煙草中水溶性糖的連續(xù)流動分析方法研究.doc

煙草中水溶性糖的連續(xù)流動測定方法李苓、王淑華、李萍、龍杰、崔婭、陳敏毅云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站 650106摘要： 以經(jīng)典的芒森.沃克法（YC/T32-1996國標(biāo)法）的測定值作為糖的標(biāo)準(zhǔn)值。用以下兩種方法：用非線性回歸方程對連續(xù)流動分析儀測定結(jié)果作修正；或用已知濃度的煙末標(biāo)樣標(biāo)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再用標(biāo)定后的濃度值作葡萄糖標(biāo)液的濃度檢測煙樣。兩種方法的分析結(jié)果與經(jīng)典法結(jié)果較吻合，結(jié)果令人滿意。為自動分析儀操作者提供了有指導(dǎo)意義的分析方法，為制定煙草中水溶性糖的連續(xù)流動分析方法標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。關(guān)鍵詞 水溶性糖 連續(xù)流動分析 回歸方程 標(biāo)定1概 述自動分析儀測定煙草中水溶性糖的結(jié)果較國標(biāo)法（YC法）偏高2-6%，甚至更高，而儀器分析方法上的差異，又造成同類型的儀器之間的分析結(jié)果差異較大而失去可比性和準(zhǔn)確性，成為困擾著分析工作者的一大難題。為了解決這一難題，統(tǒng)一分析方法、分析結(jié)果，并與國標(biāo)法結(jié)果吻合，兩年來我們做了大量試驗，改進分析路線、尋找最佳方案。我們首先用國標(biāo)法和儀器法多次測定了含糖量約在2-35%之間的25個煙葉樣品。以國標(biāo)法結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)值，儀器法結(jié)果為測定值，經(jīng)化學(xué)計量學(xué)優(yōu)選，制定非線性回歸方程經(jīng)驗公式，對儀器法測定值進行修正，結(jié)果較滿意，但此法計算較復(fù)雜。后來考慮用一個經(jīng)過多次國標(biāo)法測定，得到準(zhǔn)確濃度的煙末樣品作標(biāo)準(zhǔn)樣品，用此樣品對純葡萄糖液進行標(biāo)定。此法來源于標(biāo)準(zhǔn)加入法，在與被測樣相同或相近背景下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用此標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品。在此情況下，樣品中可能造成測定干擾的背景被扣除了，減少了干擾造成的誤差。但在自動分析儀上直接使用標(biāo)準(zhǔn)加入法，操作較復(fù)雜，達不到快速分析的目的。所以使用煙末來標(biāo)定純物質(zhì)標(biāo)液（簡稱煙末標(biāo)定法），即純物質(zhì)標(biāo)液的標(biāo)定值已經(jīng)帶有了煙末背景。再用這些標(biāo)液去測定其他樣品，測定過程中就間接地扣除了背景。其思路與標(biāo)準(zhǔn)加入法是一致的。不直接使用煙末作標(biāo)準(zhǔn)是因為煙末配成的標(biāo)液有效期很短，純物質(zhì)標(biāo)液有效期可達半年，并且此法簡單易行，結(jié)果也較好。2實驗部分2.1主要儀器及試劑 ALLIANCE INTEGRAL自動分析儀（法國）葡萄糖 無水碳酸鈉（0.25mol/L） 鹽酸（0.5 mol/L）新亞銅 冰醋酸 2.2實驗方法2.2.1國標(biāo)法與回歸法的試驗制備含糖量約從235%的煙葉樣品25個，低溫、干燥保存。分別用國標(biāo)法和儀器法測定至少5次，每次不少于2個平行樣。如有超差的數(shù)據(jù)應(yīng)重新復(fù)查。分別以兩種方法結(jié)果的平均值作為標(biāo)準(zhǔn)值和檢測值。在計算機中進行計算優(yōu)選，得到回歸方程?？偺腔貧w方程：ln（YC）=1.00933ln（儀器）-0.164745儀器法測定結(jié)果20%時: ln（YC/0.96）=1.00933ln（儀器）-0.164745還原糖回歸方程:ln（YC）=1.01256ln（儀器）-0.184955儀器法測定結(jié)果26%時: ln（YC/0.96）=1.01256ln（儀器）-0.184955選擇不同濃度的十個樣品用以上兩種方法測定,結(jié)果見表1.、表2.。2.2.2煙末標(biāo)定法選擇前述國標(biāo)法已測的25個煙樣中濃度適宜的一個煙樣作標(biāo)樣。稱取適量按儀器樣品處理方法制備樣液（母液），分別取不同體積的母液用5%醋酸配制5個濃度梯度的標(biāo)液。其濃度為國標(biāo)法測定的總糖和還原糖的值，在儀器上測定用同樣方法配制的5個純葡萄糖標(biāo)液，其測定值作為校正后的葡萄糖標(biāo)液濃度，至此標(biāo)定結(jié)束，可用此系列葡萄糖標(biāo)液測定樣品，經(jīng)大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計計算得：儀器法測定總糖20%時乘0.94；還原糖21%時乘0.97，結(jié)果與國標(biāo)法較吻合。見表1、表2。2.2.3回收率實驗分別用標(biāo)準(zhǔn)加入法測國標(biāo)法及兩種校正方法的回收率，結(jié)果見表3。2.3.4不同萃取體積不同萃取時間試驗稱取BD3樣品0.3g多份，分別加入25、50、100ml 5%醋酸，做不同萃取時間試驗（20、30、40、50、60min）。以國標(biāo)法測定值為準(zhǔn)，儀器用校正方法2測定糖含量及萃取率，以選擇既省試劑又省時間的分析方案，結(jié)果見表4。（國標(biāo)法測定BD3還原糖為16.50%）3試驗結(jié)果表1. 兩種校正方法與國標(biāo)法測定總糖結(jié)果對照 方法編號儀器法結(jié)果%國標(biāo)法結(jié)果%回歸法煙末標(biāo)定法結(jié)果%偏差結(jié)果%偏差17.286.746.29-0.456.62-0.12211.9010.0810.33+0.2510.68+0.60315.2113.9913.23-0.7613.58-0.41418.2415.8415.89+0.0516.24+0.40524.1019.7720.21+0.4420.10+0.33626.2421.7422.02+0.2820.92-0.82727.4122.7023.02+0.3222.82+0.12833.3528.0128.06+0.0527.73-0.28936.9130.3931.08+0.6930.67+0.281038.6032.0232.52+0.5032.07+0.05表2. 兩種校正方法與國標(biāo)法測定還原糖結(jié)果對照 方法編號儀器法結(jié)果%國標(biāo)法結(jié)果%回歸法煙末標(biāo)定法結(jié)果%偏差結(jié)果%偏差14.263.453.60+0.153.96+0.5129.228.067.88-0.188.35+0.29312.7211.2810.75-0.5310.78-0.50414.8213.1612.74-0.4213.24+0.08520.4417.6917.64-0.0618.18+0.49622.8719.9619.77-0.1920.30+0.34724.1420.6720.88+0.2120.82+0.15829.2325.1825.35+0.1725.10-0.08930.4425.5825.35-0.2326.15+0.571031.1626.0325.96-0.0726.39+0.36表3. 不同方法的回收率實驗 方 法回收率%1#2#3#4#國標(biāo)法98.5100.699.5097.1回歸法97.8103.0105.0100.6標(biāo)定法94.8105.0103.0106.0表4. 不同萃取體積、不同萃取時間試驗結(jié)果萃取體積ml萃取時間min203040506025結(jié)果15.916.016.2616.1816.20萃取率%96.497.098.598.198.250結(jié)果16.0316.3316.2816.2916.21萃取率%97.299.098.798.798.2100結(jié)果15.9016.1516.2616.2616.20萃取率%96.497.998.598.598.24討論從表1、表2看，兩種校正方法的測定結(jié)果與國標(biāo)法較吻合，同原儀器法相比，經(jīng)過校正的儀器法與國標(biāo)手工方法的差距大大縮短了?；厥章试?4.8%-106%之間，回收率略差的兩個數(shù)據(jù)是濃度高、低的兩個煙樣產(chǎn)生的。偏差基本在0.8以內(nèi)，國標(biāo)要求測糖的平行偏差應(yīng)在0.3以內(nèi)，對于儀器和國標(biāo)兩種原理不同的方法，此偏差范圍過于苛刻。所以，我們在此借用了煙草標(biāo)準(zhǔn)樣品GBW08514糖的不確定度0.8，作為兩種方法測定結(jié)果間的偏差允許范圍。以上兩種方法均能滿足此要求。無論國標(biāo)法還是儀器法都存在回收率隨被測樣品濃度的增加而升高的規(guī)律，而且還原糖的這種規(guī)律比總糖強?？梢哉f，目前的國標(biāo)法并不適合測定低糖樣品，如：白肋煙。而儀器法不適合測定高糖的樣品。從儀器法產(chǎn)生以來，直接用儀器法測定的糖都與手工方法測定的糖有較大差異，其差異主要來源于樣品處理以及測定原理的不同。對于國標(biāo)方法，其優(yōu)點是：選擇性較高；缺點是：操作復(fù)雜、費時，測定低濃度的糖時，回收率較低。對于儀器法，其優(yōu)點是：操作簡單、快速，重現(xiàn)形好。缺點是：背景干擾大，對高濃度樣品測定誤差大。原因主要是因為儀器的檢測方法大多使用光度比色法，而煙草本身成分復(fù)雜，大多有顏色，經(jīng)過加熱反應(yīng)還會產(chǎn)生新的有色物質(zhì)。雖然裝有透析器，可過濾大分子色素等干擾物質(zhì)，但這種過濾并不完全，而且有的顏色是在過濾后進入加熱池產(chǎn)生的，這些顏色會影響測定結(jié)果。光度法本身的誤差與吸光度有很大關(guān)系，它要求吸光度在0.20.8之間，此時光度法的誤差可控制在5%以內(nèi)。由于儀器功能和原理的限制，我們無法在測定時直觀地看到什么時候樣品的吸光度在0.20.8之間。本文提出的這兩種方法也僅只能在一定范圍內(nèi)進行校正，由于各種原因，我們還無法從根本上解決產(chǎn)生誤差的原因，而且產(chǎn)生誤差的原因除了上面提到的外，還有一些是屬于機理上的原因，所以兩種校正方法也還需進一步地完善。在表4.的結(jié)果中，我們進行了樣品萃取時間和體積的優(yōu)化選擇。試驗表明：萃取體積50ml、萃取時間30min，從試劑的節(jié)省、時間的節(jié)約以及萃取回收率的高低綜合考慮，是最佳條件。結(jié)束語 糖的測定一直以來都是煙草化學(xué)分析中的重要項目，由于分析方法的不統(tǒng)一、使用儀器的不同，除了儀器方法和國標(biāo)方法的差異外，還有不同儀器之間的差異，甚至同一種儀器由于操作情況不