復(fù)習(xí)基因工程ppt課件

基因工程專題復(fù)習(xí) 1 1 1DNA重組技術(shù)的基本工具 2 基因工程是指按照 進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計 并通過DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù) 賦予生物新的遺傳特性 從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品 由于基因工程是在水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的 因此又叫做 一 基因工程的概念 人們的意愿 體外 DNA重組技術(shù) DNA分子 可以說這既是概念 也是原理 3 生物體外 基因 DNA分子水平 剪切 拼接 導(dǎo)入 表達(dá) 人類需要的基因產(chǎn)物 定向改造生物遺傳特性 實質(zhì) 基因重組 基因工程的特點 4 二 基因操作的工具 1 基因的剪刀 限制性內(nèi)切酶 2 基因的針線 DNA連接酶 3 基因的運輸工具 運載體 5 識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列 并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開 具有異性 主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶化學(xué)本質(zhì) 蛋白質(zhì) 1 來源 3 作用 4 結(jié)果 形成兩種末端 分子手術(shù)刀 限制酶 可用于目的基因和載體的切割 2 特性 限制酶是一類酶 而不是一種酶 6 GAATTC 限制酶切割DNA分子示意圖 CTTAAG 黏性末端 EcoR 中軸線 7 CCCGGG 限制酶切割DNA分子示意圖 GGGCCC 平末端 Sma 中軸線 8 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoR 不同來源的DNA片段混合 將不同種來源的DNA片段連接起來 生物A基因片段 生物B基因片段 GAATTC CTTAAG 酶切 GAATTC CTTAAG 同一種 用同一種限制性酶處理不同DNA片段 會形成同樣的黏性末端 可進(jìn)行重組 9 E coliDNA連接酶 連接黏性末端 T4DNA連接酶 連接黏性末端和平末端 1 DNA連接酶的種類 2 DNA連接酶的作用部位 脫氧核苷酸鏈上相鄰的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵 分子縫合針 DNA連接酶 10 DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎 為什么 11 作用 具備的條件種類 將外源基因送入受體細(xì)胞 對受體細(xì)胞的生存沒有決定性作用能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存具有多個限制酶切點具有某些標(biāo)記基因 質(zhì)粒 噬菌體和動植物病毒 使用運載體的目的 用它作為運載工具 將目的基因送到宿主細(xì)胞中去 分子運輸車 載體 12 質(zhì)粒的特點 質(zhì)粒上會存在某些標(biāo)記基因 標(biāo)記基因有什么用途 思考 質(zhì)粒 是一種的 并具有能力的 裸露 結(jié)構(gòu)簡單 獨立于細(xì)菌染色體 擬核 之外 自我復(fù)制 雙鏈環(huán)狀DNA分子 鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞 13 基因工程的基本操作程序 14 基因工程的基本操作程序 一 目的基因的獲取 二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 三 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 四 目的基因的檢測與鑒定 15 一 目的基因的獲取 1 目的基因主要是 編碼蛋白質(zhì)的基因 例子 蘇云金桿菌抗蟲基因 人胰島素基因 人干擾素基因 2 獲取目的基因的常用方法 1 從基因文庫中獲取 2 利用PCR技術(shù)擴增 也可以是一些具有調(diào)控作用的因子 初始目的基因的來源 1 從生物中直接獲取 2 人工合成 目的基因的核苷酸序列已知且較簡單 16 補充 基因的結(jié)構(gòu) 1 原核生物基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 編碼蛋白質(zhì) 調(diào)控遺傳信息的表達(dá) 調(diào)控程序 A ATGTGCACGTAGTTA G T TACACGTGCATCAAT C 啟動子 終止子 17 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 啟動子 終止子 ATGTGCACGTAGTTA TACACGTGCATCAAT RNA聚合酶 AUGUGCACGUAGUUA 啟動子 位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列 沒有啟動子 基因就不能轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶 能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì) 終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 它能阻礙RNA聚合酶的移動 并使其從DNA模板鏈上脫離下來 使轉(zhuǎn)錄終止 18 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 能編碼蛋白質(zhì) 啟動子 終止子 2 真核與原核生物基因結(jié)構(gòu)的比較 外顯子 內(nèi)含子 編碼蛋白質(zhì) 不能編碼蛋白質(zhì) 相同點 都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū) 不同點 原核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的 真核細(xì)胞的編碼區(qū)是間隔的 不連續(xù)的 2 真核生物基因結(jié)構(gòu) 19 外顯子 真核細(xì)胞基因DNA中的編碼序列 這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA并進(jìn)而翻譯為蛋白質(zhì) 內(nèi)含子 真核細(xì)胞基因DNA中的間插序列 這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA 但隨即被剪除而不翻譯 20 1 從基因文庫中獲取目的基因 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷 導(dǎo)入到受體菌的群體中 各個受體菌分別含有這種生物的不同基因 稱為基因文庫 基因文庫 21 提取某種生物的全部DNA 用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段 將DNA片段與載體連接 導(dǎo)入受體菌中儲存 基因組文庫 a 直接分離法 鳥槍法 如何構(gòu)建基因文庫 22 某種生物的單鏈mRNA 單鏈互補DNA 雙鏈cDNA片段 導(dǎo)入受體菌中儲存 與載體連接 cDNA文庫 反 逆 轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 b 反轉(zhuǎn)錄法 cDNA的合成流程圖解 如何構(gòu)建基因文庫 23 基因組DNA文庫 cDNA文庫 基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較 24 25 為什么要構(gòu)建基因文庫 目的 怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢 便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下 獲得所需的目的基因 依據(jù) 目的基因的有關(guān)信息 如 根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性 26 概念 PCR全稱為 是一項在生物 復(fù)制 的核酸合成技術(shù) 條件 Taq酶 原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 特定DNA片段 DNA復(fù)制 模板DNA 四種脫氧核苷酸 DNA引物 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 2 利用PCR擴增目的基因 方式 以 方式擴增 即 n為擴增循環(huán)的次數(shù) 結(jié)果 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增 一段已知目的基因的核苷酸序列 指數(shù) 2n 27 過程 a 變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 復(fù)性 復(fù)性55 60 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 28 變性 90 95 PCR技術(shù)擴增目的基因的過程 29 3 人工合成 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測 推測 目的基因 化學(xué)合成 已知核苷酸序列的較小基因可以化學(xué)合成 不需要模板 30 質(zhì)粒 目的基因 限制酶處理 一個切口兩個黏性末端 兩個切口獲得目的基因 DNA連接酶 表達(dá)載體 同一種 1 過程 二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 核心 限制酶切割位點的選擇必須保證目的基因 標(biāo)記基因的完整性 以便于檢測和表達(dá) 31 2 目的 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用 32 3 基因表達(dá)載體的組成 復(fù)制原點 目的基因 啟動子 終止子 標(biāo)記基因 它們各自的作用是什么 33 三 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 一 轉(zhuǎn)化 二 方法 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 鈣離子處理 目的基因進(jìn)入 內(nèi) 并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持 和 的過程 受體細(xì)胞 穩(wěn)定 表達(dá) 34 1 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點 易感染雙子葉植物和裸子植物 對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力 原理 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞 并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上 35 過程 優(yōu)點 經(jīng)濟 有效 36 2 基因槍法 3 花粉管通道法 37 目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵 顯微注射帶目的基因受精卵新性狀動物 2 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 方法 顯微注射法 程序 38 3 導(dǎo)入微生物細(xì)胞 原核生物特點 繁殖快 單細(xì)胞 遺傳物質(zhì)少 用Ca2 處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 方法 39 四 目的基因的檢測與鑒定 檢測 導(dǎo)入檢測 目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞 方法 DNA分子雜交 表達(dá)檢測 轉(zhuǎn)錄檢測 分子雜交 翻譯檢測 抗原抗體雜交 分子檢測法 鑒定 抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等 個體水平的鑒定 40 蛋白質(zhì)工程的崛起 41 一 蛋白質(zhì)工程的崛起的緣由 基因工程產(chǎn)物基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì) 這些天然蛋白質(zhì)是生物在長期進(jìn)化過程中形成的 它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要 卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要 42 二 蛋白質(zhì)工程的基本原理 1 蛋白質(zhì)工程的目標(biāo) 根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求 對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計 2 天然蛋白質(zhì)的合成過程 基因 表達(dá) 轉(zhuǎn)錄和翻譯 形成氨基酸序列的多肽鏈 形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì) 行使生物功能 43 蛋白質(zhì)工程的基本途徑 預(yù)期的蛋白質(zhì)功能 設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 推測應(yīng)有的氨基酸序列 找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列 基因 44 4 蛋白質(zhì)工程的概念 是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ) 通過基因修飾或基因合成 對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造 或制造一種新的蛋白質(zhì) 以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求 蛋白質(zhì)工程的基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)工程的實質(zhì) 改造基因 蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)物 新的蛋白質(zhì) 45 5 蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系 蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上 延伸出來的第二代基因工程 是包含多