（中醫(yī)骨傷科學(xué)專業(yè)論文）兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞與三種支架材料的體外實驗研究.pdf

目錄 中文摘要 1 英文摘要 3 1 l l 日i j 吾 一 一 一 一 一 6 正文 第一章 兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞體外培養(yǎng)及鑒定的實驗研究 8 1 實驗材料 8 2 實驗方法 1 2 3 實驗結(jié)果 1 5 4 討論 1 7 5 小結(jié) 2 0 6 參考文獻 2 1 第二章 兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞與三種支架材料的復(fù)合培養(yǎng) 2 3 1 實驗材料 2 3 2 實驗方法 2 4 3 實驗結(jié)果 2 6 4 討論 3 4 5 小結(jié) 3 7 6 全文結(jié)論 3 8 7 參考文獻 3 9 致謝 4 1 附圖 4 2 文獻綜述 4 9 作者簡介 5 6 f i i ii 1 111 1 11 1 111 11 11111l y 17 9 318 8 兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞與三種支架材料的體外實驗研究 研究生 張善濤 中文摘要 對通過酶消化法獲取的兔尺骨皮質(zhì)骨細胞進行鑒定 探討其體外生長 增殖能力 的作為種子細胞的代數(shù) 檢測兔皮質(zhì)骨成骨細胞在自制小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干 x k c f d b 系列同種骨 及可吸收性明膠海綿三種支架上的生長情況 對三種支 與兔皮質(zhì)骨成骨細胞的生物相容性進行評價 并用不同的細胞密度與三種支架材 培養(yǎng) 探求合適的細胞接種密度 為骨組織工程的細胞來源 載體材料的選擇和 動物體內(nèi)試驗提供實驗依據(jù) 結(jié)果 兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞體外培養(yǎng)與鑒定的實驗研究 從3 月齡新西蘭大白兔 雌雄不限 獲取尺骨皮質(zhì)骨 通過酶消化法獲取原代細胞 適時傳代 每日倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及增殖特征 m t t 法檢測細胞生長和增殖 情況 繪制生長曲線 檢測第2 3 6 7 和8 代細胞a l p 行a l p 染色 i 型膠原免疫組織 化學(xué)染色及骨鈣素免疫組化染色 對細胞進行鑒定 結(jié)果 分離培養(yǎng)出的原代細胞 形 態(tài)類似成纖維細胞 具有良好的體外增嫡能力 細胞倍增時間約為7 天 各項染色檢測 呈強陽性 細胞增殖速度 第l 2 天 各代細胞無差別 p 0 0 5 第3 天開始第7 8 代 細胞落后于第2 3 和6 代細胞 一直持續(xù)到第l o 天 尺o 0 5 而第2 3 代同第6 代細胞 及第7 代同第8 代細胞之間無顯著性差異 p o 0 5 a l p 檢測 第2 3 6 代成骨細胞高 于第7 8 代細胞 尺0 0 5 第二章兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞與三種支架材料的復(fù)合培養(yǎng) 將成骨細胞接種到三種支架材料上 進行體外復(fù)合培養(yǎng) 用倒置相差顯微鏡 掃描 電鏡觀察細胞在支架材料上的生長 增殖情況 并進行m t t 細胞上架率 a l p 及骨鈣素 檢測 結(jié)果 倒置相差顯微鏡顯示三種支架為多孔網(wǎng)狀 孔隙互相通連 隨培養(yǎng)時間的 延長 細胞生長旺盛 增殖迅速 掃描電鏡顯示復(fù)合培養(yǎng)3 d 時 有較多的細胞粘附并鋪 展在支架上 培養(yǎng)6 d 時 細胞完全伸展 呈長梭形 l o d 時細胞分泌較多的細胞外基質(zhì) 重疊生長并連接成網(wǎng)狀 尤以兩種骨性材料組明顯 m t t 檢測顯示三種支架材料在實驗 前期不影響成骨細胞的生長 增殖 p o 0 5 后期 9 d 1 2 d 能促進成骨細胞的增 殖及分泌 與對照組比較有顯著性差異 尺o 0 5 而三種支架材料組之間無顯著性差 異 d 0 0 5 細胞上架率 當細胞接種密度為lx1 0 6 m l 時 可吸收明膠海綿細胞上架 率最高 為4 5 5 2 3 1 5 a l p 檢測 細胞密度為lx1 0 5 m l 時各組之間無顯著性差異 乃0 0 5 細胞密度為l 1 0 6 m l 時三種支架材料組高于對照組 p o 0 5 三種支架 材料組之間無顯著性差異 乃o 0 5 細胞密度為6 1 0 6 m l 及l(fā)x1 0 7 m l 時 可吸收明 膠海綿組 小牛脫蛋白松質(zhì)骨組 凍干松質(zhì)骨組 對照組 p o 0 5 在12 d 時細胞密度為 6 1 0 6 m l 的各組支架材料a l p 細胞密度為1 1 0 7 m l 的各組支架材料a l p 骨鈣素檢測 第1 4 天小牛脫蛋白松質(zhì)骨組及凍干松質(zhì)骨組明顯高于對照組及可吸收明膠海綿組 尺 l o 0 5 第2 1 天及第2 8 天 小牛脫蛋白松質(zhì)骨組 凍干松質(zhì)骨 可吸收明膠海綿組 對照 組 p o 0 5 結(jié)論 1 兔尺骨皮質(zhì)骨體外可以培養(yǎng)出成骨細胞 體外培養(yǎng)的成骨細胞具有增殖 分泌 功能 其中第2 3 6 代細胞增殖和分泌功能強于第7 8 代細胞 新西蘭大白兔皮質(zhì) 骨成骨細胞理想的作為種子細胞的代數(shù)為2 6 代細胞 2 三種支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細胞理想細胞接種密度為lxi 0 6 m 1 6 1 0 6 m l 隨細胞接種密度上升細胞上架率在下降 當細胞接種密度為1 1 0 6 m l 時 可吸收明膠 海綿細胞上架率最高 為4 5 5 2 3 1 5 3 在理想接種密度下 a l p 檢測 可吸收明膠海綿 小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干松質(zhì) 骨 對照組 骨鈣素檢測 小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干松質(zhì)骨 可吸收明膠海綿 對照組 4 本實驗制備的小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮質(zhì)骨成骨細胞具有良好的生物相容性及 骨誘導(dǎo)性 且制備方便 價格低廉 是很好的骨替代材料 把小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮 質(zhì)骨成骨細胞復(fù)合構(gòu)建組織工程骨 進行進一步試驗是可行的 關(guān)鍵詞 組織工程 兔皮質(zhì)骨源成骨細胞 小牛脫蛋白松質(zhì)骨 c d c b 凍干松質(zhì)骨 f d c b 可吸收明膠海綿 a g s a n i m a lt e s t i n gp r o v i d e df u r t h e re x p e r i m e n t a le v i d e n c e m e t h o d sa n dr e s u l t f i r s tp a r t r a b b i tc o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t s sc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o ni nv i t r o u l n ac o r t i c a lb o n eo b t a i n e db yo p e r a t i o nf r o m3 m o n t h o l dn e wz e a l a n dw h i t er a b b i t s n ol i m i to fm a l eo rf e m a l e w e r ed e a l tw i t he n z y m ed i g e s t i o nt oo b t a i nc e l l s 礬t hm i c r o s c o p eo b s e r v e dc e l l u l a rf o r ma n dm u l t i p l i c a t i o nc h a r a c t e r i s t i ce v e r y d a y a s s a y c e l lg r o w t ha n d p r o l i f e r a t i o nw i t hm 訂 d r a w i n gt h eg r o w t hc u r v e d e t e c t i o no f t h es e c o n d t h i r d 6t h 7 t h a n d8 t hg e n e r a t i o nc e l l s sa l p a p p r a i s a lc e l l sw i t ht h em e t h o do fs t a i n i n gc e l l sw i t ha l p i c o l l a g e na n db o n ec a l c i u me l e m e n t r e s u l t s t h ei s o l a t e da n dc u l t u r e dp r i m a r y c e l l sm o r p h o l o g yw e r es i m i l a rt of i b r o b l a s t s w i t hg o o dp r o l i f e r a t i o ni nv i t r o c e l l s sd o u b l i n gt i m ew a s a b o u t7d a y s a n da l lt e s tr e s u l t sw e r ep o s i t i v e d c e l lp r o l i f e r a t i o nr a t e t h ef i r s t1 2d a y s e a c h g e n e r a t i o no f c e l ld i dn o th a v et h ed i f f e r e n c e 伶0 0 5 f r o mt h et h i r dd a yt h e7 t h 8t hg e n e r a t i o nc e l l ss i g n i f i c a n t l yl a g g e db e h i n dt h es e c o n d t h i r da n d6t hg e n e r a t i o n c o n t i n u e dt ot h e f i r s t10d a y s p 0 0 5 w h i l es e c o n d t h i r da n d6 t hg e n e r a t i o n 7 t ha n d8 t hg e n e r a t i o nh a dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 侈0 0 5 a l p t h es e c o n d t h i r da n d6 t hg e n e r a t i o no f o s t e o b l a s t s a l pe x a m i n a t i o nw e r eh i g h e rt h a nt h e7 t h 8 t hg e n e r a t i o no fc e l l s sa l p p 0 0 5 t h ec e l ld e n s i t yw a slxl0 6 m l t h r e ek i n do fs u p p o r tm a t e r i a lg r o u pw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p p s e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e f e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e c o n t r o lg r o u p t h e12 d e a c hg r o u po f s u p p o r tm a t e r i a la l p w h e nt h ec e l ld e n s i t yw a s6 x10 0 m l e a c hg r o u po fs u p p o r tm a t e r i a l a l pw h e nt h ec e l ld e n s i t yi s1 107 m 1 b g p t h e14 t hd a y s e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e d c a n c e l l o u sb o n ea n df r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n eg r o u pw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o l g r o u pa n da b s o r b a b i l i t yg e l a t i ns p o n g eg r o u p p f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e a b s o r b a b i l i t y g e l a t i ns p o n g e c o n t r o lg r o u p p s e l f m a d ec a l f d e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e c o n t r o lg r o u p b g p s e l f m a d e c a l f d e p r o t e i n i s e d c a n c e l l o u sb o n e f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e a b s o r b a b i l i t yg e l a t i n s p o n g e c o n t r o lg r o u p 4 t h es e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n et h a tt h i se x p e r i m e n tm a d ew i t ht h er a b b i t 4 u l n ac o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t sh a sg o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t ya n d b o n ei n d u c t i v i t y m o r e o v e ri tp r e p a r e dc o n v e n i e n t l y h a st h el o wp r i c e s oi ti st h ev e r yg o o db o n es u b s t i t u t i o n m a t e r i a l t h es e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n ea n dt h er a b b i tu l n ac o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t sc o n f o r m e dt oc o n s t r u c to r g a n i z a t i o np r o j e c tb o n e a n dc a l t yo nf u r t h e r e x p e r i m e n ti sf e a s i b l e k e yw o r d s t i s s u ee n g i n e e r i n g r a b b i tc o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t s c a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e c d c b f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e f d c b a b s o r b a b i l i t y g e l a t i ns p o n g e a g s 5 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 前言 脊柱和四肢常因感染 損傷 畸形 腫瘤 手術(shù)等原因 造成較大骨缺損 僅靠殘 留骨組織的自身修復(fù) 往往難以滿足機體結(jié)構(gòu)和功能的需求 因此骨組織缺損的修復(fù)仍 然是困擾骨科界的一大難題 這尤其表現(xiàn)在不能接受自體骨移植的移植 骨質(zhì)疏松的老 年人或大段骨缺損的病人上 傳統(tǒng)的治療方法有自體骨移植 異種骨移植和生物材料替 代等 這些方法均不同程度地存在著來源困難 免疫排斥及成骨能力不確定等缺點 在 對較大骨缺損進行骨移植時 新骨形成之前移植骨可能已被機體吸收 造成植骨失敗 而組織工程的創(chuàng)立和發(fā)展 為骨的修復(fù)與重建提供了新的思路和方法 成為骨缺損修復(fù) 研究的突破點 組織工程學(xué) t i s s u ee n g i n e e r i n g 是2 0 世紀8 0 年代提出的一門新興的交叉學(xué) 科 主要是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理和技術(shù) 在體外構(gòu)建具有生物功能的人工 取代物 以修復(fù)組織缺損 替代失去功能或衰竭的組織和器官的部分或全部功能 它包 括了生物學(xué) 工程學(xué) 醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域的交叉和融合 它指應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的方 法 利用細胞 合成材料 處理過的天然材料和組織 細胞因子和基因技術(shù)使組織重新 構(gòu)建和再生 從而完成缺損組織的修復(fù)或器官解剖與功能的重建 骨組織工程是其重點 研究對象之一 其基本技術(shù)路線是 采集功能相關(guān)的健康而有生命的細胞 將其種植于 具有一定結(jié)構(gòu)的支架上 然后將經(jīng)初步分裂繁殖后的細胞群落與支架復(fù)合體植入體內(nèi) 形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織和器官 據(jù)組織工程學(xué)原理 骨組織工程的研究內(nèi)容包 括支架材料 種子細胞 誘導(dǎo)因子和組織工程骨構(gòu)建方式等多個方面 目前骨組織工程 的構(gòu)建主要有三種方式 支架骨 種子細胞 支架材料 生長因子 支架材料 種 子細胞 生長因子 骨組織工程材料不僅影響種子細胞的生物學(xué)特性和培養(yǎng)效率 而且決定移植后能否 與受體很好地適應(yīng)并結(jié)合在一起 從而發(fā)揮其修復(fù)骨缺損地作用 因而在目前骨組織工 程的研究中 尋找理想地支架材料是一大熱點 理想的骨組織工程細胞載體材料的要求 有 良好的生物相容性 如無毒 不致畸性等外 還應(yīng)利于種子細胞粘附 增殖 不 引起炎癥反應(yīng) 甚至利于細胞生長和分化 支架完成支持作用后應(yīng)能完全降解 降解 速度與降解時間可人為調(diào)控與組織細胞生長率相適應(yīng) 具有三維立體多孔結(jié)構(gòu) 孔隙 率最好達9 0 以上 具有較高的面積體積比 利于細胞粘附生長 細胞外基質(zhì)沉積 營 養(yǎng)和氧氣進入 代謝產(chǎn)物排出 也有利于血管和神經(jīng)長入 一定的機械強度 為新生 組織提供支撐 并保持一定時間直至新生組織具有自身生物力學(xué)特性 良好的材料一 細胞界面 材料應(yīng)能提供良好的細胞界面 利于細胞粘附 增殖 更重要的是能激活細 胞特異基因表達 維持細胞正常表型表達 易消毒性 組織工程中種子細胞的選擇也是備受關(guān)注的焦點 目前國內(nèi)大多數(shù)試驗室以骨髓基 質(zhì)細胞作為種子細胞 但該途徑具有定向誘導(dǎo)分化難 細胞表型不穩(wěn)定等缺點 骨皮質(zhì) 來源成骨細胞目前研究比較少 但據(jù)國內(nèi)學(xué)者研究表明 骨皮質(zhì)培養(yǎng)成骨細胞是可行的 成熟的成骨細胞在體內(nèi)不發(fā)生增殖 但是體外培養(yǎng) 在合適的條件下 成骨細胞可以大 6 兔皮質(zhì)骨米源成骨細胞與三種支架材料的體外實驗研究 量增殖 目前其常用的培養(yǎng)方法是酶法和組織塊法 二者各有優(yōu)缺點 本實驗屬南京軍區(qū) 十一五 重點計劃課題 0 6 2 2 9 子項目及福建省青年科技人 才創(chuàng)新項目 2 0 0 4 f 3 1 4 6 子項目 前期的實驗已經(jīng)證實通過酶消化法可以從兔尺骨皮 質(zhì)骨獲得細胞 且已與其它組織來源的細胞進行了比較研究 本實驗對采用酶消化法獲 得的細胞進行進一步鑒定 探求合適代數(shù)的成骨細胞作為種子細胞 然后把種子細胞與 自制小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干松質(zhì)骨 可吸收明膠海綿三種支架材料復(fù)合培養(yǎng) 對三種 支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細胞的生物相容性進行評價 并用不同的細胞密度與三種支架 材料復(fù)合培養(yǎng) 選取理想的細胞接種密度 同時對三種支架材料進行對比 為骨組織工 程的細胞來源 載體材料的選擇和進一步動物體內(nèi)試驗提供實驗依據(jù) 7 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 第一章兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞體外培養(yǎng)及鑒定的實驗研究 1 實驗材料 1 1 試驗地點及動物 本實驗在廈門大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心完成 實驗室內(nèi)配備專用的動物實驗室及 標準的細胞培養(yǎng)實驗問 見圖1 一圖2 實驗動物為3 月齡新西蘭大白兔8 只 雌雄不 限 購自上海動物醫(yī)學(xué)中心 1 2 主要試劑與儀器 見表1 表2 和圖3 圖6 1 3 主要溶液配制 1 3 1 常規(guī)培養(yǎng)基 d m e m f 1 2 培養(yǎng)基干粉一袋 超純水7 0 0 m l 攪拌溶解 加入n a h c o 1 2 g 定容至1 0 0 0 m l 用n a o h 或者h c l 調(diào)節(jié)p h 值為7 0 7 2 過濾后p h 可上升0 2 0 3 以 蔡氏過濾器0 4 5 u m 和0 2 2 u m 雙層濾膜過濾除菌 2 0 0 m l 每瓶分裝 4 c 冰箱儲存?zhèn)溆?使 用前添加1 0 胎牛血清和1 雙抗 青霉素1 0 0 0 0u m 和鏈霉素1 0 0 0 0ug m 1 靜置1 2 2 4 小時后可使用 1 3 20 1 m o l lp b s a 不含鈣 鎂的磷酸鹽緩沖液 n a c l8 o g k c l0 2g k h p 0 40 2 g n a h p o 1 2 h 02 8 9 9 加超純水7 0 0 m l 攪拌溶解 鹽酸調(diào)節(jié)p h 7 2 定容至1 0 0 0m l 高壓蒸汽滅菌2 0m i n 分裝2 0 0 m l 每瓶 4 儲存?zhèn)溆?1 3 30 2 5 的胰蛋白酶 用少許p b s 將2 5 0 m g 胰蛋白酶粉末調(diào)成糊狀 再謇b p b s 至1 0 0m l 攪拌溶解 力h n a h c o 調(diào)p h 8 0 左右 室溫放置4h 或4 c 冰箱過夜 超凈臺內(nèi)用0 2 2 ji n 孔徑的一次性濾器過濾除菌 用離心管1 0m l 每管分裝 2 0 c 保存 使用前3 7 c 水浴 溶解 1 3 4o 1 的i 型膠原酶 用少許p b s 將l o o m gi 型膠原酶粉末調(diào)成糊狀 再卒b p b s 至l o o m l 攪拌溶解 力f l n a h c o 調(diào)p h 8 o 左右 室溫放置4h 或4 c 冰箱過夜 超凈臺內(nèi)用0 2 2um 孔徑的濾器過濾除菌 用1 5 m l 離心管分裝 l o m l 每管 2 0 c 保存 使用前3 7 c 水浴溶 解 1 3 5 噻唑藍 m 1 1 稱取2 5 0 m g 噻唑藍粉末 加入5 0 m l 的p b s 攪拌溶解 超凈臺內(nèi)過濾 4 c 避光保存 有效期1 4 天 1 3 6p n p p a m p 溶液 p n p p2m m m g c l 2 m m a m p0 i m a m p 2 氨基 2 甲基一卜丙醇 0 9 m l 9 9 純度 p n p p 對硝基苯磷酸二鈉 六水 0 0 7 4 2 9 m g c l 2 6 h 00 0 4 0 6 6 9 先把p n p p m g c l 溶解于l o o m l 的超純水 過濾除菌 4 c 儲存 使用前加入a m p 1 3 70 2 結(jié)晶紫溶液 0 2 9 結(jié)晶紫 溶于l o o m l 超純水 攪拌后 4 c 保存?zhèn)溆?1 3 8 電鏡制樣中常用固定劑的配制方法 1 3 8 1 磷酸緩沖液 0 2 m 甲液 n a h p o 1 2 h 0 7 1 6 4 9 3 5 8 2 r 兔皮質(zhì)骨米源成骨細胞與三種支架材料的體外實驗研究 加蒸餾水溶解成1 0 0 0 m l 5 0 0 m 1 乙液 n a h p o 2 h 03 1 2 1 9 1 5 6 0 5 加蒸餾水溶解成l0 0 0 m l 5 0 0 m 1 按下表混合甲 乙兩液即得所需p h 的磷酸緩沖液 表l o 2 m 的磷酸緩沖液的配制 5 0 m 1 p h6 46 6 6 8 7 07 27 4 甲液 m 1 1 3 31 8 82 4 5 3 0 5 3 6 04 0 5 乙液 m 1 3 6 73 1 22 5 51 9 51 4 o9 5 1 3 8 2 固定液 2 5 戊二醛磷酸緩沖溶液 0 2 m 磷酸緩沖液5 0 m l 2 5 戊二醛水 溶液l o m l 加水定容至l o o m l 1 3 8 3 梯度乙醇液 3 0 3 份純乙醇液 7 份超純水 5 0 5 份純乙醇液 5 份超純水 7 0 7 份純乙醇液 3 份超純水 9 0 9 份純乙醇液 1 份超純水 9 5 9 5 份純乙醇液 0 5 份超純水 1 0 0 直接使用純乙醇液 1 3 8 4 醋酸異戊酯 乙醇 1 1 v v 配制 9 對硝基苯磷酸二鈉 p n p p 2 氨基 2 甲基 1 丙醇 a m p 酶免骨鈣素 t r i t o nx 1 0 0 超純水 培養(yǎng)皿 1 0 0 m i n 6 0m m 3 5 m m 細胞培養(yǎng)板 2 4 孔 9 6 孔 e p p e n d o f f 管 2m 1 離心管 1 5m l 5 0 m i 微孔移液槍 2 2 0 1 0 0 1 0 0 0 1 a l 微孔濾膜 o 4 5 岬 o 2 2t t m 血球計數(shù)板 凍干松質(zhì)骨 x k c f i b 系列同種骨 s i g m a a c r o s 美國a d l a m r e s c o 廈門大學(xué)物理微機電中心 c o m i n g c o m i n g 上海生物工程技術(shù)公司 f a l c o n f i n n p i p e t t e 上海市新亞凈化器廠 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠 北京鑫辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司 可吸收性明膠海綿 南京金陵藥業(yè)股份有限公司 一一 1 0 電子天平 酶標儀 恒溫磁力攪拌器 b s 2 0 0 s w e 北京采多利斯 滅j i 公j d e l x 8 0 0 8 5 1 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器l d z x 4 0 b i 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 超低溫冰箱 離心機 倒置相差顯微鏡 熒光顯微鏡 掃描電鏡 d h g 9 1 4 0 a d f 8 5 1 4 k a 1 0 0 0 a e 2 0 a x i o v e r t2 0 0 b i o t e k 固 仁f u 器有限公i d i 海中立醫(yī)療器械廠 1 海褙宏實驗設(shè)備有限公i d 美圍兩盟公ld 飛鴿牌 m o t i c c a r iz e i s s x l 3 0 e x e m p h l i p s 福建中醫(yī)約人學(xué)碩十學(xué)何論文 2 實驗方法 2 1 兔皮質(zhì)骨細胞的獲取及培養(yǎng) 2 1 1 原代細胞的獲取及培養(yǎng) 取材前清洗并紫外消毒實驗室 采用高壓蒸汽或過濾方法滅菌實驗用品 準備如下 用品 新西蘭兔 硫化鈉 脫毛 速眠新 碘伏 酒精 注射器 手術(shù)刀 鑷子 血 管鉗 骨錘 組織剪 線剪 無菌紗布 手套 帽子 口罩 手術(shù)衣 手術(shù)布巾 1 5 m l 離心管 見圖7 一圖8 3 月齡的新西蘭大白兔稱重為2 k g 左右 雌雄不限 用脫毛劑硫化 鈉去毛后 皮下注射麻藥速眠新 0 2 0 3m l k g 觀察動物肌肉松弛后局部消毒 鋪 巾 見圖9 切開皮膚皮下組織 鈍性撥開肌肉 暴露肱骨 尺骨 徹底去除尺骨上的 軟組織 用手術(shù)刀片取尺骨上的皮質(zhì)骨 見圖1 0 注意不打通髓腔 將骨皮質(zhì)置于1 5 m l 裝有含雙抗的p b s 液的離心管中 迅速轉(zhuǎn)移至細胞問 然后將組織塊轉(zhuǎn)移j u l o o m m 培養(yǎng)皿 中 以含雙抗的無鈣 鎂p b s p b s a 液反復(fù)沖洗至沖洗液無血色和雜質(zhì) 用眼科剪將 皮質(zhì)骨片反復(fù)剪切成1 2 m m 2 大小 過程中注意保持骨片濕潤 然后將組織塊用0 2 5 胰酶 消化3 0 m i n 1 去除消化液 重復(fù)消化5 次 然后加培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 0 j 時后去除培養(yǎng)基 加入胰酶消化3 0 m i n 加入適量培養(yǎng)基終止消化 取上清液離心l o m i n 1 0 0 0 r m i n 沉 淀物用培養(yǎng)液懸浮 接種于培養(yǎng)皿內(nèi) 重復(fù)3 次 直至離心后無沉淀物 3 天后觀察換液 以后每2 天換液一次 并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 貼壁 生長情況 2 1 2 細胞的傳代及培養(yǎng) 待細胞長至瓶底9 0 面積時 進行消化傳代 傳代過程如下 1 棄去舊的培養(yǎng)基 加入2 m lp b s 清洗2 次 2 加入0 2 5 胰蛋白酶l m l 搖晃培養(yǎng)皿 確保胰酶覆蓋整個培 養(yǎng)皿底 3 1 0 3 鐘后 棄胰酶液 重新加入0 2 5 胰蛋白酶2 m l 消化5 l o m i n 4 倒置相差顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)細胞變圓 細胞間隙增大 細胞隨液體移動時棄消化液 或者直接加入5 m ld m e m f 一1 2 培養(yǎng)基終止消化 用吸管反復(fù)輕輕吹打 制造細胞懸液 5 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到1 5 m 1 離心管中 以1 0 0 0 轉(zhuǎn) 分 r p m 離 5 8 m i n 棄上清 加入培養(yǎng)基 重新懸浮細胞 用差速貼壁法純化細胞 以1 3 比例傳代 于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 1 3 細胞計數(shù) 傳代時 取2 0 u l 細胞懸液 從蓋玻片交接處滴入細胞計數(shù)池中 在1 0 倍物鏡的倒置 顯微鏡下 調(diào)焦找到細胞 分別計數(shù)細胞計上四個角落中由橫豎各3 條并行線組成的1 6 個小格上的細胞 細胞團計數(shù)為1 如果細胞壓在線上 則數(shù)上不數(shù)下 數(shù)左不數(shù)右 用以下計算公式 四大格中細胞數(shù)x1 0 0 0 0 4 計數(shù)單位以個 m l 表示 2 2 兔皮質(zhì)骨細胞的觀察及檢測 2 2 1 倒置相差顯微鏡觀察 每天觀察各代細胞的形態(tài)特征 生長及增殖情況 并照相 2 2 2 結(jié)晶紫染色細胞形態(tài)觀察 待細胞基本長滿皿底后行染色 去除培養(yǎng)液 p b s 沖洗兩次 加入l m l1 0 的中性緩 沖福爾馬林固定 3 0 分鐘后吸除福爾馬林 用去離子水沖洗兩遍 風(fēng)干 每孔加入l m l0 2 兔皮質(zhì)骨來源成骨 細胞與二種支架材料的體外實驗研究 的結(jié)晶紫溶液 室溫下染色3 0 分鐘 然后用超純水多次沖洗 直到?jīng)_沈液基本無色 于 倒置顯微鏡下觀察 拍照 2 2 3m t t 法測各代細胞生長曲線 消化收集第2 3 6 7 和8 代細胞 調(diào)整細胞密度為lx1 0 5 個細胞 m l 以每孑l 1 5 0 i ll 接種于9 6 孔培養(yǎng)板中 每代細胞設(shè)1 0 塊板 每板設(shè)6 孔 置入3 7 c 5 c 0 2 飽和濕 度孵箱內(nèi)培養(yǎng) 2 天換液一次 于接種后第l l o d 每天每代細胞各取出一塊培養(yǎng)板用m t t 法測成骨細胞的光吸收值 a 4 9 2 每孔加5 m g m 1m t t 溶液2 0u1 3 7 2 5 c 0 2 飽和濕 度孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h 后 小心吸棄孔內(nèi)上清液 p b s 液輕洗3 次 每孔加入二甲亞砜1 5 0 pl 振蕩l o m i n 使沉淀充分溶解后 選擇4 9 2 n m 波長 在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的 光吸收值 a 僦 記錄結(jié)果 并以時間為橫軸 光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線 2 2 4 各代細胞堿性磷酸酶 a l p 檢測 把第2 3 6 7 和8 代成骨細胞分別制成lx1 0 6 m l 的細胞懸液 以6 0 u 1 分別接種于 2 4 孔細胞培養(yǎng)板中 每代設(shè)2 4 個復(fù)孔 分別于第6 8 1 0 1 2 天去除培養(yǎng)基 每代細胞 每次取6 孔 然后 向每孔中力n 2 0 0ul0 5 的t r i t o n x 一1 0 0 并放置過夜 最后 向每 孔中力n 2 0 0ul 的p n p p a m p 溶液 含p n p p2m m o l l m g c l 2m m o l l a m p0 1m o l l 的 水溶液 并于3 7 c 孵育3 0 m i n 用4 0 0i j ll m o l ln a o h 終止反應(yīng) 用紫外分光光度計 b e c k m a nc o u l t e rd u8 0 0 于4 0 5 n m 處檢測上清液的吸光值 a 4 0 5 2 2 5 細胞a l p 染色 取第3 代細胞 接種于預(yù)置蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板 普通培養(yǎng)液培養(yǎng) 2 天換液一次 培養(yǎng)7 天取出蓋玻片 按照以下方法操作 1 將培養(yǎng)板用冷丙酮在4 0 冰箱內(nèi)固定1 8 2 4 小時 2 放入孵育液中置于3 7 c 溫箱或水浴內(nèi)孵育1 0 3 0 分鐘 3 蒸餾水稍沈 4 2 硝酸鉆水溶液處理2 5 分鐘 5 蒸餾水速洗一次 6 1 硫化胺水溶液處理l 2 分鐘 7 流水沖洗數(shù)分鐘 8 自然脫水 于光學(xué)顯微鏡下觀察 2 2 6i 型膠原免疫組織化學(xué)染色 取第3 代細胞 接種于預(yù)置蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板 普通培養(yǎng)液培養(yǎng) 2 天換液一次 培養(yǎng)1 2 天取出蓋玻片 以p b s 洗滌三次 9 5 酒精固定2 0 分鐘 按照以下方法操作 1 3 過氧化氫孵育5 1 0 分鐘 以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 2 蒸餾水沖洗2 分鐘x 3 次 加5 正常山羊血清封閉 室溫下2 0 分鐘 3 棄去多余液體 滴加5 0 u l 鼠i 型膠原單克隆抗體中作液 3 7 c 孵育1 小時 4 c 冰箱過夜 4 0 0 1 m p b s 漂洗3 分鐘x 3 次 5 滴加生物素化羊抗鼠i g g 中作液5 0 u 1 3 7 c 孵育1 小時 1 3 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 6 0 0 1 m p b s 漂沈3 分鐘x3 次 7 滴加5 0 u l s a b c 復(fù)合液 3 7 孵育1 5 分鐘 8 0 0 1 m p b s 漂洗3 分鐘 3 次 9 滴加i o o u l d a b 顯色液 室溫顯色3 1 0 分鐘 光鏡下控制顯色時間 1 0 蒸餾水反復(fù)洗滌以終止反應(yīng) 蘇木素復(fù)染 脫水 透明 封片 2 2 7 骨鈣素免疫組化染色 染色方法同i 型膠原免疫組化染色 操作過程中使用的抗體 一抗為骨鈣素抗血清 二抗為生物素化羊抗人i g g 2 3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用s p s s l 3 0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理 各組數(shù)據(jù)均以均數(shù) 標準差 s 表示 采用t 檢驗和單因素方差分析 o n e w a ya n o v a 檢驗 各檢測時點兩兩比較采用 l s d 法進行統(tǒng)計學(xué)分析 尺0 0 5 有統(tǒng)計學(xué)意義 1 4 兔皮質(zhì)骨米源成骨細胞與三種支架材料的體外實驗研究 3 實驗結(jié)果 3 1 倒置相差顯微鏡觀察 3 1 1 原代細胞觀察 倒置相差顯微鏡下可見新接種的細胞懸浮于培養(yǎng)液中 為圓形透亮細胞 見圖1 1 4 5 h 后細胞開始貼壁 2 4 h 后細胞大部分貼壁 呈長梭形 短梭形及橢圓形 第2 3 d 細胞開始增殖 形態(tài)以長梭形為主 也有部分短梭形 見圖1 2 第4 5 d 細胞增殖明 顯 形成多個相對獨立的細胞簇 細胞由簇中央向周圍生長 第7 8 d 細胞繼續(xù)增殖 并連成單層片狀 形態(tài)以帶長 短梭形為主 見圖1 3 第9 l o d 細胞長滿培養(yǎng)皿底 見圖1 4 細胞形態(tài)較均一 多為長梭形 短梭形 也有少量呈三角形 3 1 2 傳代細胞觀察 倒置相差顯微鏡下可見 1 6 代細胞形態(tài)同原代細胞無明顯差異 初期細胞在培養(yǎng) 液中呈圓形 2 h 后細胞貼壁 4 6 h 后 大部分細胞貼壁 形態(tài)以長梭形為主 也有少 量三角形 細胞之間相互連接 突起較短 2 4 h 后 細胞完全貼壁 第3 4 d 細胞增殖 明顯 以長梭形 三角形為主 8 9 d 細胞長滿培養(yǎng)皿底 從第7 代細胞丌始見少量空 泡細胞 細胞貼壁時間延長 4 6 h 開始貼壁 增殖速度減慢 第4 6 d 細胞丌始增殖 連續(xù)培養(yǎng)l o d 細胞仍未長滿培養(yǎng)皿底 3 1 3 細胞結(jié)晶紫染色后的觀察 各代細胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后 細胞形態(tài)如上述 但細胞之間的連接 細胞質(zhì) 細胞 核以及核仁更加清晰可見 見圖1 5 細胞基本形狀為長梭形 胞內(nèi)有一個細胞核 容 納l 3 個核仁 核漿比例為1 4 1 2 不等 細胞之間分界清楚 但突起相互交織在一起 使細胞連成一片 核漿比例較小 單核 核仁一般為l 2 個 處于分裂期時雙核 可有 5 6 個核仁 而且細胞分解更加清晰 見圖1 6 各種細胞胞漿呈藍色或淡藍色 黑白 照呈灰黑色 細胞核圓形或橢圓形 淡染 核仁呈小圓點 深藍色 3 2 各代細胞生長與增殖測定 5 種不同代數(shù)的細胞增殖過程如表3 所示 生長過程分為生長緩慢的潛伏期 增殖 迅速的對數(shù)生長期及生長相對緩慢的平臺期 5 代細胞其大致增殖時間為 第1 2 d 細 胞數(shù)量無明顯增加 第3 d 開始細胞數(shù)量明顯增加 在第7 8 d 達到最高峰 然后進入緩 慢的增殖期 細胞增殖速度 第1 2 天 各代細胞增殖無差別 乃o 0 5 第3 天開始第7 8 代細胞增殖速度明顯落后于第2 3 和6 代細胞 尺0 0 5 而第2 3 同6 代及第7 代 同第8 代細胞之間并無明顯差別 乃0 0 5 福建中醫(yī)約人學(xué)碩十學(xué)位論文 o 6 o 5 0 4 o 3 0 d 值 o 2 o 1 0 一貧j 2 代 德3 代 i 罵 笫6 代 笫7 代 d 一筇8 代 一 磊 7 多q 么 j 豫 f 一一 瘤 1 7 i t m h m 描 l d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d1 0 d 表3m t t 法檢測不同代數(shù)細胞生長曲線 f i g3t h eg r o w t hc u r v e so fc e l l sf r o md i f f e r e n tg e n e r a t i o nb ym t t 3 3 各代細胞a l p 表達情況 如表4 示 各代成骨細胞都隨著培養(yǎng)時間的延長a l p 活性不斷增高 在培養(yǎng)初期第 2 3 和6 代成骨細胞a l p 檢測明顯高于第7 8 代成骨細胞 而第2 3 與6 代及第7 代與第8 代之問無顯著性差異 隨培養(yǎng)時問的延長這種差異不斷擴大 在第1 2 天時這 種差異尤為明顯 p 0 0 5 與第3 代比較 p 0 0 5 與第2 3 6 代比較 p 0 0 5 3 4 細胞a l p 染色 細胞培養(yǎng)7 天行a l p 染色 a l p 染色呈陽性 細胞呈灰黑色 胞漿內(nèi)有灰黑色顆粒 沉淀 見圖1 7 a l p 染色陽性細胞數(shù) 7 0 3 5i 型膠原免疫組織化學(xué)染色 經(jīng)染色后可見胞漿內(nèi)及細胞間有大量的棕黃色顆粒存在 明顯的強陽性 見圖1 8 3 6 骨鈣素免疫組化染色 細胞胞漿內(nèi)有大量棕黃色顆粒存在 呈明顯的強陽性 見圖1 9 1 6 兔皮質(zhì)骨米源成骨細胞與三種支架材料的體外實驗研究 4 討論 4 1 成骨細胞的來源問題 成骨細胞的生物學(xué)特性直接影響組織工程化活性骨的質(zhì)量 因此 對成骨細胞的研 究是骨組織工程重要內(nèi)容之一 成骨細胞來源多樣 細胞取材常用的機體來源有動物如 猴 羊 豬 狗 兔 鼠等 胚胎及人類遺棄的組織或者新鮮尸體等 而其組織來源又 包括 骨膜 骨松質(zhì) 骨皮質(zhì) 骨髓基質(zhì)干細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞 骨外間充質(zhì)干細 胞 胚胎干細胞等 1 這些細胞來源各有優(yōu)缺點 骨髓干細胞因取材較方便 具有多向 分化潛能 條件誘導(dǎo)下可向成骨細胞分化 是一種很有前途的種子細胞來源 是目前常 用的種子細胞之一 但干細胞需要分離純化 且干細胞向成骨細胞分化 需要一定的誘 導(dǎo)條件 誘導(dǎo)成功后仍可能存在分化不夠穩(wěn)定等問題 近年來松質(zhì)骨來源的成骨細胞的 研究很多 3 松質(zhì)骨主要是疏松的骨小梁成分 來源廣泛 具有培養(yǎng)過程簡單 細胞增 殖較快等優(yōu)點 但骨小梁上有骨內(nèi)膜 且小梁間有很多骨髓成分 細胞成分 雜質(zhì)較多 摻有不少成纖維細胞和造血細胞等 成骨細胞成份相對不純 另一種常用的組織來源為 骨膜 細胞耿材常用的 般是外骨膜 其分為內(nèi)外兩層 內(nèi)層較薄 結(jié)締組織較疏松 纖維較少 除了豐富的小血管和神經(jīng) 還含有較多的成骨細胞 骨原細胞和未分化的干 細胞t 4 1 生長時期 骨膜來源的成骨細胞在機體內(nèi)具有很強的成骨能力 成年骨膜在創(chuàng) 傷應(yīng)激下聚集較多促骨生長因子 5 1 而有很強的再生骨能力 因此骨膜來源的成骨細胞 具有較強的成骨能力和增殖速度 但由于其取材困難 容易摻雜肌肉組織 膠原成分較 多 容易混雜成纖維細胞及細胞容易污染等缺點 也限制了其作為種子細胞的廣泛應(yīng)用 關(guān)于骨皮質(zhì)來源的成骨細胞目前研究比較少 骨皮質(zhì)是由許多哈佛氏骨單位規(guī)則排 列而成的 發(fā)育中的骨單位表面具有活躍的成骨細胞 骨形成單位有1 0 0 4 0 0 個細胞 t 6 1 可不斷形成類骨質(zhì) 經(jīng)鈣化后成為新骨 此后成骨細胞一部分轉(zhuǎn)化為骨細胞 部分 仍位于骨表面 并成為扁平的內(nèi)襯細胞 在力學(xué)刺激及誘導(dǎo)下 4 8 小時后 可向成骨 細胞轉(zhuǎn)換 但不發(fā)生增殖 電鏡下觀察皮質(zhì)的成骨細胞后方總有一兩層激活的間充質(zhì)細 胞和前成骨細胞 可向成骨細胞分化 據(jù)國內(nèi)學(xué)者研究表明 7 1 骨皮質(zhì)培養(yǎng)成骨細胞是 可行的 成熟的成骨細胞在體內(nèi)不發(fā)生增殖 但是體外培養(yǎng) 在合適的條件下 成骨細 胞可以大量增殖 本課題前期的試驗已經(jīng)證實通過酶消化法可以培養(yǎng)出細胞 本實驗進 一步檢驗為成骨細胞 4 2 皮質(zhì)骨源成骨細胞分離培養(yǎng)及體外生長特點 目前皮質(zhì)骨源性成骨細胞的常用分離方法是組織塊法和酶消化法 j a np a u l m f r o l k e 8 等用膠原酶結(jié)合組織塊法培養(yǎng)皮質(zhì)骨組細胞 a n g e l am i n h w e in g 1 等用 i 型膠原酶消化皮質(zhì)骨過夜 p h w a r n k e 叮和s p r i n g e ri n g 嵋均用組織塊法直接培養(yǎng) 組織塊法操作簡單 細胞損傷小 但原代細胞培養(yǎng)時間明顯太長 考慮到取材時皮質(zhì)骨 片的厚度 大小及貼壁等因素其培養(yǎng)時間約2 4 周不等 再加上后期細胞的消化 傳代 而且在后期的換液中因骨片的存在增加了細胞污染的幾率 因此整個種子細胞的培養(yǎng)周 期太長 會導(dǎo)致整個實驗周期延長及浪費大量的人力和財力 酶消化法操作相對復(fù)雜 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 胰酶會對細胞造成一定損傷 長時間的酶消化可能破壞成骨細胞細胞膜和表型相關(guān)的膜 表面分子 1 2 1 但原代細胞培養(yǎng)時間明顯縮短 約1 2 周 如果在消化過程中注意酶及 消化時間的控制 不僅能較短時間的獲得較好的種子細胞 而且能節(jié)約大量的時問和財 力 本實驗采用酶消化法獲取原代細胞 在倒置相差顯微鏡下可見新接種的細胞懸浮于 培養(yǎng)液中 為圓形 橢圓形透亮細胞 大小不等 隨培養(yǎng)液移動 約4 5 h 后部分細胞 開始貼壁 約2 4 h 后大部分細胞貼壁 但在倒置相差顯微鏡下仍可見少量未貼壁的懸浮 在配液中的細胞 因此為保證不浪費細胞 剛消化接種的細胞其換液時間最后控制在 4 8 小時以后 第2 3 d 細胞開始增殖 形態(tài)以長梭形為主 第4 5 d 細胞增殖迅速 形成多個相對獨立的細胞簇 細胞由簇中央向周圍生長 第7 8 d 細胞繼續(xù)增殖并連 成單層片狀 以長 短梭形細胞為主 第9 一l o d 細胞長滿培養(yǎng)皿底 細胞形態(tài)均一 為長梭形 在細胞增殖過程中 細胞密集區(qū)可表現(xiàn)為放射狀 旋渦狀或柵欄狀 第2 6 代細胞間不存在接觸抑制 隨著培養(yǎng)時間的延長 相互重疊成多層 細胞密度增加 未 見細胞衰老現(xiàn)象 這可能是因為成熟的成骨細胞能分泌大量的i 型膠原 膠原纖維交織 成網(wǎng)狀 將新增殖的成骨細胞包圍其中 導(dǎo)致細胞形成多層 為鈣化組織提供必不可少 的三維結(jié)構(gòu) 與成骨細胞的特點相復(fù)合 在細胞培養(yǎng)過程中我們還發(fā)現(xiàn)每代細