表觀遺傳、基因與基因組學(xué).doc

第十三章 表觀遺傳學(xué)第一節(jié) 概 述一表觀遺傳學(xué)(epigenetic)：DNA的序列不發(fā)生變化、基因表達(dá)改變、并且這種改變可穩(wěn)定遺傳。二表觀遺傳學(xué)研究的內(nèi)容： 1. 基因選擇性轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的調(diào)控。2. 基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。(表觀遺傳通常被定義為DNA的序列不發(fā)生變化但是基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，也就是說(shuō)基因型未變化而表型卻發(fā)生了改變，這種變化是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)的改變，并且這種改變?cè)诎l(fā)育和細(xì)胞增殖的過(guò)程中能穩(wěn)定的傳遞下去。表觀遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容具體來(lái)說(shuō)主要包括DNA甲基化表觀遺傳、染色質(zhì)表觀遺傳、表觀遺傳基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳基因沉默、細(xì)菌的限制性基因修飾等。從更加廣泛的意義上來(lái)說(shuō)，DNA甲基化、組蛋白甲基化和乙?；?、基因沉默、基因組印記、染色質(zhì)重塑、RNA剪接、RNA編輯、RNA干擾、x染色體失活等等都可以歸入表觀遺傳學(xué)的范疇，而其中任何一個(gè)過(guò)程的異常都將影響基因結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)，導(dǎo)致某些復(fù)雜綜合癥、多因素疾病或癌癥。)三表觀遺傳修飾從多個(gè)水平上調(diào)控基因表達(dá)： 1.RNA水平：非編碼RNA可通過(guò)某些機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，例如microRNA、RNA干擾等2.蛋白質(zhì)水平：通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的修飾或改變其構(gòu)象實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，例如組蛋白修飾3.染色質(zhì)水平：通過(guò)染色質(zhì)位置、結(jié)構(gòu)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，例如染色質(zhì)重塑以上幾個(gè)水平之間相互關(guān)聯(lián)，任何一方面的異常都將影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)。四表觀遺傳學(xué)的研究意義：1. 表觀遺傳學(xué)補(bǔ)充了“中心法則”所忽略的兩個(gè)問(wèn)題，即哪些因素決定了基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯以及核酸并不是存儲(chǔ)遺傳信息的唯一載體。2. 表觀遺傳信息可以通過(guò)控制基因的表達(dá)時(shí)間、空間和方式來(lái)調(diào)控各種生理反應(yīng)。所以許多用DNA序列不能解釋的現(xiàn)象都能夠找到答案。3. 與DNA序列的改變不同，許多表觀遺傳的改變是可逆的，這使表觀遺傳疾病的治愈成為可能。第二節(jié) 表觀遺傳修飾一.DNA甲基化(DNA methylation)DNA甲基化是目前研究得最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式。通過(guò)甲基供體S-腺苷甲硫氨酸，并在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5位置的氫被活性甲基所取代，從而轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶(5-mC) 。DNA復(fù)制后甲基化型的維持 胞嘧啶甲基化反應(yīng)真核生物中存在兩種甲基轉(zhuǎn)移酶：一種起維持甲基化的作用，主要是甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT 1），在模板鏈的指導(dǎo)下，它能使半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化；另一種起形成甲基化的作用，主要是甲基轉(zhuǎn)移酶3a和3b（DNMT 3a、DNMT 3b），它們能在未發(fā)生甲基化的DNA雙鏈上進(jìn)行甲基化，并且該過(guò)程不需要模板鏈的指導(dǎo)。圖：CpG島（CpG island）在某些區(qū)域CpG序列的密度比平均密度高出許多，其長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基，這些區(qū)域命名為CpG島。CpG島位于基因上游調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子，這些基因?yàn)楣芗一蚧蚪M織特異表達(dá)基因。 圖：甲基化抑制基因的表達(dá)(一般而言，DNA甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)。發(fā)生在基因啟動(dòng)子或其附近區(qū)域的甲基化將直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合，使基因不能轉(zhuǎn)錄或降低基因的轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)，基因5端的調(diào)控元件發(fā)生甲基化后能結(jié)合特定甲基化CpG序列結(jié)合蛋白（methyl CpG binding protein，MBP），從而間接阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。甲基化還能改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，使染色質(zhì)凝縮成非活性的高級(jí)結(jié)構(gòu)。) DNA甲基化基因沉默(gene silence) 非甲基化(non-methylation)基因活化(gene activation) 去甲基化(demethylation)沉默基因的重新激活（reactivation）DNA高甲基化：基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島在正常狀態(tài)下一般是非甲基化的，當(dāng)發(fā)生甲基化時(shí)，基因轉(zhuǎn)錄沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、DNA修復(fù)基因等喪失功能，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時(shí)修復(fù)，這與多種腫瘤形成密切相關(guān)。DNA低甲基化：整個(gè)基因組普遍低甲基化，這種廣泛的低甲基化會(huì)造成基因的不穩(wěn)定，這與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。DNA的低甲基化也可能在異常組蛋白修飾的協(xié)同下引起某些T細(xì)胞基因的異?；罨?dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。整個(gè)基因組中普遍存在著低甲基化，主要發(fā)生在DNA重復(fù)序列中，如微衛(wèi)星DNA、長(zhǎng)散步元件(LINES)、中度重復(fù)順序Alu順序等。二 組蛋白修飾DNA以染色質(zhì)的形式存在，染色質(zhì)通常由DNA、組蛋白、非組蛋白以及少量RNA包裝而成，其中組蛋白是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)蛋白。 組蛋白的N-末端可通過(guò)共價(jià)作用從而發(fā)生乙?；?、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻譯后的修飾，這些修飾的信息構(gòu)成了豐富的組蛋白密碼，其中乙酰化和甲基化是最為重要的修飾方式。組蛋白乙酰化：是由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)協(xié)調(diào)催化完成，修飾的部位一般位于N-末端保守的賴氨酸殘基上。組蛋白乙酰化是一個(gè)可逆的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白甲基化：組蛋白甲基化多發(fā)生于組蛋白H3、H4的賴氨酸和精氨酸殘基上，由特異的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase, HMT)催化完成，也是一個(gè)可調(diào)控的動(dòng)態(tài)修飾過(guò)程。而組蛋白的去甲基化是由賴氨酸去甲基酶(lysine-specific demethylase 1, LSD1)催化完成。組蛋白的其他修飾：組蛋白泛素化由E1、E2、E3級(jí)聯(lián)酶催化修飾，也是一個(gè)可逆的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。 所有組蛋白的組分均能磷酸化。 組蛋白的各種修飾不是相互獨(dú)立的，而是互相聯(lián)系的，例如H3-Serl0的磷酸化可以促進(jìn)H3-K14乙酰化，而H3-K9的甲基化則會(huì)阻止H3-Serl0的磷酸化。三染色質(zhì)重塑(remodeling) 染色質(zhì)重塑是指染色質(zhì)位置、結(jié)構(gòu)的變化，主要包括緊縮的染色質(zhì)在核小體連接處發(fā)生松動(dòng)造成染色質(zhì)的解壓縮，從而暴露了基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)中的順式作用元件，為反式作用因子的結(jié)合提供了可能。染色質(zhì)重塑與基因轉(zhuǎn)錄染色體重塑的過(guò)程由兩類結(jié)構(gòu)所介導(dǎo)：ATP依賴型的核小體重塑復(fù)合體和組蛋白共價(jià)修飾復(fù)合體。前者通過(guò)水解的作用改變核小體構(gòu)型；后者則對(duì)核心組蛋白N-末端尾部的共價(jià)修飾進(jìn)行催化。這種修飾直接影響核小體的結(jié)構(gòu)，并為其他蛋白提供了和DNA作用的結(jié)合位點(diǎn)四非編碼RNA調(diào)控(ncRNA) 功能性非編碼RNA在表觀遺傳修飾中發(fā)揮極其重要的作用。ncRNA按照大小可分為兩類：長(zhǎng)鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。 長(zhǎng)鏈非編碼RNA在基因簇乃至于整個(gè)染色體水平上發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，短鏈RNA在基因組水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。1)長(zhǎng)鏈非編碼RNA X染色體的失活就是長(zhǎng)鏈ncRNA所介導(dǎo)的甲基化和組蛋白修飾共同參與的一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。x染色體上的失活基因編碼出相應(yīng)RNA，這些RNA包裹在x染色體上，達(dá)到某一水平后，在甲基化和組蛋白修飾的參與下共同導(dǎo)致并維持x染色體的失活。 此外長(zhǎng)鏈ncRNA常在基因組中建立單等位基因表達(dá)模式，在核糖核蛋白復(fù)合物中充當(dāng)催化中心，對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變發(fā)揮著重要的作用。2)短鏈非編碼RNA短鏈非編碼RNA(又稱小RNA)能夠介導(dǎo)mRNA的降解，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，決定著細(xì)胞的分化命運(yùn)，還對(duì)外源的核酸序列有降解作用以保護(hù)本身的基因組。五不同表觀遺傳學(xué)修飾之間的相互調(diào)控:表觀遺傳修飾從多個(gè)水平上調(diào)控基因表達(dá)，而不同水平的調(diào)控之間也是相互關(guān)聯(lián)的，任何一方面的異常都可能影響到其他水平的表觀遺傳修飾。事實(shí)上不同水平的表觀遺傳修飾在真核細(xì)胞中構(gòu)成了一個(gè)完整的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。第三節(jié) 表觀遺傳疾病一.DNA甲基化與疾病 DNA甲基化與腫瘤腫瘤細(xì)胞中的DNA甲基化一般表現(xiàn)為總體的低甲基化水平和特定區(qū)域的高甲基化，這些變化可以同時(shí)發(fā)生在同一腫瘤組織內(nèi)。基因總體甲基化水平降低導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、細(xì)胞凋亡基因相應(yīng)的CpG島的甲基化沉默，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的形成。原癌基因(oncogene)：較低水平的原癌基因?qū)τ诩?xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和信號(hào)傳導(dǎo)都是必需的，當(dāng)發(fā)生突變或基因異常表達(dá)時(shí)癌癥就產(chǎn)生了。研究發(fā)現(xiàn)原癌基因通常在腫瘤新生物中呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。腫瘤抑制基因(tumor suppression gene)：腫瘤抑制基因的產(chǎn)物能夠抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，失去其功能將促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；與原癌基因在激活方式上的不同在于腫瘤抑制基因的激活必須有等位基因的兩次突變或缺失。藥物：葉酸和維生素B12都是甲基的供體，能影響甲基化的狀態(tài)，主要是對(duì)全基因組甲基化上調(diào)的影響。環(huán)境因素：環(huán)境因素亦可影響腫瘤中基因的甲基化，從而間接的促進(jìn)或影響腫瘤的發(fā)生。 DNA甲基化與自身免疫性疾病DNA甲基化的改變可以影響一些與黏附分子和細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的基因，導(dǎo)致T細(xì)胞的自身反應(yīng)性改變，因此對(duì)維持T細(xì)胞的功能至關(guān)重要。研究證實(shí)，沒(méi)有維持DNA甲基化水平和模式的成熟T細(xì)胞，在體內(nèi)、外均能發(fā)生自身反應(yīng)性，因此表觀遺傳的失控可以引起自身免疫性疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(, SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、強(qiáng)直性脊柱炎(, AS)、系統(tǒng)性硬化癥(SSc) DNA甲基化與衰老DNA:甲基化作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組修飾和表達(dá)調(diào)控的后遺傳方式，在細(xì)胞的衰老過(guò)程中總體水平下降，同時(shí)又伴隨著某些基因的高甲基化。永生化細(xì)胞基因組的甲基化水平較高，因此甲基化水平過(guò)高又是腫瘤細(xì)胞的表現(xiàn)。目前年齡相關(guān)的甲基化已作為細(xì)胞生命歷史的標(biāo)簽。 DNA甲基化與心血管疾病:心血管疾病被認(rèn)為是受甲基化控制的人類重要疾病，對(duì)心血管疾病的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制深入研究，有利于制定心血管疾病的有效防御策略，同時(shí)DNA甲基化的可逆性，為采用控制飲食及其他環(huán)境手段干預(yù)心血管疾病的進(jìn)程提供了新的方法 DNA甲基化與精神疾病1972年Gottesman就將外遺傳這一概念引入精神病遺傳學(xué)研究。近些年當(dāng)傳統(tǒng)遺傳研究在精神疾病的研究中困難重重時(shí)，外遺傳與精神疾病尤其是DNA甲基化與精神分裂癥的關(guān)系，引起了研究者的重視。雖然目前還處于假說(shuō)階段，但不少研究已提示DNA甲基化參與了精神分裂癥的發(fā)生。二組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑與疾病染色質(zhì)重塑復(fù)合物、組蛋白修飾酶的突變均與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA甲基化、DNA重組、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和修復(fù)的異常相關(guān)，這些異?？梢砸鹕L(zhǎng)發(fā)育畸形，智力發(fā)育遲緩，甚至導(dǎo)致癌癥。三 基因組印記與疾病基因組印記是指來(lái)自父方和母方的等位基因在通過(guò)精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生了修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達(dá)特性，這種修飾常為DNA甲基化修飾，也包括組蛋白乙?；⒓谆刃揎?。四 。X染色體失活與疾病女性有兩條X染色體，男性只有一條X染色體，為保持平衡，女性一條X染色體被永久失活“劑量補(bǔ)償”效應(yīng)。 X染色體隨機(jī)失活是X失活中心(X inactivation center, Xic)調(diào)控的。 X染色體失活相關(guān)疾病多是由X染色體不對(duì)稱失活使攜帶有突變等位基因的X染色體在多數(shù)細(xì)胞中具有活性所致。五非編碼RNA與疾病ncRNA對(duì)細(xì)胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用，而它們?cè)谀[瘤發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制正在逐漸被認(rèn)識(shí)。其中miRNA能夠調(diào)控那些與發(fā)育、增殖、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，而且它們的表達(dá)異常是人類惡性腫瘤的一個(gè)共同特征。第四節(jié) 表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)人們對(duì)于表觀遺傳過(guò)程的關(guān)注程度日益增強(qiáng)，以DNA甲基化和組蛋白修飾為靶向的治療方法也初露端倪；在表觀遺傳修飾分析技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)之上，我們可以進(jìn)一步了解表觀遺傳過(guò)程的機(jī)制并設(shè)計(jì)出針對(duì)這一過(guò)程的治療性干預(yù)手段。.DNA甲基化的檢測(cè) 基因組整體水平的甲基化分析A高效液相色譜柱相關(guān)方法 B.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法 C.氯乙醛法 基因特異位點(diǎn)的甲基化分析A甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法 B直接測(cè)序法 C甲基化特異性的PCR法 D甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法E結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法F甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析G甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳H甲基化敏感性解鏈曲線分析IMethylight JDNA微陣列法 K.甲基化敏感性斑點(diǎn)分析 L. MS-MLPA 新甲基化位點(diǎn)的篩查A限制性標(biāo)記基因組掃描B.MBD柱層法C.COMPARE-第三章 人類基因組學(xué)一.Human genome Projecto 1986年Dulbecco提出腫瘤問(wèn)題有待人類基因組測(cè)序o 1991年人類基因組測(cè)序啟動(dòng)15年、30 億美元 、3109 堿基對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的阿波羅登月計(jì)劃，遺傳學(xué)革命o 2001年2月完成人類基因組94草圖o 2004年10月人類基因組完成測(cè)序，覆蓋了99的常染色質(zhì)區(qū)域，錯(cuò)誤率小于1/10 萬(wàn)二.人類基因組的結(jié)構(gòu)特征：o 2萬(wàn)2.5 萬(wàn)個(gè)編碼基因，不到線蟲(chóng)和果蠅的兩倍o 許多特征在基因組上分布不均一：基因、轉(zhuǎn)座子、GC含量、CpG 島和重組率等o 大部分轉(zhuǎn)座子活性明顯下降，但是長(zhǎng)散在核元件（LI