實驗一 紙層析法分離鑒定氨基酸ppt課件.ppt

18 1 實驗一紙層析法分離鑒定氨基酸 通過實驗 掌握紙層析的基本操作技能 加深對分配層析原理的理解 一 實驗目的 18 2 二 實驗原理 層析技術(shù)是利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)的差別 使各組分以不同程度分布在兩相中 其中一相為固定相 另一相流過此相稱作流動相 并使各組分以不同速度移動 從而達到分離的目的 可分離物質(zhì)糖類 有機酸 氨基酸 核苷等 18 3 固定相在層析中起分離作用而不隨層析過程移動的物質(zhì) 如紙層析中固定相是濾紙纖維中結(jié)合的水 固定相被看成是樣品移動的阻力 流動相在層析過程因其本身流動而推動樣品移動的物質(zhì) 18 4 層析的分類 18 5 分配層析 是利用不同物質(zhì)在兩種不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而達到分離的一種技術(shù) 分配系數(shù) 溶質(zhì)在固定相的溶解度 溶質(zhì)在流動相的溶解度 18 6 紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析 紙纖維上的 OH基具有親水性 所以能吸附一層水作為固定相 而通常把有機溶劑作為流動相 流動相流經(jīng)支持物時與固定相間連續(xù)抽提 使物質(zhì)在兩相間不斷地分配而得到分離 18 7 溶質(zhì)在濾紙上的移動速率用 f 比移 值來表示 展層層斑點中心與原點間的距離Rf 溶劑前沿與原點之間的距離 18 8 18 9 影響Rf值的因素 多種 物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配情況 pH值展層劑的pH影響被分離物質(zhì)的極性基團的解離形式 層析濾紙的質(zhì)量層析用濾紙要質(zhì)地均勻 緊密 有一定的機械強度 并含雜質(zhì)少 國產(chǎn)新華濾紙可用于一般的紙層析 18 10 三 器材與試劑 器材 1 層析缸2 毛細管3 噴霧器4 培養(yǎng)皿5 層析濾紙 新華一號 試劑 1 擴展劑 正丁醇 水 冰醋酸 4 3 1 2 顯色劑0 1 茚三酮正丁醇溶液 3 氨基酸溶液0 5 的賴氨酸 脯氨酸 纈氨酸 亮氨酸溶液及它們的混合液 18 11 1 層析濾紙準備 取層析濾紙 長20cm 寬15cm 一張 在紙的一端距邊緣2 3cm處用鉛筆劃一條直線 在此直線上每間隔2cm作一記號 2 點樣 用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這5個位置上 干后再點一次 每點在紙上擴散的直徑 最大不超過3mm 四 實驗步驟 18 12 3 擴展 用線將濾紙縫成筒狀 紙的兩邊不能接觸 將濾紙直立于培養(yǎng)皿中 點樣的一端在下 擴展劑的液面需低于點樣線1cm 待溶劑上升約15cm時即取出濾紙 鉛筆描出溶劑前沿界線 自然干燥或用吹風機熱風吹干 4 顯色 用噴霧器均勻噴上0 1 茚三酮正丁醇溶液 然后置烘箱中烘烤5分鐘 100 或用熱風吹干即可顯出各層析斑點 5 計算Rf值 18 13 五 實驗結(jié)果與分析 六 注意事項 七 思考題 1 實驗中作為固定相和流動相的物質(zhì)分別是什么 2 Rf值的含義 影響因素 下次實驗 實驗二蛋白質(zhì)和氨基酸的顏色反應(yīng) 值日生值日 18 14 小實驗 當濾紙接觸到溶劑時 溶液將上升 濾紙上的小圓點是4種不同的氨基酸的混合物 看看接下來會發(fā)生什么事情 18 15 可以看出1號氨基酸上升的最高 在濾紙上跑得最快 而4號氨基酸與濾紙的結(jié)合最緊 因此跑的速度比其他的氨基酸慢 18 16 這就是紙色譜法