構(gòu)建shRNA干擾穩(wěn)定細(xì)胞系ppt課件.ppt

創(chuàng)造價(jià)值 追求卓越 BioChen出品 構(gòu)建shRNA干擾穩(wěn)定細(xì)胞系 設(shè)計(jì)siRNA序列根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)shRNA片段構(gòu)建shRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)干擾效果構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系 1 選擇設(shè)計(jì)siRNA 而不是shRNA 輸入基因的登錄號(hào)或者序列 使用默認(rèn)參數(shù)或者按需修改參數(shù) 使用BLOCK iT RNAiDesigner設(shè)計(jì)siRNA序列 2 綜合Rank Tushcl規(guī)則 選擇3條左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 siRNA不是100 有效果的 使用BLOCK iT RNAiDesigner設(shè)計(jì)siRNA序列 3 pRNAT U6 1 Neoisdesignedformammaliantransfection ItcarriesaNeomycinresistancegeneastheselectablemarker whichcanbeusedforestablishingstablecellline TheGFPmarker coralGFP cGFP underCMVpromotercontrolcanbeusedtotrackthetransfectionefficiency ItusesU6promoterforsiRNAexpression 索取質(zhì)粒 請(qǐng)聯(lián)系 QQ 676743449 pRNAT U6 1 Neo質(zhì)粒 4 右圖是pSUPER質(zhì)粒的設(shè)計(jì)圖 與pRNAT U6 1 Neo區(qū)別不大 序列轉(zhuǎn)換工具 反向 互補(bǔ) 反向互補(bǔ) shXRN1 S shXRN1 AS 59nt 送到DNA合成公司按照合成引物的方式合成 根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)shRNA合成片段 5 1 將合成的兩條鏈稀釋成10uM 各取10ul 退火 95度5分鐘 緩慢降至室溫 可以用PCR儀做 2 用BamHI和HindIII將pRNAT U6 1 Neo質(zhì)粒切開 質(zhì)粒不需要很多 但務(wù)必切干凈 回收 3 連接 2ul載體 1ul酶 4ul5Xbuffer 13ul片段 轉(zhuǎn)化 4 挑單克隆 搖菌 提質(zhì)粒 酶切 BamHI HindIII 驗(yàn)證 質(zhì)粒多切一點(diǎn) 如果切出60bp左右的帶是陽性克隆 5 送測(cè)序 質(zhì)粒構(gòu)建 6 將shRNA干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 提取mRNA做半定量PCR 或者提取蛋白做western檢測(cè)干擾效果 如下圖 sh1和sh2有效果 sh3沒有效果 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)干擾效果 7 構(gòu)建shRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 將pRNAT U6 shRNA質(zhì)粒用BglII酶切線性化 必須的 可以增加整合效率 回收 轉(zhuǎn)染進(jìn)10cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)加G418篩選 不同細(xì)胞對(duì)G418敏感情況不一樣 之前需要做好濃度測(cè)試 Hela細(xì)胞對(duì)應(yīng)的G418濃度 大概是500ug ml 1000ug ml 一開始細(xì)胞會(huì)大量死去 10cm皿傳6cm 6cm皿傳3 5cm皿 細(xì)胞太稀不利于生長 之后細(xì)胞會(huì)增長 3 5cm皿傳6cm皿 6cm皿傳10cm皿 當(dāng)90 以上的細(xì)胞都有熒光之后 這個(gè)穩(wěn)定細(xì)胞系差不多就成功了 然后做一下實(shí)時(shí)定量PCR或者western檢測(cè)一下干擾效果 就可以用于更進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)了