高級(jí)生物化學(xué).doc

原核轉(zhuǎn)錄與真核轉(zhuǎn)錄的比較答:1 原核生物中mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯幾乎是同步發(fā)生的,而真核生物,轉(zhuǎn)錄是發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi),翻譯則在核外進(jìn)行.轉(zhuǎn)錄合成的RNA必需穿出核膜才發(fā)揮作用. 2 RNA聚合酶不相同,原核生物中RNA由一種聚合酶合成.真核生物中有三種類型的RNA聚合酶. 3 啟動(dòng)子不同 真核生物的啟動(dòng)子與原核生物的很相似,也位于轉(zhuǎn)錄起始部位的5/端,但存在著幾個(gè)重要區(qū)域.例如在距起始部位最近的一個(gè)是-25區(qū),稱為TATA匣子,與原核生物的-10順序(TATAAT)很相似. 4 轉(zhuǎn)錄后RNA加工修飾不同 其中mRNA最為突出.真核生物mRNA分子的壽命較長(zhǎng),不像原核生物的只有幾秒鐘.而且不用加工修飾.真核生物mRNA在5/和3/端都要修飾, 5/端要形成一種稱作帽子的復(fù)雜結(jié)構(gòu). 3/端則要加上一段多聚腺嘌呤核苷酸poly(A)的順序。Replicator:起始子，決定DNA復(fù)制起始的序列。Initiator:起始因子，識(shí)別并作用起始子，啟動(dòng)復(fù)制的蛋白質(zhì)。必需氨基酸（essential amino acid）:必須從食物中攝取，以維持生物體正常功能的氨基酸，賴（Lys）、蘇（Leu）、異亮（Ile）、苯丙（Phe）、甲硫（Met）、纈（Val）、色（Trp）。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure）：蛋白質(zhì)的多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵位置。特點(diǎn)為是基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的一般步驟（1）測(cè)定蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈數(shù)目（2）拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈（3）測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成（4）測(cè)定多肽鏈的C端（肼解法）和N端（丹磺酰氯法）殘基（5）斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵（6）用兩種以上的方法將多肽鏈斷裂為數(shù)個(gè)肽段（E法和化學(xué)法（溴化氰法）（7）測(cè)定肽段的氨基酸順序（Edman法）（8）用拼版法確定多肽鏈的氨基酸排列順序（9）確定肽鏈間的二硫鍵蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的常用方法末端殘基的測(cè)定：N-端殘基的測(cè)定：丹磺酰氯法（DNS）,該法原理與Sanger法相同，但產(chǎn)物有熒光，因此靈敏度高。Edman 法氨肽酶法。（2）C-端殘基的測(cè)定：肼解法、還原法、羧肽酶法。二硫鍵的斷裂與巰基的保護(hù)。多肽鏈的斷裂：至少要用兩種不同的方法酶法化學(xué)法。酶法：用不同的蛋白酶水解同一肽鏈，得到不同的肽段，常用的蛋白酶及其專一性為：胰蛋白酶：羧基端為L(zhǎng)ys和Arg的肽鍵；胰凝乳蛋白酶：羧基端Phe,Trp和Tyr的肽鍵；化學(xué)法：常用溴化氰法。肽段氨基酸順序的測(cè)定：常用Edman法。多肽鏈氨基酸順序的確定：拼版法。穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力（1）氫鍵（2）離子鍵（3）配位鍵（4）疏水作用：是在極性環(huán)境中，氨基酸的疏水基團(tuán)之間的聚集力。（5）二硫鍵 是Cys殘基的硫氫基之間通過(guò)氧化形成的共價(jià)鍵，存在較少，但是由于它是共價(jià)鍵，所以在維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象中也起主要作用，分為鏈間二硫鍵和鏈內(nèi)二硫鍵。（6）范德華力 當(dāng)分子間結(jié)合的結(jié)構(gòu)最匹配時(shí)，范德華力最大。蛋白質(zhì)的立體化學(xué)原理（1）肽鍵平面（peptide plane）形成原因：共軛，肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn)。結(jié)果：形成剛性平面，又叫酰胺平面。（2）二面角（dihedral angle）共用同一原子的兩個(gè)平面間的夾角稱為二面角，決定主肽鏈骨架的構(gòu)象。（3）非鍵合原子最小接觸距離 決定R基及其原子在空間的排列。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）在規(guī)則氫鍵指導(dǎo)下，局部主肽鏈在空間的排列。1、螺旋（helix）：螺旋的表示方法 “nsR或L”，其中n表示上升一圈的氨基酸數(shù)，s表示氫鍵形成的環(huán)中所含的原子數(shù)，R或L表示螺旋的旋轉(zhuǎn)方向。2、折疊片（-pleated sheet）：多個(gè)折疊股平行排列通過(guò)氫鍵形成折疊片。平行的每個(gè)重復(fù)周期為0.65 nm，反平行0.7nm。3、回折（reverse turn）或稱轉(zhuǎn)角（turn）。4、-發(fā)夾（-hairpin）：它是由一條構(gòu)想伸展的肽鏈彎曲，彼此靠近并呈反向平行的發(fā)夾狀狀結(jié)構(gòu)（剛性結(jié)構(gòu)），包含10或11個(gè)氨基酸殘基，兩條等長(zhǎng)的肽段依靠16個(gè)氫鍵連接起來(lái)。5、無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）：這是一種沒(méi)有一定規(guī)律的結(jié)構(gòu)（軟性結(jié)構(gòu)），但是又是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能的結(jié)構(gòu)部位。6、三股螺旋（triple-stranded helix）：存在于膠原蛋白（甘脯羥脯）中的一種特殊結(jié)構(gòu)，膠原蛋白分子由三條分子量約為120000的肽鏈組成。每條肽鏈形成左手螺旋（特點(diǎn)是輕微的螺旋），但內(nèi)部沒(méi)有氫鍵，三條這樣的螺旋又形成右手三股螺旋，肽鏈間借助Gly殘基的肽鍵之間形成氫鍵交聯(lián)在一起，是一種超螺旋結(jié)構(gòu)。7、-突起（-bulge）：在-折迭結(jié)構(gòu)中片層出現(xiàn)彎曲，使局部肽鏈之間不是平行結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)（super secondary structure）：指相鄰二級(jí)結(jié)構(gòu)單元按一定規(guī)律組合，形成空間上可以區(qū)別的結(jié)構(gòu)單位。類型：1、卷曲的卷曲-螺旋（，coiled-coil-helix）2、x單元 兩段平行的-折迭借助一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元連接組成。當(dāng)X=-折迭時(shí)，則形成；當(dāng)X=-螺旋時(shí)，則形成；當(dāng)X=無(wú)規(guī)則卷曲時(shí)，則形成C。最常見(jiàn)的是三段平行-折迭和兩段-螺旋，這類結(jié)構(gòu)稱為Rossmann結(jié)構(gòu)。3、-迂回（- meanter）:由幾個(gè)相鄰反平行的折迭互相結(jié)合，中間由短鏈連接形成的結(jié)構(gòu)。4 、回型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)5、-折迭桶（-barrel）：是大的折迭片層發(fā)生扭曲，最后卷曲成桶狀的結(jié)構(gòu)，其-折迭可以是平行的，也可以是反平行的。6 、-螺旋-回折-螺旋（-helix-turn-helix）這是兩個(gè)-螺旋經(jīng)一個(gè)回折連接起來(lái)的結(jié)構(gòu)，兩個(gè)螺旋互成一定的角度。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域（doman）：蛋白質(zhì)一條多肽鏈上出現(xiàn)緊密的、相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域。類型：-螺旋結(jié)構(gòu)域-折疊結(jié)構(gòu)域+結(jié)構(gòu)域/結(jié)構(gòu)域無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)域-回折結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure）：是指蛋白質(zhì)分子中全部原子的空間排列。球蛋白都具有三級(jí)結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1球狀蛋白往往利用各種結(jié)構(gòu)單元折疊成緊密的球狀結(jié)構(gòu)，各種結(jié)構(gòu)單元所占的比例與蛋白質(zhì)種類有關(guān)；2球狀蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)主要趨向于內(nèi)部，而親水基團(tuán)主要分布于表面，內(nèi)部的疏水基是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要部分，而外部的親水基團(tuán)有利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定的存在于極性的細(xì)胞環(huán)境中；3蛋白質(zhì)表面的下陷區(qū)往往是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能的部位；4同類球狀蛋白具有基本相同的三級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的球狀蛋白其三級(jí)結(jié)構(gòu)是不同的，這是球狀蛋白結(jié)構(gòu)的專一性，但這種專一性也不是一成不變的，而是常發(fā)生一些必要的構(gòu)象變化，這種專一性和靈活性的統(tǒng)一是蛋白功能多樣性、復(fù)雜性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternary structure）就是亞基在空間的排列方式。含有亞基的蛋白質(zhì)稱寡聚蛋白。亞基之間的主要的作用力是疏水作用力。四級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)越性減少遺傳錯(cuò)誤；擴(kuò)大功能；節(jié)省模版；形成一定得幾何構(gòu)型，從而形成特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)原則1、手性原則（handed principle）：即蛋白質(zhì)從低級(jí)結(jié)構(gòu)形成高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)要遵從右手原則。螺旋是以右手螺旋為主，平行的折迭相互連接是右手連接，折迭片層比較大時(shí)，要發(fā)生扭曲，扭曲的方向也是右手扭曲。2、疏水表面積最小原則3、自我裝配原則。波爾效應(yīng)PH對(duì)血紅蛋白對(duì)氧親合力的影響，生理意義：在機(jī)體組織中因其低，有利于氧的釋放，使組織能比氧分壓降低獲得更多的氧，氧的釋放又促進(jìn)血紅蛋白與、的結(jié)合以補(bǔ)償?shù)慕档?；在肺部由于氧分壓高，有利于、的釋放與氧的結(jié)合。*攝入過(guò)多的脂肪會(huì)怎樣？答：酸性體質(zhì)，血液PH低，不利與血紅蛋白結(jié)合氧，會(huì)使機(jī)體無(wú)力，脂肪分解過(guò)快，產(chǎn)生酮體，易造成酸中毒。*燙發(fā)：人工使二硫鍵改變。頭發(fā)卷直軟硬與二硫鍵的位置和多少有關(guān)。核酸的分類 包括DNA和RNA（tRNA、mRNA、rRNA、SnRNA、其它）。 DNA的結(jié)構(gòu)：1、特點(diǎn)a.反平行雙鏈右手螺旋；b.糖-Pi在螺旋線上；c.堿基伸向內(nèi)部其平面垂直于軸；d.A=T、G=C；e.直徑=2nm，一圈上升10對(duì)核苷酸，螺距為3.4nm；f.大溝、小溝。2. 穩(wěn)定作用力 氫鍵（堿基之間，橫向力）；堿基堆積力(包括縱向的疏水作用力和堿基間p電子的相互作用)（主要）；相反電荷作用。DNA雙螺旋構(gòu)象的多樣性1、B型DNA ：天然，大多數(shù)生物的DNA都是屬于這種類型。2、A型DNA ：B型DNA脫水后變成A型DNA。3、Z型DNA ：為左手雙螺旋， DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多樣性A、B、Z、3鏈、4鏈DNA的狀態(tài)和功能+意義：有利于基因的表達(dá)調(diào)控，有利于DNA的穩(wěn)定。三鏈及四鏈DNA 1三鏈DNA：三鏈結(jié)構(gòu)是在正常的雙螺旋結(jié)構(gòu)中第三鏈結(jié)合在大溝中，從而形成局部三鏈結(jié)構(gòu)。三鏈中正常T-A鏈間為反平行，第三股鏈與A鏈為平行。功能與基因調(diào)控有關(guān)，且第三股鏈只與特定區(qū)域結(jié)合它的存在使調(diào)控蛋白及酶難以結(jié)合，從而關(guān)閉基因，抑制解螺旋。2四鏈DNA（Ttraplex）：在染色體的端粒處，有（T4和G4）序列，兩條鏈上各8個(gè)G形成局部四鏈結(jié)構(gòu)。雙螺旋結(jié)構(gòu)的局部構(gòu)象1、堿基對(duì)平面 ：形成這種構(gòu)象的原因是堿基之間的互相積壓。2、堿基對(duì)旋轉(zhuǎn)角：平均為36。局部構(gòu)象是DNA結(jié)合蛋白識(shí)別的標(biāo)志 。DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)。1、超螺旋DNA（Supercoiled DNA）：松弛態(tài)（relaxed state） DNA中心軸與平面平行即不扭曲的狀態(tài)。超螺旋：雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA再次扭曲形成的螺旋結(jié)構(gòu)。右旋超螺旋-負(fù)超螺旋；左旋超螺旋-正超螺旋。2、細(xì)胞中的DNA：細(xì)胞中原核、真核DNA都以負(fù)超螺旋存在。超螺旋的重要性1超螺旋化使分子致密，易包裝；2超螺旋化是DNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制的需要。超螺旋是一種受力狀態(tài)，負(fù)超螺旋引起互補(bǔ)鏈分開(kāi)，局部變性。Z-DNA的形成對(duì)超螺旋化有意義，如BZ（1個(gè)圈），DNA超螺旋結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)很大變化。RNA的結(jié)構(gòu)特征1、堿基組成：AGCU,區(qū)別DNA：AGCT；2、一級(jí)結(jié)構(gòu)：基本組成單位：核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）；核苷酸鏈接鍵：3-5磷酸二酯鍵；存在狀態(tài)：?jiǎn)捂?，少?shù)為雙鏈，長(zhǎng)度：65至60000bp。RNA構(gòu)象元件（RNA有7種結(jié)構(gòu),DNA有5種結(jié)構(gòu)）：雙螺旋、內(nèi)部環(huán)（雙螺旋中間出現(xiàn)的環(huán)，是兩條鏈形成的）、單堿基突起（一個(gè)堿基未形成氫鍵）和突環(huán)（在雙螺旋的中間部位且是一條鏈?zhǔn)菃捂?，而另一條鏈?zhǔn)峭暾膲A基配對(duì)，是由一條鏈形成的）、發(fā)夾環(huán)（一個(gè)雙螺旋自身的兩條鏈形成的環(huán)）、多分支環(huán)或結(jié)合環(huán)（連接多個(gè)雙螺旋結(jié)構(gòu)）、假結(jié)（在一級(jí)結(jié)構(gòu)上不連續(xù)的堿基，空間上形成的另一種氫鍵，三級(jí)結(jié)構(gòu)才能看見(jiàn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)不配對(duì)）、單鏈區(qū)mRNA結(jié)構(gòu) 原核生物mRNA為多順?lè)醋觤RNA（polycistron），即一條mRNA可編碼幾條肽鏈，無(wú)帽子結(jié)構(gòu)和尾巴，不含稀有堿基，半壽期短，二級(jí)結(jié)構(gòu)有豐富的自身回折產(chǎn)生的雙鏈區(qū)。真核生物mRNA為單順?lè)醋觤RNA（monocistron），即一條mRNA只編碼一條肽鏈，5有帽子結(jié)構(gòu)3有尾巴，含少量稀有堿基，半壽期可達(dá)一小時(shí)。tRNA結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：分子量25000左右，7399個(gè)核苷酸，大多數(shù)是76個(gè)核苷酸含有較多的稀有堿基3為CCA 5端磷酸化。二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草型。三級(jí)結(jié)構(gòu)：倒L型snRNA(small nuclear RNA):小分子核RNA，分布于細(xì)胞核，80260個(gè)核苷酸，沉降系數(shù)48S，普遍存在于各種真核生物中，由于富含尿嘧啶，所以以U系列命名。功能：多樣化，U1、U2、U4、U5、U6與蛋白質(zhì)（剪接體）結(jié)合參與mRNA的剪接，U3與rRNA加工有關(guān)（轉(zhuǎn)錄后加工）等。SnoRNA(small nucleolar RNA):小分子核仁RNA，存在于真核生物細(xì)胞核的核仁部分，功能為參與rRNA的加工，影響rRNA及其前體的形成，指導(dǎo)甲基化位點(diǎn)的形成等。反義RNA（antisenseRNA）指能與mRNA進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合的單鏈RNA，具有調(diào)節(jié)作用。（與mRNA結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄不進(jìn)行，由于基因的過(guò)量表達(dá)，雙鏈RNA有酶切斷，發(fā)生基因沉默。）核酶（robozyme）：具有催化活性的RNA。核酶的催化方式自我剪接（self-cleavage）：這些RNA可以對(duì)自身進(jìn)行催化，自己催化自己的多核苷酸鏈分解 ；自我剪切（self-splicing）：即RNA對(duì)自身的多核苷酸鏈既催化其水解，又可將成熟片段連接起來(lái)。具有特殊結(jié)構(gòu)，如錘頭結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、斧頭結(jié)構(gòu)；分子間催化。脫氧核酶(deribozyme)：具有催化活性的DNA：RNA的切割作用：以金屬離子為輔助因子Mg2+ Zn2+ Mn2+ Ca2+等；以氨基酸為輔助因子；無(wú)輔助因子；DNA切割作用：類脫氧核酶：需維生素C和Cu2+ 參加；類脫氧核酶：只需Cu2+參加；過(guò)氧化物酶活性；DNA激酶活性可使DNA5，端磷酸化；DNA連接酶活性 。DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定最常用的方法為雙脫氧法（Sanger法）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定體系模版和引物：模版為需測(cè)序的單鏈DNA片段；可以與模版互補(bǔ)的帶放射性標(biāo)記（有時(shí)用非放射性標(biāo)記）的引物雙脫氧核苷三磷酸參與DNA 復(fù)制的酶（DNA聚合酶）與底物(4種dNTP)。離心分離的基本原理分子量越大的分子，被分離的越遠(yuǎn)。在一定離心場(chǎng)中，顆粒的沉降速度不僅與離心力有關(guān)，而且與顆粒大小、密度以及介質(zhì)黏度有關(guān)，一組不同的顆粒在同一條件下離心時(shí)則可以根據(jù)它們的密度和顆粒大小而分離。離心場(chǎng)產(chǎn)生的離心力的表示 習(xí)慣使用法：轉(zhuǎn)速-轉(zhuǎn)/分（r/min）；缺點(diǎn)：如果旋轉(zhuǎn)半徑不同，則粒子所受的離心力不同。標(biāo)準(zhǔn)法：相對(duì)離心力（RCF），表示方法：數(shù)字*g（g為重力加速度，即相對(duì)離心力為重力加速度的倍數(shù)）相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速的換算：計(jì)算法：RCF=1.119*10-5*（r/min）2*r*g g:9.8kg.m/s2. 圖表法：根據(jù)旋轉(zhuǎn)半徑r、RCF、r/min的列線計(jì)算圖進(jìn)行換算。離心技術(shù)沉淀離心：選定一定得時(shí)間、速度進(jìn)行離心，使樣品液中的大的固型物與液體分離，從而獲得沉淀或上清液，又稱為固液分離法，使用普通離心機(jī)。差速離心（差級(jí)離心、差分離心）在均勻介質(zhì)中，利用各種物質(zhì)粒子沉降速度的不同而分批分離的方法。（至少需要2個(gè)離心力）密度梯度分離（超速離心機(jī)）原理：利用各種粒子的沉降速度和浮力密度差，當(dāng)一定粒子到達(dá)與其密度相同的梯度位置時(shí)停止沉降，不同粒子處于不同位置，則得到了分離。用途：是制備高純度物質(zhì)的常用方法。電泳原理 v=(*q)/(6) v:泳動(dòng)速度 :電場(chǎng)強(qiáng)度 q:粒子電荷數(shù) r:顆粒半徑:介質(zhì)黏度 粒子的泳動(dòng)速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比,與粒子電荷成正比,與顆粒半徑成反比,與介質(zhì)黏度成反比。聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE 凝膠的結(jié)構(gòu)：立體網(wǎng)狀；凝膠聚合原理：在TMED（四甲基乙二胺）催化過(guò)硫酸胺還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長(zhǎng)鏈，在交流劑甲叉雙稀酰胺的參與下的共聚合僅反應(yīng)中，聚丙烯酰胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。聚合方法：光聚合、化學(xué)聚合。凝膠性質(zhì) A機(jī)械強(qiáng)度高、有彈性、透明；B性質(zhì)穩(wěn)定；C有分子篩效應(yīng)，抗對(duì)流；D親水且為中性；E不溶性，不污染樣品，可微量操作；F通過(guò)控制凝膠濃度，孔徑大小可以控制。電泳分離原理（1）濃縮效應(yīng) 1、膠層不連續(xù)2、離子成分不連續(xù)3、電位梯度不連續(xù)4、PH不連續(xù)。（2）分子篩效應(yīng)凝膠孔徑與蛋白質(zhì)分子大小在一個(gè)數(shù)量級(jí)，各種蛋白質(zhì)都可通過(guò)，但是阻力不同，小分子可很容易的通過(guò)，大分子需要從凝膠孔中擠過(guò)去。（3）電荷效應(yīng)。凝膠電泳類型（1）圓盤電泳（2）垂直板凝膠電泳：優(yōu)點(diǎn)為表面積大，易控制溫度，多個(gè)樣品條件相同，可進(jìn)行雙向電泳，放射自顯影。等電聚焦凝膠電泳（IEF）1、原理：在凝膠中形成了濃度梯度（1）兩性電解質(zhì)載體：兩性電解質(zhì)載體為多羥基、多羧基化合物，因此具有等電點(diǎn)，氨基、羧基比例不同，其等電點(diǎn)也不同，兩性電解質(zhì)載體也具有緩沖作用。（2）PH梯度的形成.（3）電泳分離蛋白。SDS凝膠電泳 1、樣品處理：樣品蛋白中加入SDS、巰基乙醇，巰基乙醇的作用 打開(kāi)二硫鍵；SDS作用：作用于亞基。2、電泳：不同蛋白質(zhì)的區(qū)別只有分子量，因此電泳后可按分子量的大小不同而分離，但是測(cè)出的只是亞基的分質(zhì)量，為了得到蛋白質(zhì)的分子量，電泳時(shí)必須加標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker一起電泳。凝膠層析（gel chromatography）1、凝膠結(jié)構(gòu)與性質(zhì)；結(jié)構(gòu)：立體網(wǎng)狀；單體：葡萄糖；交聯(lián)劑：甘油；性質(zhì)：穩(wěn)定，不溶性。2、分離原理：蛋白質(zhì)在凝膠中的速度決定于內(nèi)水、外水的分配系數(shù).大分子不進(jìn)入顆粒速度最快，小分子完全進(jìn)入顆粒速度最慢，中等大小分子速度中間；3、操作：溶脹-裝柱-層析-再生；4用途：a脫鹽b分離提純蛋白質(zhì)c濃縮d測(cè)定分子量。親和層析原理 生物物質(zhì)之間有專一性。特點(diǎn)：效率高，純度高，可純化細(xì)胞，條件溫和。離子交換層析1、離子交換劑：弱酸型的CM-纖維素、弱堿型的DEAE-纖維素。2、分離過(guò)程：不同蛋白質(zhì)所帶電荷不同，與交換劑的結(jié)合力也不同，通過(guò)改變洗脫液離子強(qiáng)度或PH，可將蛋白質(zhì)根據(jù)其結(jié)合力從弱到強(qiáng)依次分離。核酸的合成 原核細(xì)胞含一個(gè)染色體，真核細(xì)胞含多個(gè)染色體，細(xì)胞分裂前，DNA會(huì)發(fā)生復(fù)制。復(fù)制完畢則細(xì)胞分裂。染色體外的遺傳因子，有的受染色體控制，而與染色體DNA同步復(fù)制，有的不受控制則在細(xì)胞周圍的任何時(shí)期都可復(fù)制。DNA復(fù)制（replication）:以親代DNA為模板指導(dǎo)合成相同的子代DNA分子的過(guò)程。DNA復(fù)制的方式-半保留復(fù)制。DNA的復(fù)制方式有三種，全保留、半保留和分散式。放射自顯影法 用帶3H的T標(biāo)記大腸桿菌DNA，用溶菌酶去掉細(xì)胞壁，釋放出完整的DNA鋪在透析膠上，蓋上感光膠片，若干星期后3H 處則被B射線感光，顯影后，就勾畫出DNA分子形狀在光學(xué)顯微鏡下可觀察DNA復(fù)制的過(guò)程 1，順序性：指DNA復(fù)制時(shí)是先局部解開(kāi)兩條鏈，再?gòu)?fù)制且邊解鏈邊復(fù)制：2，復(fù)制的起始位點(diǎn):原點(diǎn)局部雙鏈解開(kāi)，形成復(fù)制眼（復(fù)制起點(diǎn)不是任意的，而是固定的，原核生物有一個(gè)起點(diǎn)，真核生物多個(gè)起點(diǎn)）；3，復(fù)制方向：?jiǎn)蜗驈?fù)制，即只形成一個(gè)復(fù)制叉；雙向復(fù)制，形成兩個(gè)復(fù)制叉。（分子中正在復(fù)制的部位稱為復(fù)制叉，它是由兩股解開(kāi)得親代鏈和在其上新合成得子鏈、酶、因子組成）。4，雙向復(fù)制的對(duì)稱性 對(duì)稱復(fù)制 兩個(gè)復(fù)制叉移動(dòng)速度相同，對(duì)于環(huán)形DNA來(lái)說(shuō)，其終點(diǎn)在原點(diǎn)180處。不對(duì)稱復(fù)制兩個(gè)復(fù)制叉移動(dòng)速度不同。6復(fù)制子（replicon）:從一個(gè)原點(diǎn)起始復(fù)制的DNA （原核細(xì)胞只有一個(gè)原點(diǎn)，即只有一個(gè)復(fù)制子）。5.半不連續(xù)復(fù)制:DNA聚合酶作用下，5-3開(kāi)始合成，5-3方向與解鏈方向一致，則連續(xù)復(fù)制；另一條3-5方向的不能連續(xù)復(fù)制，則產(chǎn)生岡崎片段，是由DNA聚合酶控制的。岡崎片段（Okazaki）：岡崎用3H標(biāo)記噬菌體感染的大腸桿菌、然后短時(shí)間內(nèi)分離DNA，則得到1000堿基左右的片段，真核生物則為100-200個(gè)核苷酸片段，稱為岡崎片段。結(jié)果：半不連續(xù)復(fù)制。連續(xù)鏈叫先導(dǎo)鏈；不連續(xù)鏈叫后隨鏈；二者差一個(gè)岡崎片段。機(jī)理 兩條模板鏈中3-5方向的模板其子代DNA合成是連續(xù)的，這條子代DNA 叫先導(dǎo)鏈，而5-3方向的鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的，隨著復(fù)制叉的移動(dòng)要先合成小片段，然后連起來(lái)，這條子代DNA鏈叫滯后鏈或隨后鏈。問(wèn)題：真核生物DNA比大腸桿菌的DNA大的多復(fù)制叉移動(dòng)速度慢10倍，據(jù)此計(jì)算真核細(xì)胞DNA 復(fù)制需用幾個(gè)星期，實(shí)際上只用6-8小時(shí)（因?yàn)檎婧思?xì)胞DNA有多個(gè)原點(diǎn)，整個(gè)分子分為多個(gè)復(fù)制子，且都為雙向復(fù)制）。5-3外切：去除引物，填補(bǔ)缺口。3-5外切：校對(duì)。IV和V一般不參與修復(fù)，專性很低，沒(méi)校對(duì)功能。I和II是主要修復(fù)。SOS對(duì)微點(diǎn)損傷后，不按堿基配對(duì)原則來(lái)修復(fù)，對(duì)進(jìn)化有用，使基因突變。參與DNA復(fù)制的酶和輔助因子：1.DNA聚合酶 催化反應(yīng)的要點(diǎn)：底物：四種dNTP；模板：DNA鏈；聚合方式：5-3；條件：聚合反應(yīng)必須有引物存在。2.引發(fā)酶（primase）:功能：可能從無(wú)到有地以DNA為模板，催化合成一小段與DNA互補(bǔ)的RNA即引物。其本質(zhì)是RNA聚合酶，有1060個(gè)核苷酸組成。引物酶本身無(wú)活性，只有與另外6種蛋白質(zhì)結(jié)合為引物體（primosome）才可催化引物的合成；3，DNA連接酶（ligase）功能：將復(fù)制過(guò)程中形成的DNA片段用35磷酸二酯鍵連接起來(lái)；4，DNA解螺旋酶（helicase）（解鏈酶）功能：DNA的雙螺旋解鏈，解開(kāi)一對(duì)堿基，需兩分子ATP。作用點(diǎn)：DNA上局部單鏈處，向雙鏈方向解鏈。5，單鏈結(jié)合蛋白（single strand binding protein SSB）MW:74000,四聚體，可與由解鏈酶解開(kāi)的單鏈結(jié)合。功能 防止單鏈再次形成雙鏈，防止核酸酶水解多核苷酸鏈，保護(hù)DNA。原核SSB對(duì)單鏈DNA結(jié)合有高度協(xié)同性，真核SSB無(wú)協(xié)同性?？芍貜?fù)使用。6DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）DNA構(gòu)象的拓?fù)潢P(guān)系 引入副超螺旋（右旋）。減少螺旋，引入正超螺旋（左旋），增加螺旋，通過(guò)催化DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化，減少由于解鏈形成的張力和合成的子代DNA形成雙螺旋。 控制DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的酶為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶。（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶 首先在大腸桿菌種發(fā)現(xiàn)，過(guò)去稱為-蛋白，分子量為11000，一條肽鏈，它可切斷DNA一條鏈，增加一個(gè)螺旋，再接起來(lái)，所以它可消除負(fù)超螺旋，可增加正超螺旋，不需供能系統(tǒng)。 功能：1，雙鏈DNA超螺旋與松弛態(tài)和相互轉(zhuǎn)換。2，單鏈結(jié)狀DNA和環(huán)狀無(wú)結(jié)狀DNA的相互轉(zhuǎn)換。3，單鏈互補(bǔ)環(huán)狀DNA正、負(fù)形成環(huán)狀DNA。4，雙鏈環(huán)狀DNA環(huán)連和解環(huán)連。（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶 E.coli中，MW=1400000為四聚體，A2B2,真核生物中該酶分子量為390000二聚體，它可使DNA兩條鏈同時(shí)裂解，然后再連接，結(jié)果引入負(fù)超螺旋，這是需能過(guò)程，能量由ATP供能.拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能：雙鏈DNA超螺旋與松弛態(tài)的相互轉(zhuǎn)化。單鏈結(jié)狀DNA和環(huán)狀無(wú)結(jié)狀DNA的相互轉(zhuǎn)化。單鏈互補(bǔ)環(huán)狀DNA正、負(fù)鏈形成環(huán)狀DNA。雙鏈環(huán)狀DNA環(huán)鏈或解環(huán)鏈。去除解螺旋的張力。7.端粒酶 是個(gè)核蛋白，保護(hù)能夠表達(dá)的DNA不被水解。組成：蛋白質(zhì)和DNA。性質(zhì)：兩個(gè)亞基，一個(gè)是催化亞基，一個(gè)是調(diào)節(jié)亞基。功能 以酶分子中的RNA片段為模版，在染色體DNA36端合成一段DNA。生理意義由于復(fù)制過(guò)程中，3-端引物切除以后聚合酶1無(wú)法填補(bǔ)，就造成了3-端的縮短。端粒酶可以補(bǔ)充染色體末端的丟失，防止細(xì)胞衰老。真核生物DNA復(fù)制需要的酶：真核生物DNA聚合酶aby&e.a功能：合成引物與一小段DNA。b功能：DNA損傷修復(fù)。y功能：線粒體DNA的復(fù)制。&功能：復(fù)制的主要酶。e功能：修復(fù)；填補(bǔ)缺口。DNA復(fù)制機(jī)理1，起始：DNA分子上有特定的起始位點(diǎn)，在一些因子的作用下，DNA部分解鏈，形成一個(gè)“復(fù)制眼”（replication eye）/復(fù)制泡。2，延長(zhǎng)。3，終止： DNA復(fù)制無(wú)特定終止位點(diǎn)，復(fù)制鏈接到達(dá)前面已復(fù)制成的片段則自動(dòng)終止。真核生物DNA復(fù)制機(jī)制：1起始2延長(zhǎng)：與原核生物基本一致。3終止：兩復(fù)制叉相遇，與原核生物相似。4端粒的復(fù)制與端粒酶。端粒酶：保護(hù)DNA末端，防止細(xì)胞老化。真核生物DNA復(fù)制方式1、染色體DNA復(fù)制方式： 多復(fù)制子復(fù)制 即DNA上先形成幾個(gè)復(fù)制眼，雙向復(fù)制。“眼”擴(kuò)大互相相連，形成“大眼睛”后完成整個(gè)DNA的復(fù)制,形成兩個(gè)DNA分子2 、線粒體DNA復(fù)制方式 ：D環(huán)復(fù)制模型。原核生物DNA的復(fù)制方式：1凱恩斯模型2滾環(huán)模型，均為雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制方式。3單鏈環(huán)狀DNA復(fù)制方式。4線粒體DNA復(fù)制方式反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄） 以RNA為模版合成DNA的過(guò)程。反轉(zhuǎn)錄酶：存在于真核生物的RNA腫瘤病毒中；催化特性：1以四種dNTP為底物，需模版和引物2 以病毒RNA為模版，合成互補(bǔ)DNA3 具有核糖核酸功能，水解RNADNA雜合分子中的RNA4 以自己合成的DNA鏈為模版合成互補(bǔ)的的DNA，從而形成雙螺旋分子。催化過(guò)程：1以RNA為引物合成負(fù)鏈DNA。2完成了RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的過(guò)程。DNA損傷修復(fù)1 光復(fù)活2 切除修復(fù)：屬于復(fù)制前的修復(fù)3 重組修復(fù)：復(fù)制中的修復(fù)4 SOS修復(fù)：堿基亂配。 反轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)：1三種反應(yīng)（RNA-DNA，RNA降解，DNA-DNA）由一個(gè)酶催化。2負(fù)鏈DNA合成的天然引物是tRNA,是引物的3端18bp與RNA互補(bǔ)結(jié)合。正鏈合成的天然引物是分解后的RNA片段。3實(shí)現(xiàn)了兩次跳躍。4cDNA的兩條鏈?zhǔn)欠植胶铣傻摹＾D(zhuǎn)錄（transcription）:在DNA指導(dǎo)下合成RNA的過(guò)程.1 局部轉(zhuǎn)錄；RNA的轉(zhuǎn)錄只轉(zhuǎn)錄DNA的部分信息；轉(zhuǎn)錄時(shí)每次轉(zhuǎn)錄一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄單位從RNA轉(zhuǎn)錄起始到終止的DNA序列。2 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：只以一條DNA鏈為模版合成RNA的過(guò)程，其中模版鏈也叫反義鏈與模版鏈互補(bǔ)的鏈因?yàn)榕cRNA鏈堿基序列基本相同，所以叫模版鏈（coding strand）也叫正義鏈(sense strand)。3 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：編碼mRNA的基因叫結(jié)構(gòu)基因（structural gene），因其最終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)。編碼是其他RNA的基因叫非結(jié)構(gòu)基因，因其最終產(chǎn)物是RNADNA復(fù)制中的損傷：1堿基錯(cuò)配2核苷酸插入或刪除3校對(duì)的疏忽。DNA損傷的修復(fù)：1錯(cuò)配修復(fù)2切除修復(fù)：堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄切除修復(fù)3直接修復(fù)光復(fù)活去甲基4重組修復(fù)（修復(fù)后損傷點(diǎn)還在）5SOS修復(fù)6斷鏈修復(fù)單鏈斷裂修復(fù)雙鏈斷裂修復(fù)復(fù)制雙鏈斷裂直接雙鏈斷裂修復(fù)（重組修復(fù)）。RNA聚合酶 性質(zhì):以四種NTP（ATP 、GTP CTP UTP ）為底物，以DNA鏈為模版，按照堿基配對(duì)原則，將相應(yīng)的NTP的5 磷酸與上一個(gè)核苷酸3羥基形成3-5磷酸二酯鍵,即合成方向?yàn)?-3方向,聚合反應(yīng)不需要引物。轉(zhuǎn)錄四個(gè)階段 識(shí)別啟動(dòng)子，聚合酶結(jié)合于雙鏈，尋找基因的調(diào)控區(qū)域，識(shí)別啟動(dòng)子起始，聚合酶停泊在啟動(dòng)子上，從局部序列解旋，形成轉(zhuǎn)錄跑開(kāi)始，到合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中最初幾個(gè)核苷酸磷酸二酯鍵的合成延伸，聚合酶沿著雙鏈運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)錄泡隨之前進(jìn)，前方的雙螺旋不斷解旋，暴露出心的單鏈模版片段終止，聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，停止合成磷酸二酯鍵，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物解體釋放解體釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。真核細(xì)胞RNA的轉(zhuǎn)錄機(jī)理與原核RNA轉(zhuǎn)錄機(jī)理基本相同。主要不同之處為：1. 啟動(dòng)子復(fù)雜2. 需要多種因子參與3. RNA聚合酶不同。真核RNA聚合酶有三種，即RNA聚合酶I、 II、 III。原核生物轉(zhuǎn)錄的機(jī)理：起始：搜索、結(jié)合啟動(dòng)子形成封閉復(fù)合物形成開(kāi)放復(fù)合物形成三元復(fù)合物因子的解離延伸：聚合酶的變化與運(yùn)動(dòng)：酶的變化：因子離去，全酶變?yōu)楹诵拿福H和力降低。運(yùn)動(dòng)方式：蠕蟲運(yùn)動(dòng)。鏈的生成雙螺旋模板的拓?fù)渥兓K止：聚合酶到達(dá)終止子，則停止轉(zhuǎn)錄。終止子（terminator）：能夠使轉(zhuǎn)錄停止的序列。終止子特點(diǎn)：富含、的反向重復(fù)序列末端有連續(xù)的對(duì)。終止因子：能夠幫助終止子進(jìn)行終止的蛋白質(zhì)。強(qiáng)終止 只依靠終止子和部分因子就可使轉(zhuǎn)錄停止，并釋放合成的鏈和聚合酶弱終止 不僅需要終止子，而且需要r因子才能停止轉(zhuǎn)錄并釋放RNA和RNA聚合酶的終止方式。又叫依賴于r因子的終止子。核心啟動(dòng)子：1.-35區(qū)，功能：RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)聚合酶全酶有很高的親和力。.區(qū)，功能：聚合酶緊密結(jié)合位點(diǎn)，決定轉(zhuǎn)錄方向，開(kāi)始解鏈區(qū)。因子的功能：識(shí)別核心啟動(dòng)子，使聚合酶全酶結(jié)合與啟動(dòng)子部位，并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。RNA轉(zhuǎn)錄后的加工1. rRNA加工：（1）剪接（2）修飾：主要是甲基化2.tRNA的加工（1）剪切(2) 修飾：3加CCA。剪切加工后，全部的真核tRNA和原核細(xì)胞中一大類tRNA無(wú)3端的CCA，需要在修飾加工中加上。其它修飾：如還原、糖苷鍵移位、甲基化等。 3.真核mRNA的加工 （1）5加帽子，3加尾巴（2）剪接：真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)基因是斷裂基因，即一個(gè)基因中有的片段具有指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)的信息，而有的片段無(wú)此信息。DNA和hnRNA中在mRNA中出現(xiàn)的相應(yīng)序列稱為外顯子。DNA和hnRNA中在mRNA中不出現(xiàn)的相應(yīng)序列稱為內(nèi)含子。RNA復(fù)制酶 催化性質(zhì)：以4種NTP為底物，以RNA為模板，按照堿基配對(duì)原則進(jìn)行聚合反應(yīng)，合成方向?yàn)? 3。聚合反應(yīng)不需要引物。蛋白質(zhì)合成體系多順?lè)醋觤RNA(polycistronic mRNA) 原核細(xì)胞mRNA的編碼序列可指導(dǎo)幾條肽鏈的合成。單順?lè)醋觤RNA(monocistronic mRNA)： 真核細(xì)胞mRNA的編碼序列只指導(dǎo)一條肽鏈的合成。mRNA(messenger RNA) ：攜帶有指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)的遺傳信息的RNA。1.結(jié)構(gòu)：原核細(xì)胞 mRNA 5端有引導(dǎo)序列，3端有拖尾序列，引導(dǎo)序列之后是編碼序列，可直接指導(dǎo)肽鏈合成。真核細(xì)胞mRNA 5端有引導(dǎo)序列，3端有拖尾序列，還有帽子（cap）結(jié)構(gòu)，3端有尾巴(tail),中間是編碼序列。3端有尾巴（多聚A200左右個(gè)核苷酸）功能：保護(hù)作用；5端有帽子結(jié)構(gòu)：0號(hào)帽子：結(jié)構(gòu)為 m7G5ppp5 Np；1號(hào)帽子：結(jié)構(gòu)為 m7G5ppp5 NmpNp；2號(hào)帽子：結(jié)構(gòu)為 m7G5ppp5 NmpNmp；功能：保護(hù)作用，參與蛋白質(zhì)合成起始2. 遺傳密碼(genetic code) mRNA編碼區(qū)核苷酸的排列順序與肽鏈中氨基酸的排列順序的對(duì)應(yīng)方式。密碼表的組成 有義密碼子編碼氨基酸的密碼子，61 個(gè)；無(wú)義密碼子不編碼氨基酸的密碼子，即終止密碼子。UAA UAG UGA；起始密碼子 作為翻譯起始信號(hào)的密碼子，AUG（GUG）。移碼突變（frame shift mutation）：由某一個(gè)核苷酸 漏讀、重讀或者編碼區(qū)插入、刪除一個(gè)核苷酸就會(huì)使該處之后的讀碼發(fā)生錯(cuò)誤而引起的突變。密碼的特點(diǎn) （1）無(wú)間斷性。密碼閱讀方向5-3，密碼之間無(wú)間隔。2）簡(jiǎn)并性（degeneracy）。一個(gè)氨基酸有一個(gè)以上密碼子的現(xiàn)象。意義：加強(qiáng)翻譯的準(zhǔn)確性（3）變偶性(wobble)。指翻譯過(guò)程中密碼子與反密碼子堿基配對(duì)時(shí)，密碼子的第三個(gè)堿基不嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則的現(xiàn)象。（4）通用性。所有生物的遺傳密碼都是通用的。但是相對(duì)通用性，不是絕對(duì)通用性。即有少部分生物（如紅色面包霉）或細(xì)胞器（如線粒體）具有另外的遺傳密碼。變偶學(xué)說(shuō)的四種關(guān)系A(chǔ)：密碼的前兩個(gè)堿基與反密碼的相應(yīng)堿基相成強(qiáng)有力的配對(duì)B：反密碼的第一個(gè)堿基決定給定tRNA所讀密碼子的數(shù)目。第一個(gè)堿基為C、A，這種tRNA只能閱讀一種密碼子；第一個(gè)堿基為U、G，這種tRNA能閱讀兩種不同的密碼子；第一個(gè)堿基為I，這種tRNA能閱讀三種不同的密碼子；C：一個(gè)氨基酸有不同的密碼子時(shí)，頭兩個(gè)堿基不同的密碼子需要不同的tRNA。D：最少需要32種tRNA來(lái)翻譯所有64 種密碼子；意義 1、保證翻譯的速度：密碼的第三個(gè)堿基與反密碼結(jié)合的不專一性，說(shuō)明它們之間的堿基配對(duì)是松散的，可保證蛋白質(zhì)合成時(shí)tRNA從密碼子上迅速離去。2、保證翻譯的準(zhǔn)確性：如果密碼子第三位堿基發(fā)生突變，依然能保證翻譯的肽鏈不變。反密碼子 （anticudon）位于tRNA反密碼環(huán)可與mRNA的密碼子堿基配對(duì)的三個(gè)堿基稱為密碼子。核糖體（ribosome）原核生物蛋白質(zhì)合成因子有起始因子（initiation factor, IF）,延伸因子（elongation factor, EF）,終止因子（termination factor, RF）真核生物蛋白質(zhì)合成因子有起始因子（e IF）,延伸因子（e EF）,終止因子（e RF）。tRNA的種類：起始tRNA專一性識(shí)別起始密碼子AUG，進(jìn)P位，結(jié)合于mRNA小亞基復(fù)合體上；延長(zhǎng)tRNA:識(shí)別一般密碼子，進(jìn)A位，結(jié)合于mRNA核糖體復(fù)合體；校正tRNA：識(shí)別24個(gè)密碼子，校正移碼突變發(fā)生的閱讀錯(cuò)誤，通過(guò)再編碼改正。起始復(fù)合體包括mRNA,小亞基，起始氨酰tRNA,IF。氨酰-tRNA合成酶的專一性一種酶只識(shí)別一種氨基酸和相應(yīng)的tRNA.氨酰-tRNA合成酶每一個(gè)氨基酸有一個(gè)氨酰-tRNA合成酶，如果這個(gè)氨基酸有幾個(gè)tRNA，一個(gè)酶可以催化所有相應(yīng)tRNA氨酰化。對(duì)氨基酸的專一性：有三個(gè)校正過(guò)程:（1）氨基酸的結(jié)合（2）氨酰-AMP的識(shí)別，若不正確則將其水解(3）氨酰-tRNA的識(shí)別，若不正確則將其水解對(duì)tRNA的專一性：（1）識(shí)別特殊核苷酸殘基的位點(diǎn)，主要幾種在氨基酸臂和反密碼臂，也有其它位置。（2）識(shí)別tRNA分子的構(gòu)象（3）識(shí)別反密碼子氨酰-tRNA合成酶與tRNA的相互作用被人們稱為是“第二遺傳密碼”，這套遺傳密碼顯然要比第一套復(fù)雜的多，它在保證蛋白質(zhì)合成的精確性上其非常重要的作用。大腸桿菌蛋白質(zhì)的合成 肽鏈合成的起始：起始信號(hào) 起始密碼子AUG。SD(Shine-Dalgasrnon)序列 位于起始密碼上游(5-端方向)10個(gè)核苷酸左右，可與16SrRNA3-端的核苷酸序列互補(bǔ)。起始復(fù)合體的形成 核糖體分離，氨酰tRNA與起始因子結(jié)合。反應(yīng)過(guò)程需要IF-1、IF-2、IF-3三種輔助因子。延長(zhǎng):進(jìn)位：正確的氨酰-tRNA進(jìn)入A位的過(guò)程。該過(guò)程需要Tu、Ts兩個(gè)因子和GTP參與。水解一分子GTP，使一分子氨酰tRNA到達(dá)A位。(2)轉(zhuǎn)肽（3）移位（核糖體移動(dòng)，mRNA,tRNA不動(dòng)）：移動(dòng)距離：3組核苷酸 一個(gè)密碼，消耗一個(gè)鍵，移動(dòng)一個(gè)密碼距離，方向5-3；3、終止。大腸桿菌蛋白質(zhì)合成延伸部分（1）進(jìn)位反應(yīng)：起始tRNA已進(jìn)入P位點(diǎn)。第二個(gè)氨基酸以連接于tRNA的活化形式到達(dá)，按照mRNA上密碼子的要求進(jìn)入A位點(diǎn)需要延伸因子EF-Tu和GTP；（2）轉(zhuǎn)位和肽鍵的合成；（3）移位反應(yīng)：結(jié)合有肽酰-tRNA的mRNA與核糖體相對(duì)位置移動(dòng)一個(gè)密碼子。結(jié)果：1、原來(lái)在p位點(diǎn)內(nèi)的去氨酰的tRNA被移到E位點(diǎn)，準(zhǔn)備離開(kāi)核糖體；2、原來(lái)位于A位點(diǎn)內(nèi)的密碼子及其連接的二肽酰-tRNA一起移到P位點(diǎn)內(nèi)；3、A位點(diǎn)空載，準(zhǔn)備接受下一輪的氨基酸t(yī)RNA，移位需要延伸因子EF-Tu和GTP。多核糖體（polyribosome）：結(jié)合于同一mRNA上不同時(shí)間開(kāi)始翻譯的多個(gè)核糖體，mRNA翻譯過(guò)程形成，不同核糖體結(jié)合與mRNA不同位置，長(zhǎng)度不同。優(yōu)點(diǎn)：提高mRNA的利用率，加快蛋白質(zhì)的合成速度，同時(shí)合成許多分子，可重復(fù)利用。蛋白質(zhì)合成后加工N-端氨基酸的反應(yīng)：原核：甲酰甲硫氨酸；真核：甲硫氨酸化學(xué)修飾：磷酸化（形成稀有氨基酸）、羥基化、甲基化、乙酰化；結(jié)合蛋白的形成；形成特有的空間結(jié)構(gòu)：形成亞基的空間結(jié)構(gòu)以及亞基之間排列的信息存在于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，但是需要折疊酶和一類蛋白質(zhì)因子分子伴侶（chaperonin）功能：與折疊過(guò)程的蛋白結(jié)合，幫助折疊，防止其生成非天然構(gòu)象，幫助肽鍵形成特有的空間結(jié)構(gòu)。一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的非特定性，肽鏈剪接，肽鏈中也有內(nèi)含子，需經(jīng)過(guò)剪接才能成熟。蛋白質(zhì)合成抑制劑抗生素：嘌呤霉素(puromycin): 結(jié)構(gòu)類似與氨酰-tRNA3端，可進(jìn)入A位，形成肽鍵，但不能進(jìn)入P位從而終止肽鏈合成。四環(huán)素(tetracyclines)：阻斷A位，抑制氨酰-tRNA的結(jié)合，終止蛋白質(zhì)合成。氯霉素(chloramphenicol): 阻斷肽基轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)菌和葉綠體、線粒體的蛋白質(zhì)合成，但不抑制真核生物蛋白質(zhì)合成。環(huán)已酰亞胺(cycloheximide)：抑制真核細(xì)胞核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶，但不抑制細(xì)菌和葉綠體、線粒體的同種酶。鏈霉素(streptomycin)：低濃度引起遺傳密碼的錯(cuò)讀，高濃度抑制合成蛋白質(zhì)合成的起始。負(fù)作用：引起耳聰。毒素 白喉毒素(diphtheria)： 滅活真核延長(zhǎng)因子eEf-2，從而終止蛋白質(zhì)合成。（引起咳嗽特別是兒童）。蓖麻毒蛋白(ricin)：滅活真核細(xì)胞核糖體的60S亞基。生蓖麻引起中毒。干擾素：抗病毒(唯-種不殺死病毒的蛋白質(zhì))降解模板RNA：干擾素與雙鏈病毒RNA共同活化2，5-A合成酶，促進(jìn)2，5-A合成酶。2，5-A活化核酸內(nèi)切酶促進(jìn)mRNA降解使eIF-2磷酸化，抑制蛋白質(zhì)合成起始。蛋白質(zhì)的定向運(yùn)輸導(dǎo)肽類 對(duì)于向細(xì)胞核、線粒體、葉綠體等細(xì)胞器的蛋白質(zhì)，他們的肽鏈中都有一段或多段叫“導(dǎo)肽”，可以將蛋白質(zhì)定向運(yùn)輸。信號(hào)肽類 對(duì)于向溶酶體、質(zhì)膜和細(xì)胞外運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)，它們N-端有一段有信號(hào)作用的肽端，叫做信號(hào)肽(signal peptide),它的作用：將肽鏈引導(dǎo)進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。然后蛋白質(zhì)運(yùn)至高爾基器，在高爾基器中進(jìn)行定向分揀，接著定向運(yùn)輸。信號(hào)肽作用 含有信號(hào)肽的蛋白端合成信號(hào)識(shí)別粒子(SRP)與肽鏈結(jié)合使蛋白合成停止信號(hào)肽經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后形成運(yùn)輸泡SRP與SRPreceptor結(jié)合信號(hào)肽與空間蛋白結(jié)合用剪切酶將其它的肽與信號(hào)肽切開(kāi)，運(yùn)輸?shù)礁郀柣鹘?jīng)行更近一步的修飾轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體或分泌小泡和質(zhì)膜中去或分泌到膜外。miRNA與siRNA的聯(lián)系（1） 均為Dicer的產(chǎn)物：長(zhǎng)度約為22m左右，5端Pi基，3端-OH；（2）均需A蛋白家族的存在，因?yàn)镽ISC的組合。（3）進(jìn)化關(guān)系上兩種推論：siRNA是miRNA的補(bǔ)充，miRNA在進(jìn)化過(guò)程中替代了siRNA。尋找miRNA的方法（1） 分子生物學(xué)：分離、提純、測(cè)序、分子雜交等（2） 分子信息學(xué)：原理：出發(fā)點(diǎn)：前體的發(fā)夾膜結(jié)構(gòu)和miRNA在物種間的保守性。DNA結(jié)合蛋白的基本結(jié)構(gòu)域螺旋轉(zhuǎn)角螺旋（helix-turn-helix,HTH）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：每個(gè)HTH由20個(gè)左右氨基酸殘基組成，1-7構(gòu)成第一個(gè)螺旋，12-20構(gòu)成第二個(gè)螺旋。鋅指（zinc finger）一個(gè)鋅指單元含有一個(gè)鋅離子，它可以與肽鏈的Cys、His形成配位鍵，使局部肽鏈形成指形區(qū)，故稱為鋅指。Zn2+的作用 對(duì)蛋白質(zhì)分子形成的指形構(gòu)想的骨架及其與DNA的結(jié)合均有固定作用，它比蛋白質(zhì)分子的二硫鍵更加穩(wěn)定，而且不參與氧化還原作用。（3）亮氨酸拉鏈（Leucine zipper）蛋白質(zhì)分子中的一個(gè)螺旋，在其一側(cè)集中了大量的疏水殘基，并且每7個(gè)氨基酸殘基就出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸，即每?jī)蓚€(gè)螺旋出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸，兩個(gè)蛋白質(zhì)的這種螺旋相互接觸，其亮氨酸測(cè)鏈交錯(cuò)相插，從而形成二聚體。二聚化的蛋白質(zhì)可以與DNA結(jié)合，但其結(jié)合區(qū)不是拉鏈區(qū)，拉鏈的功能是維持蛋白質(zhì)的二聚化。 堿性螺旋環(huán)螺旋（helix-loop-helixHLH）這種結(jié)構(gòu)為兩個(gè)螺旋有一個(gè)可變長(zhǎng)度的肽鏈形成的環(huán)連接，這種結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合以及蛋白質(zhì)分子二聚化都是很重要的。-折疊 蛋白質(zhì)分子中反向平行的折疊插到DNA分子的大溝中直接與堿基相互作用，這類蛋白質(zhì)分子也經(jīng)常形成二聚化。乳糖操縱子（1）如有乳糖存在時(shí)，乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖，此時(shí)與蛋白質(zhì)結(jié)合使阻遏蛋白變性，啟動(dòng)子處于開(kāi)放狀態(tài)：（2）無(wú)乳糖時(shí)，阻遏物可以結(jié)合在操縱基因上，阻止轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致基因關(guān)閉?；?負(fù)載特定遺傳的DNA片段，包括由編碼序列，非編碼序列組成的DNA序列。CDNA 以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成的DNA。基因組 指來(lái)自一個(gè)遺傳體的一整套遺傳信息。在真核生物體，基因組是指一套完整的單倍體的染色體DNA和線粒體DNA的全部序列?；虮磉_(dá) 基因的攜帶的遺傳信息，經(jīng)轉(zhuǎn)錄，翻譯等，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子的過(guò)程。但對(duì)于rRNA、tRNA編碼基因，基因表達(dá)僅是轉(zhuǎn)錄的過(guò)程?；虮磉_(dá)的特異性 ：時(shí)間特異性 某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格特定的時(shí)間順序發(fā)生，多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時(shí)間特異性與發(fā)育階段相關(guān)，故又稱階段特異性空間特異性 在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，某種基因在個(gè)體不同組織（空間）表達(dá)的差異，基因表達(dá)伴隨時(shí)間順序所表現(xiàn)出的這種空間分布的差異，實(shí)際上由細(xì)胞在個(gè)體的分布所決定，空間特異又稱細(xì)胞組織特異性。基因表達(dá)的方式基因表達(dá) 某類基因在一個(gè)個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通常被稱為管家基因。它們較少受環(huán)境因素影響，而且在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的幾乎所有組織中都持續(xù)表達(dá)，這類基因表達(dá)稱為基因表達(dá)或組成性表達(dá)誘導(dǎo)和阻遏表達(dá) 在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相關(guān)的基因可被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因，可誘導(dǎo)基因在特定的環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)的過(guò)程被稱為誘導(dǎo)?？勺瓒舻鞍?如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被抑制，這種基因稱為可阻遏蛋白。阻遏 可阻遏基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低的過(guò)程稱為阻遏?；虮磉_(dá)調(diào)控的基本機(jī)理基因表達(dá)調(diào)控的多層次和復(fù)雜性：基因激活、轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄后加工mRNA降解、蛋白質(zhì)翻譯翻譯后加工修飾蛋白質(zhì)降解等基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素：基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生物個(gè)體或細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境以及細(xì)胞內(nèi)存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)。啟動(dòng)序列(promoter):是RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的特異DNA。操縱序列(operator):阻遏蛋白識(shí)別、結(jié)合的DNA序列，當(dāng)操縱序列結(jié)合有阻遏蛋白時(shí)，會(huì)阻礙RNA聚合酶與啟動(dòng)序列的結(jié)合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移動(dòng)，阻礙轉(zhuǎn)錄。真核生物基因的特異DNA序列：順式作用元件(cis-acting element)：可影響自身基因表達(dá)活性的DNA序列。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等。調(diào)節(jié)蛋白 原核生物基因調(diào)節(jié)蛋白分3類：特異因子決定RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)序列的特異性的特異性識(shí)別和結(jié)合能力阻遏蛋白 可結(jié)合操縱序列，阻遏基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制激活蛋白(activator) 結(jié)合啟動(dòng)序列鄰近的DNA序列，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)序列的結(jié)合，增強(qiáng)RNA聚合酶活性，介導(dǎo)正性調(diào)節(jié)機(jī)制。真核基因的調(diào)節(jié)蛋白 絕大多數(shù)此蛋白可通過(guò)與順序作用元件識(shí)別結(jié)合，反式激活另一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，又稱反式作用因子，這種作用叫反式作用。（元件：DNA調(diào)節(jié)序列，因子：蛋白質(zhì)）。順式作用：某些真核轉(zhuǎn)錄因子可特異識(shí)別，結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)，稱為順式作用。DNA-蛋白質(zhì)相互作用反式作用因子與順式作用元件之間的特異識(shí)