的最終闡明。 5輔助性基因白療骨髓細胞毒作用是化療藥物應用中的主要毒性反應，并限制其應用。此方面的對策之就是增強腫瘤細胞對化疔藥物的敏感性和增強骨髓細胞的耐藥性。利用耐藥性基因fndJuI可設計出兩種基因治療的方法：一種是應用反義RNA技術以抑制異?；罨腗DR基因，從而達到逆轉腫瘤細胞化疔耐藥的作用；另一方面，利用耐藥性基因mcJrl保護正常組織免受化疔藥物的毒性，如多藥耐藥性基因導人骨髓前體細胞或干細胞然后將這些細胞輔到悻內。其他化療敏感組織如肝臟同樣可以通過導A，ndrl基因達到保護作用。 (三)其他疾病的基因治療 多基因遺傳病包括l臨床常見的高血壓、糖尿病，冠心病、神經(jīng)退行性疾病等對多基因遺傳病的基因治療主要是通過基因轉移賦予細胞一個新的功能由于多基因遺傳病涉及的基因尚不完全清楚，因此難以達到根本性的治療目的。，而一些病毒感染性疾病如艾滋病的基因治療研究已受到廣泛重視，基l本的戰(zhàn)略可分為三十方面：將艾滋病毒抗原基因導人靶細胞，激活機體的免疫系統(tǒng)提高對艾滋病毒的免疫能力；在靶細胞內表達類似物(dy)基因，目的在于降低病毒進人靶細胞的機會和降低HIv的復制增殖；在靶細胞內表達反義核酸或者核酶，從而直接阻斷HIX，的復制增殖或破壞HIV基因組。 第四節(jié)基因治療問題和前景 基因治療過一壘新的醫(yī)學抬疔方法問世，在短短二十余年里