凝固酶陰性葡萄球菌PPT課件.ppt

凝固酶陰性葡萄球菌致病性分子標(biāo)志物的建立與應(yīng)用 1 1 立題依據(jù) 凝固酶陰性葡萄球菌 CoNS 廣泛存在于人體皮膚 黏膜等組織表面 常在血液 痰液 尿液 深靜脈置管等各種標(biāo)本中檢出 文獻(xiàn)報(bào)道 1995 1996年美國(guó)48個(gè)醫(yī)學(xué)中心2596份血標(biāo)本中 CoNS的分離率達(dá)32 2 盡管血液等無(wú)菌體液培養(yǎng)出CoNS臨床意義較大 但據(jù)報(bào)道單次血培養(yǎng)CoNS污染的可能性仍高達(dá)85 第一部分研究背景和意義 2 近年來(lái)由于介入性診療操作 免疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用 CoNS已成為院內(nèi)感染的重要病原菌 而且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見 葉聯(lián)華等報(bào)道人工瓣膜術(shù)后心內(nèi)膜炎中 約有40 50 由凝固酶陰性葡萄球菌引起 2009年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果MRCoNS檢出率平均為71 7 大于MRSA的52 7 研究背景和意義 3 CoNS作為皮膚黏膜定植菌 在越來(lái)越多的標(biāo)本中被分離出來(lái) 常常引起臨床困惑 其是否能作為感染的病原菌是臨床關(guān)心的問(wèn)題 有鑒于此 實(shí)驗(yàn)室建立對(duì)CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要 是臨床明確診斷和制定合理治療方案的重要前提 研究背景和意義 4 CoNS致病物質(zhì) 在CoNS感染的發(fā)病過(guò)程中 細(xì)菌先黏附繼而形成難以清除的生物膜是其最為重要的致病機(jī)制 其中CoNS產(chǎn)生的多糖胞間黏附素 polysacchatideintercellularadhesion PIA 是細(xì)菌生物膜形成聚集階段所必需的物質(zhì) 在感染過(guò)程中起重要的作用 是鑒定其致病性的物質(zhì)基礎(chǔ) Heilmann等發(fā)現(xiàn)ica操縱子對(duì)合成PIA以及在細(xì)菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用 研究背景和意義 5 ica基因結(jié)構(gòu) ica基因座定位于細(xì)菌染色體 全長(zhǎng)3 4kb 包括icaR調(diào)節(jié)基因及串聯(lián)存在的icaA icaD icaB和icaC結(jié)構(gòu)基因 其中 icaADBC4個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)操縱子 可以通過(guò)檢測(cè)icaADBC基因來(lái)反映ica操縱子的存在 icaB不直接參與胞間黏附素的合成 因?yàn)橹亟MicaADC就能使細(xì)胞積聚 icaA單獨(dú)呈現(xiàn)低的N 乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性 icaC涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面 生物膜的形成要求icaD編碼的產(chǎn)物具有最佳活性 因此 我們選擇了icaD作為本試驗(yàn)的目的基因片段 研究背景和意義 6 獲得CoNS特異的致病性分子標(biāo)志物 確立敏感 準(zhǔn)確 快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS特異基因診斷方法 能夠準(zhǔn)確鑒定致病性與非致病性CoNS 研究背景和意義 2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?7 研究CoNS的生物標(biāo)志物對(duì)該菌在醫(yī)院獲得性感染中的臨床微生物學(xué)診斷與鑒定 追蹤傳染源 探索其在醫(yī)院感染中的確切作用和地位 傳播與感染規(guī)律 從而對(duì)控制傳播途徑 建立準(zhǔn)確有效的防治措施具有重要實(shí)際意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值 研究背景和意義 3 臨床意義 8 陰性對(duì)照 表皮葡萄球菌ATCC12228 購(gòu)自中國(guó)藥品鑒定所 經(jīng)基因組測(cè)序證明其ica操縱子缺失 陽(yáng)性對(duì)照 表皮葡萄球菌1 97 337 瑞金醫(yī)院倪語(yǔ)星教授惠贈(zèng) 含有完整ica操縱子 待測(cè)樣本 自2006年1月至2007年9月 收集我院臨床各科室共114例疑是感染性標(biāo)本 第二部分材料和方法 1 研究對(duì)象 9 2 主要試劑 培養(yǎng)基 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基 剛果紅瓊脂培養(yǎng)基 LB肉湯增菌液 引物 SodA引物 5 CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC 3 及5 ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC 3 icaD引物 5 AGGCAATATCCAACGGTAA 3 及5 GTCACGACCTTTCTTATATT 3 16SrDNA引物 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 及5 CCGTCAATTCCATTTRAGTTT 3 材料和方法 10 3 主要儀器設(shè)備 PCR儀 PTC100PCR儀 美國(guó)MJResearchInc 恒壓恒流電泳儀 電泳槽 DF C型 北京東方特力科貿(mào)中心 凝膠成像系統(tǒng) GDS8000 美國(guó)UVPInc 核酸 蛋白定量?jī)x DU640 美國(guó)Beckman 酶標(biāo)儀 美國(guó)雷杜 深圳組裝 ATBExpression 法國(guó)bioM rieuxInc 生物安全柜 BSC 1500 B2 濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司 全自動(dòng)快速微生物培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng) BacT ALERT3D60 法國(guó)bioM rieuxInc 材料和方法 11 4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法 標(biāo)本采集 陰 陽(yáng)性對(duì)照 菌種鑒定 PIA檢測(cè) PCR擴(kuò)增 icaD基因 sodA基因 16SrDNA序列 生物膜形成實(shí)驗(yàn) DNA測(cè)序 生物信息學(xué)分析 確定特征片段 臨床驗(yàn)證 比較分析 材料和方法 12 圖2 1 部分樣品剛果紅試驗(yàn)結(jié)果 3 4 1 剛果紅試驗(yàn) 第三部分結(jié)果和討論 13 表2 1 114例CoNS的菌種組成及剛果紅試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果和討論 14 剛果紅試驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)48h后菌落的顏色變化來(lái)反映CoNS表達(dá)多糖胞間黏附素的情況 進(jìn)而間接地反映其致病性 114例樣品中剛果紅試驗(yàn)陽(yáng)性率21 1 由于CoNS分泌的PIA在培養(yǎng)過(guò)程中可以丟失 使陽(yáng)性結(jié)果偏低 另外 其方法學(xué)本身易于受多種因素影響 比如 蔗糖的濃度 氯化鈉和瓊脂的濃度 氣體條件等 干擾了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性 不能滿足臨床要求 結(jié)果和討論 15 2 icaD基因片段的擴(kuò)增 圖2 2 部分樣品的icaD基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果 結(jié)果和討論 16 表2 2 114例CoNS不同菌種icaD片段PCR擴(kuò)增的結(jié)果 結(jié)果和討論 17 結(jié)果和討論 18 圖2 3 部分樣品的定性黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3 體外黏附性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果和討論 19 表2 4 9例icaD 菌株半定量黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果和討論 20 通過(guò)體外半定量黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)得88 9 8 9 icaD 菌株是粘附株 可見以半定量黏附試驗(yàn)結(jié)果作為生物膜形成能力的判定標(biāo)準(zhǔn) ica操縱子的存在與CoNS粘附及其生物膜形成密切相關(guān) 體外黏附性實(shí)驗(yàn)用光吸收原理檢測(cè)生物膜成分 但生物膜本身的結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞 且由于方法比較復(fù)雜 需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件才能獲得較好的重復(fù)性 不適合臨床常規(guī)應(yīng)用 結(jié)果和討論 21 4 16SrDNA及sodA基因片段擴(kuò)增 圖2 5 部分樣品的16SrDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果 結(jié)果和討論 22 圖2 6 部分樣品的sodA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果 結(jié)果和討論 23 圖7 部分樣品sodAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序圖譜 結(jié)果和討論 24 37例CoNS樣品進(jìn)行了16SrDNA基因及sodA基因片段的PCR擴(kuò)增 電泳檢測(cè)結(jié)果顯示全部樣品均能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的片段 其片段大小分別為16SrDNA926bp及sodA482bp 且均為單一條帶 序列測(cè)定表明所有樣品16SrDNA及sodAPCR產(chǎn)物序列均相同 未發(fā)現(xiàn)與感染相關(guān)的特異性分子序列 結(jié)果和討論 25 ica操縱子可出現(xiàn)在多種CoNS中 臨床實(shí)驗(yàn)室建立并常規(guī)進(jìn)行CoNS致病性分子標(biāo)志物的檢測(cè)方法是有意義 有必要的 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們確立了的敏感 準(zhǔn)確 快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS基因診斷新方法 即icaD基因擴(kuò)增方法 第四部分結(jié)論 26 結(jié)論 本研究首次報(bào)道了除表皮葡萄球菌以外的其他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘附因子的情況 表皮葡萄球菌在臨床CoNS中檢出最多 是攜帶icaD操縱子的主要菌種 其致病