（微生物學(xué)專業(yè)論文）犬類microrna的計算機鑒定及分析.pdf

摘要 4 利用啟動子分析軟件對所有的m ir na進(jìn)行了 分析 最后鑒定出了1 42個mi朋 a 形成了53 個簇 由上游的啟動子控制表達(dá) 其中 28 個簇由多個同源的 mir na 基 因組成 18個mir n a 簇形成8 個不同的同源簇 進(jìn)一步的分析表明有些簇 是通過重復(fù)的形式產(chǎn)生多拷貝 5 研究結(jié)果 表明8 號 染色體上存在一個與 人具 有高度同源的印跡區(qū)域 在這個 區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個最大的由41 個mir na 組成的mir na 基因簇 另外兩個簇則位于 該簇的上 游 分別是由5 個耐朋a 組成的基因簇以及c d sn o rna 基因 簇 進(jìn) 一步分析 表明這 最大的m ic ror na基因 簇由 三個基因家族組成 這三個家族分 別是由不同的mic r o r n a通過串聯(lián)重復(fù)而產(chǎn)生的 6 研究發(fā)現(xiàn) 巧 個耐rna 位于基因組的重復(fù)區(qū)域 其中 7 個位于 l i ne 元件中 其它大多數(shù)位于sin e中 它們有些完全位于重復(fù)元件內(nèi) 有些則與元件部分 重疊 而且還有2個麗rna位于rrna 基因的內(nèi)含子中 7 通過分析 發(fā)現(xiàn)大多 數(shù)耐r na 在 動物的 進(jìn)化過程中都是保守的 研究發(fā) 現(xiàn) 大 多 數(shù)m irn a 是通 過局部串聯(lián)重復(fù)以及非 局部重復(fù)形式而進(jìn)化的 串聯(lián)重復(fù) 在 鄰近區(qū)產(chǎn)生多個 拷貝 而非局部重復(fù)發(fā)生在不同 染色體 之間 從而 產(chǎn)生 基因 或者基因簇的遷移 8 對所鑒定的m irna 靶序列的預(yù)測分析表明 大多數(shù) m irna 所調(diào)節(jié)的靶序列參 與了幾乎生物體所有的細(xì)胞過程 比如生長發(fā)育 代謝 調(diào)控因子的調(diào)節(jié)以 及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 等等 其中參與的最多的功能 可能是調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄因 子的 表達(dá) 同 時有些mir n a 可能參與了一 些癌癥相關(guān)的 過程 更為重要的是 我們鑒定 出了狗特異性的靶序列 它們可能參與了狗生長過程中的一些特殊過程 最 后 我們 發(fā)現(xiàn)m ir 一 1 8 6 能 夠調(diào) 節(jié)其宿主蛋白 的 表達(dá) 從而影響其表 達(dá)量 這 是一種自 我調(diào)節(jié)的反饋機制 相互制約 相互影響 關(guān)鍵詞 微小r n a mic r o rn a 基因 組織形式 同源簇 反饋抑制 a b s t r act abs tract m cror n a s asa 細(xì)1 1 i lyofnon c o d in g sma u r n a1 8 25niin e n g t h h ave b 沈 n p r o fo un dl ys 加 d l ed 訪代 c e n t y ears inpl ants ani m 川 s andvi rus as 助 誦腳找 朗 玄 re gul a l o r ineuk 別 下 o t e o r g 田 叮 s m m an y 創(chuàng) udy w o r k l l a d donetop r o v e th at而cror n a h ave abr o ad ro l es inthe de v e l 0 p m e ntofo 飛 anl sm in v o l v in gev 惻 留 戶 戈 t o f c e l l p h y s i cai activity t b e c h a m c t eriza t i on of而rn aissti a hot a c a d emicdom ain fo r thec a u s e0 fthe ide nti 6 edmi c r d r na farfro m 勸 切 rat l o il th esci enl i s ts had com p 1 e l ed se q u enc i n g0 fd o gg e n 0 m e an d而o u gh h u m 田 時 d o g羅n om i c州r ai i 即 口 e n 仁 it i s fo und th a t dog s and h 切 舊 ans b a v e s 而i l arl e v e isofo v e r a l l nuc l 即 t i de d i v e rs i ty m ean w hi l e the s pec i esdi spl aye x t r e m e 燦e n o ty p i c d i v ersi ty th e r e fo 肥 a l l p r o v l dea g ed fl atfo r 肥 s e a r c h d i se ase re l ated 誡thh ujnan m o rei m porlan t l y 5 議 mir n a w e r echara c t e ri zedin mi r b aseth us fara bove all th 盤 p t o vi de agre at 即ade m i c and r e al i stic n e a n i ng for id enti 斤 in g mi r n a ls i n dog gen om e as fo r l i m e 助d tissue一 杯 姆 c ialityof 而r n aexp r e s si on andm i l ea d in gof deg r a d a t i o nof mr n a 即do u l er o o n c odin gr n as th ere is li m it at io nby usin g e x per lme nt alr n o m ic s there fo re we a p p l yc o m p utat l o n 習(xí)r n o m ic sto p re d i ct m i r n a in d og b a s e don seq u e n c eco玫 犯 r v atio nof ma t 川 re har n as andth eir p recu r s o r d i s p i 即 i n g h ai rp in 就 nj c l u re l e a d i n g 仍i d enlifi cati o n of3 5 7 n o ve l m i r n as t 七 e fol l o w i 雌 i s the s um n a r l zat i on o f o urresult 1 t b e l o c i o f al l 3 5 7 而c ro r n ase q u en ce s in羅 n o me l i e inal l 3 3 c hr o m o so m eso f g eno m e a l l l o n gt h e sem i r n a s z g l se q u ence s be l o n g 1 0si n g l e 一 co py i n d o g g e nom eandthe 0 t h e r3 5se q u enc es belo ng to m u l t i 一 opy then umbe r o f 哭 q uen c esi n i d t e r g e ni c re g i on i s 2 2 2 inl n tr o n isl 2 5 ant i 一 s ensetog e n e i s 5 0 sen setog ene i s 7 5 andi n exo ni s 6 i n u t ri s 3 a l l p r e c u rso rs御 g ed from6 5 tol 2 0 niinl e n gt h witha v e 口 g e l en gth o f 8 0 nt 2 w 七h(yuǎn) a v e 即al y 雙 刃w h e t h erall m i r n acoul dfo而 s t e m l oopwh enj oi n ed with n 歇 止 i ng se q u e n ceinge no服 u 甘 u gh m 一 fo ldp r o g 刊 m s 出 l dthe re su lts s how e d th ata m aj o ri tyo f m i r n ah a v e 面s p r l pe i ty門 h o mol o g u e o f b u m anm i r n as bad h 犯 n vali d at edb y e x pen m e 城in d i cating th a t th eycan e x p re s s st a b 1 y m eanw h i1 e sn o v elmi r n as werefou n dby 淺 叮 c h i n ge s tdal abase f u rt h e n 刀 re we c ar ry o utr i p c rassa y o f s n o v e l mi r n a 1 認(rèn) 心o f w h i c h can o b ta i n the e x pec l e d resul仁 s u g gesti ngt h atth ey咖 exp r e s s ab s t ract 3 腸 叫g(shù)h anal y s i s we fo und th atth e 3 0 0 homol o g u e o f h u m an m 1 r n abel o n g to 1 4 9fa l ll i l i e s andmi r 一 1 5 4 m i r 1 7andl et 一 7fa j l l i l yhav el s 1 3andl o re 甲義 d v e l y m o stoffa n 1 i l i e s onl y ha veone mem ber s th e c ase i s d i ffer e n t 加m p l ant m e m be r s o f ani m alfa m i l y d i sp l a y ti 讓 eem o d e i d e ntical c l o se ly re l at e d or h o m ol o gy 4 for co n fo n 刀 l n g m i r n as are tran sc ri pt ed u n d erc o m m on p ro m 以 er we a n a l y sis th ese m i r n as us ing nro m o ter a nal y s i s vro gr aj 刀 l ea d i 昭toi d en t i fi c at io n o f l 4 2 m i r n as g r 0 upi n gi n t o5 3c 1 u s t e rsc o n t r o 1 l ed by p ro m o ter i nups t r e 別 舊 am o ng w h i ch2 8 cl u 1 e r s i s m a d e up o f m u l t i hom o l o g usmi r nas andl 8 m i r n ac l ust e r fo rm s d i st i nct p ar a l o gous c l u s t e f 往 rt h e r an al y s i s in di c a 把th atso m ec l uster h a v e mu l t i一 c opi e s d ir o u ghd upl i c ati嘰 5 1 n t e re st i n g l y we fo und a l ar g e m i r n ac l u s 1 e r m a d e up o f 4 l m i r n as w h ic h res記 e ini m p 行 nt edre gl o n o f c hr o mosome8 hi gh co ns erv edbe t w e e n h u m anan d d o g 即danoth e r 婦 胃 0c l u s t e i sl i ein即s t 肥 am o f this c l u s t e r ami r n ac l ust e r com p o s e d o f s mi r n a胡d c d sno r n ac l u 舊 t e r 6 w 七 fo u n d t h a t l 5 m i r n aoc cur i n re pe t i t i veregi o n i n g enome among whi c h 7 l i e in l i ne e l e 們 e n tandt h eo t h e r sr e s i d ein s 刀 習(xí) e e l e r n e n t s s o r n e o fth e 們 口 c o m p l etel yre s i d ei n化 沐石 t i v eregl 呱 andsomeo v erlap 儷th e l eme n t t w m i r n as re si de ini n t r o n o f r r n ag e n e 7 am aj o ri tyofm i r n a s are co ns e rv ed amo n g ani m a l t hr o u g ha na1 y si s m o sto f m i r n as evo l v ed by l oca l t al d e md u p 1 i cati o nandnon i ocald upl ic at 1 o 幾l 戊al 翻 川 d e md u p l i c at i o ns re sult inp 田 滋 1 o g o ussc q u e nce s t h atare l o c at ed onth e s ame t r a n sc ri pt no n 一 l o c a l dup li catio ns re sult inp ara o g o us g e n e s org e n e cl uste rson d i fl 七 r e nt c hro mo s o me s 8 w 七 p r e d i ct1 a r g etof1 d e n t 1 fi ed m i r n as us in g 3 一t r f u rt h er皿al ys isindi ca l e 山 以a m aj orityo f ta 飛 e t i n v o l v ed i n a m o stal l ce l l ul arp ro c e s se s for e x 即 的 p l e d eve l o p m e n 丸m e t a bol i s n 比 gu a t o ry facto r ands i gnalt 曉 m sd u ct i o n t 七 em o st rich ed g 0te rm is切 an s c ri ptio nal 偽 c l o r m e an w h l l e 5 o m e m 1 r n as m i ght are invo i v edinp rd ce s ses re l a t e d 誠thcan既 m o stimpo比 知 t l y we i d e n l i fi edt ar g et g e n e 畫q 此todog whi ch re gul ate s pe c i alp r o ces se s d u ri ng dog d e v e 1 叩m e n t f i n al l y we fo u n d th at而凡1 8 6 can re g u a l e e x p r e s s i o n o f itsh o stp r o t e i 氏resu it into m o utofitsp r o t e i n t b i s isa self r e g u 1 at o ryfe e d b a ck r n e c h 畫 sm k e ywo 川5 m i c ro r n a g e n o m i co r g an i za t i o n p aj 舊 o gous c l u s l e r feed b a c k i n 1 1 b i ti o n 學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明 學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明 本人聲明 所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn) 行的研究工作及取得的 研究成果 據(jù)我所知 除了文中 特別加以 標(biāo)注和致謝的 地方外 論文中不包含 其他人已 經(jīng)發(fā)表 或撰寫 過的研究成果 也不 包含為獲得 南昌大李 或 其他教育 機構(gòu)的學(xué)位或 證書 而使用 過的材料 與我 一同工作的同 志對本研究所做的任 何 貢獻(xiàn) 均已 在論文中 作了明 確的說明 并表 示謝意 學(xué) 位 論 文 作 者 簽 名 手 雕 松 簽 字 一 問年 月診 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文 作者完全了解南昌大李 有關(guān)保留 使 用學(xué)位 論文的 規(guī)定 有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤 允許論文被查閱 和借閱 本人授權(quán)南番大李可以 將學(xué)位論文的全 部或部 分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù) 庫 進(jìn)行檢索 可以 采用影印 縮印或 掃描等復(fù)制 手段保 存 匯編學(xué)位論文 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書 學(xué)位論文作者簽名 手寫 命 長 參 導(dǎo) 師 簽 名 手 寫 了 今 簽 字 日 問 年 月 簽 字 日 期 間 年 標(biāo) 對日 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向 工作單位 通訊地址 電話 郵編 第 1章 綜述 第 1 章 綜述 引言 rna 是生物體內(nèi)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一 它與 d na和蛋白 質(zhì)一起構(gòu)成生命的 框架 但長久以來 rna 一度被認(rèn)為僅僅是d 卜 a 和蛋白質(zhì)之間的 過渡氣它從dna那 兒獲得自己 的順序 然后將遺 傳信息 轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì) 然而 一系列的研究 表明 這 些小分子r na事實上操縱著許多細(xì)胞 功能 它可 通過互補序列的結(jié)合反 作用于 d n a 從而關(guān)閉或調(diào)節(jié)基因的表達(dá) m icrorna 而r n a 是新近發(fā)現(xiàn)的一種非編碼的小 分子rn a 長度大約在17 一 2 5 nt 它們對真核生物的生命活 動的多 方面產(chǎn)生 重 要的 影響 是調(diào)節(jié)生命活 動的一 個重要調(diào)節(jié)分 子 目 前己 經(jīng)知 道它在染色體消 除 染 色體重組 d n a 復(fù) 制 以及 基因 調(diào)控等方面 產(chǎn)生重要的影響 從目 前所積累 的實 驗證據(jù)可以肯定它涉及到了整個細(xì)胞水平的幾乎所有事件 zm i c r orn 八 基因 2 1 1 o r orna的發(fā)現(xiàn)過程 而cro r n a的發(fā) 現(xiàn)最早要 追溯到上世紀(jì) 九十年代 當(dāng) 時人們是 用遺傳 篩 選的 方 法尋找線蟲 c el e g a n s 胚胎后發(fā) 育的缺 損體 發(fā)現(xiàn)了 一個控制 線蟲幼 蟲發(fā)育 時 序性的 非編碼基因l in 礴 該基因產(chǎn)生 一對小分 子r n a 其中 一個長 約22nt 另 一個約為6int 較長的r n a可折疊為 莖環(huán)樣結(jié)構(gòu) 被認(rèn)為是 較短r n a的前 體11 2l lin 4可抑制l in 一 14基因 表達(dá)蛋白質(zhì) 的水平 而l in 一 14在發(fā) 育路徑 中起 著 重要的作用 最終的研究結(jié)果表明 正是1 訪 礴和11 介 14的3 非翻 譯區(qū)這 種直 接 的但不完全的配對作用是li n 礴調(diào)節(jié)著 l in 14 的蛋白質(zhì)合成的原因 即l in 4所編 碼的小分子r n a與li n 14 的3 非翻譯區(qū)的7 個位點不完全互補 結(jié)合后 抑制 了 該基因的蛋白 質(zhì)的 翻譯 而l in 礴突變體由 于iin4不能正常的表 達(dá) 因而l i n 一 14 就會一直處于無 抑制 狀態(tài) 它就會一直抑制 線蟲從幼蟲向 成蟲的過 渡 從 而出 現(xiàn) 上述表型p 刃 在相當(dāng)長時間里 li n 悶被認(rèn)為是內(nèi) 源性的小r n a分 子的唯一 例子 第 二個 小分子r n a l et 7 由ruv k u n 實驗室發(fā)現(xiàn)181 該而r n a也為22nt 同樣在 異 時性 基因路 徑中發(fā) 揮作用 與l in 礴相似 let一 7 r n a識別 靶l(wèi)in4 l m r n a的3 一 u t r序 第 1 章 綜述 列 抑制蛋白 l in一1的水平 lin 礴 和 l et 一 7 r na被命名為小分子時序性 r n a smallt e m po ralrna 19 1 叮 li n 4和iet 一 7 在 所 有 的 線 蟲 亞 種 中 呈 現(xiàn)出 進(jìn)化 上的 高度保守 性 其同源物在 軟體動物 海鞘 小鼠 和人類中 也能 夠檢測到 這種廣 泛存在的高 度保守 性有力 的說明了m i r n a在發(fā)育過程中的 重要的調(diào)節(jié)作用 這 一觀點正已 經(jīng)被線 蟲的 各個器官所鑒定的m i r n a的 功能所證明 li n 4現(xiàn)在被 認(rèn)為 是m icrorna 分 子 的 奠 基 性 成員 111 i 對 m i cro r n a指導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)的研究成果集中于尋找更多的 m i r n a和它們 所調(diào)節(jié)的 靶分子及其 功能等方面的 研究 近來的 研究表明 m i r n a的 功能包括 對細(xì)胞分化的 控制 細(xì)胞死亡 代謝以 及造血千細(xì)胞分 化等等 11 5 1 81 1 2 2耐r n a 基因的結(jié)構(gòu)特征 目前 在不同 物種中發(fā) 現(xiàn)的 絕大多數(shù) 而rn人長度一 般為 2 2 nt 其中 21 2 3 n t 長度的mir n a占大 多數(shù) 約為 8 錢 mir n a的一個特點是它的前 體常形成 分子內(nèi)莖 環(huán)結(jié)構(gòu) 而且含有大量的 g l 堿基對 這個前體物經(jīng)過核酸酶的加工形成成熟的 m i rn a ll 3 19 2 1 如同線蟲的 li n 4和 l et 7 一樣 大部分m i r n a基因與己注釋基因相距較遠(yuǎn) 提示他們來自 獨立的轉(zhuǎn)錄單 位 然而 相當(dāng)多的分子來自p re 一rn a中 的內(nèi) 含子 這些 mi r n a常與預(yù)期的 m r n a以同一方向排列 提示這些 m i r n a并沒有 自己 的啟動子 這種組織形式為m 1 r n a與蛋白的共同表達(dá)提供了便利的機制 同時 也 解 釋了m ir n a與 宿 主m rna 之間 的 保 守 關(guān)系 1側(cè) 22 創(chuàng) 10 然而近來研究表明 大多數(shù)哺乳動物的 m i r n a位于轉(zhuǎn)錄單元 t u 內(nèi) 通 過即時更新的基因組裝配以及 e s t數(shù)據(jù)庫 人們發(fā)現(xiàn)許多以前位于基因間隔區(qū) 的 m 1 r n a位于內(nèi) 含子中 有時 候由 于選擇性剪接方式 m 1 r n a位于同一個 pre一 m rna 的 外 顯 子 或 者 是 內(nèi) 含 子 中 4l 根 據(jù)m irna 基 因 組 位 置 m irna 可以 分為下列 幾種 1 位于編 碼蛋白 質(zhì)的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi) 的內(nèi) 含子中 2 位于非 編碼轉(zhuǎn) 錄單元的內(nèi) 含子中 3 位于非 編碼轉(zhuǎn) 錄單元的外顯 子中 見圖1 1 混合m i r n a 依據(jù)剪接模式的不同 而成為以上一種基因 組織形 式 一些內(nèi) 含子mir n a的位置 在 許多 物 種 中 是 非 常 保 守 的 3 5 7 川 另 外一些m i r n a基因 在基因組中和表達(dá)模式中成簇排 列 意味著 它們的轉(zhuǎn) 錄以多 順反子形式的 原初轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行 在人類基因 組中 大約50 的己 知m i r n a 成簇表達(dá) 而且一個簇的m1 r na經(jīng)常是彼此相關(guān)的 而一個簇中也包含了不相 關(guān) 的 m i現(xiàn) 1 4 3 1 1 目前 有研究發(fā) 現(xiàn) m i r n a基因可 能也 來自 于進(jìn)化過程中出現(xiàn)的假 基因 在 人的 m i n r a基因中 mi r 2 20 和 m i r 4 92 各自位于一個加工的假基因中 這說 第 1 章 綜述 明m i r n a在進(jìn)化過程中可能出 現(xiàn)了重復(fù)以及發(fā)生了 變異 同時也表明了 有一部 分m 1 r n a是來自 于假基因中 25 一 10 幾乎所有已經(jīng)克隆的而r n a在相近的動物中保守 如人與小鼠 或秀麗線 蟲和布氏線蟲 許多m i r n a在動物中具有更為廣泛的保守關(guān)系 例如 大于三 分 之一的 線 蟲m ir n a可以 很 容易 在人 的m ir n a中 找 到 同 源 物 13 5川 如 果比 較 更遠(yuǎn)一點的物種 相當(dāng)多的基因家族的擴大或縮小非常明顯 最令人吃驚的例子 是l et 7 家族 它在線蟲中有四個相同的成員 在人中至少有巧個 但在果蠅中 只有一個11 0 22 氣 與植物m i r n a前 體相比 動物而r n a前體分子的長度變化較小 大多數(shù) 在7 0 一 8 0nt 之間 一部分而r 卜 a常以單拷貝 形式存在于基因組中 一 些m 1 r n a 的前體分子常以兩個或多個拷貝 存在于不同染色體或者是同一染色體不同的位 置上 某些m i r n a來自 兩個或多個僅有微小差異的 前體12 峨 6 刀 偏碼蛋自質(zhì)轉(zhuǎn)最單元 非編碼轉(zhuǎn)最單元 非拐碼轉(zhuǎn)最單元 非翻譯區(qū) 圖1 l m ic m 陰a 的 基 因 組 織 形 式 fi g l l o e n o m ico 飛 ani皿i o n ofm i c ror n a 1 3麗r n 的生物合成 1 3 1 麗rna 生物發(fā)生的基本概況 成熟的mirna 是一種長約1 9 一 2 5 nt大小的單鏈r na 而編碼mir na 的 基因則位 于基因間區(qū)或基因的內(nèi)含子中 m irna 的形成需要經(jīng)歷如下階段 基因的轉(zhuǎn)錄 原始轉(zhuǎn)錄本 p r i mar ym i r n a p r i 一 m i r n a 的加1 m i rn a前體分子 m i r n a p r e c u s o r p r e m i 朋a 轉(zhuǎn) 運 p r e 一 m i rn a的剪切及 m i r n a 鏈的 選擇共 5步 最后 形 成具有生物學(xué)功能的 成熟 單 鏈 mir naiz 峨 7 1 之 5 1刀 它可 以 組合 進(jìn)入 剛 a誘 導(dǎo)的 沉默復(fù)合體 rna i n d u c e d s i l e n c i n g c o m p l e x r i s c 中 進(jìn)而引起靶 m r na 的降 解或翻譯的抑制 而m i 朋a究竟發(fā)揮哪種作用 是由 耐rna 與靶誡na之間的互補 程度決定的 硬加 引 1 當(dāng) 二 者完 全 匹配時 引 起靶 rn a 的降 解 二者不完 全 匹 配時 第1章 綜述 則引起靶m rna翻譯的抑制 在耐r n a的生 物發(fā)生過程中 mir na 基因的 轉(zhuǎn)錄是由r na多聚酶1 工 p ol l l 催化完成的 形成 p ri一 耐rna 然后 p ri一 mir na 在 細(xì)胞核中的一 種 微處理器 m i c r o p r o c e s s o r 蛋白 質(zhì)復(fù)合體的作用下 產(chǎn)生具 有特征 性的大 約7 0n t 大小 的發(fā)夾 狀p r e 一i rna 生成的 p r e 一 m i r n a在核轉(zhuǎn)運受體e x p o r t i n 一 5 e x p 一 5 的作 用下 轉(zhuǎn)運到細(xì) 胞漿中 細(xì)胞漿中的 p re一i rna在d i c er 的作用下 剪切產(chǎn)生大 約22 nt大 小的雙 鏈m i rna 見圖1 2 1 孤 321 其中 只有一條單鏈可以 選擇性結(jié) 合到r i sc 中 去而成為 成熟耐rna 一般而言 成熟的 mir na 多為具有 5 端小突 起的那條鏈 價 州側(cè)峪 袱 七 j p c 月 喃 貧 幾 1 路 1 此 組鉗4卜 工紊 內(nèi) j 婦 1 婦 沼 1 州勻 一口 叮 弓廠j 州 們 圖 1 z m i c r o r na 的成熟加 l 過程 f i g l 2 m at u ra t ionan d p roces s i n g o f m ic r 0 r n a 3 zm i rna 加工的核內(nèi)過程 m i r n a 在細(xì)胞核中經(jīng)歷了從最初的m i r n a 基因到大約7 o nt 大小的 m i r n a前體階段 在這個過程中 有多 種不同的 細(xì)胞 核內(nèi) 蛋白 質(zhì)的參與 這些 蛋白質(zhì)相互協(xié)調(diào)作用 保證mi r n a在細(xì)胞核內(nèi)的正常加工 研究已 經(jīng)發(fā) 現(xiàn)m 1 r n a 的 基因絕大部分定位于基因間區(qū) 也有一部分 位于基 因中的非編碼區(qū)域 即內(nèi) 含子中 這 些m i r n a 的基因一般由 r n apom 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄 生 成 的 州一m i r n a長 達(dá) 幾 千 個 堿 基 有 帽 子 結(jié) 構(gòu) cap st 川 c tl 叮 e 和 po ly a 尾 同 時 具有一個或幾個局部 的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu) 以多順反子形式存在 最近的 研究還發(fā) 現(xiàn)大 約5 濺 的 m i r n a基因 彼此相 鄰 簇集 存在 帶有自 己 獨立的轉(zhuǎn)錄啟 動子 可見 m i r n a的基因 也類似 于其他的基因 在不同的 發(fā)育階段及不同的 組織類型中 處 在 po l n的 精 確 調(diào) 控 之 下 33 調(diào) 目 前 推 測由 r n a pom指 導(dǎo) 的 轉(zhuǎn) 錄 可 能 具 有 如下的 優(yōu)點 m 1 r n a基因的 轉(zhuǎn)錄可以 被不同的 pol ll調(diào)節(jié)因子所控制 從而 第 1 章 綜述 使得在不同的發(fā) 育階段 不同的細(xì)胞類型中 表達(dá)特異的 m i r n a m i r n a 和 編碼蛋白 質(zhì)的 基因表 達(dá)可能存在彼此協(xié)調(diào)的作用 尤其是 二者同時位于一個轉(zhuǎn)錄 本時更為明 顯 斌 3 飛 從 如一i rn a到釁一i r n a 的加工 需要細(xì)胞核中 一種叫做微處理器的復(fù)合 體的作用 在其 作用 下 pri m 1 rn a 被 加工成為 p r e m l r n a 這一過程在細(xì)胞核 中完 成 細(xì)胞核中的 微處理器在不同的生物體中 所包含的成分不盡相同 在線 蟲 果蠅及 哺乳動物 體內(nèi) 該復(fù)合體至少 包含有兩種蛋白 質(zhì)成分 分別為d 印 s ha 和p asha p 側(cè) rt n e r ofd 印 sha 在人 類 p as h a 又稱為 dig e o r g e綜合征關(guān)鍵區(qū)域基 因 8 di g eo rge synd ro m e 幣ti cal re gi o n ge nes d ocrs 陽6 3 81 1 3 3m i o r orna加工蛋白 dicer 酶是內(nèi) 切核酸酶rnase ln家族成員 對它的 最早認(rèn)識是來自 對rna 干涉 過程中sir nas 的產(chǎn)生的研究 后來表明它在m i r na 的成熟過程中起著同樣重要 作 用 口 說 d ic er 酶 包 括 pa z 結(jié) 構(gòu) 域 及 含 有 d e x h d e ah 盒 的 rn a 解 旋 酶 結(jié) 構(gòu) 域 近 來通過x 射線晶體衍射分析及核磁共振 陽r 獲得了隊2 結(jié)構(gòu)域的三維立體結(jié)構(gòu) 表 明 它 具 有 異 常 的 ob 折 疊 結(jié) 構(gòu) 其 與 核 酸 的 親 和 性 較 弱 但 持 久 f35 叨 研究 發(fā)現(xiàn) p a z 結(jié)構(gòu)域具有一條由兩個亞結(jié)構(gòu)域所形成的溝 可能是rna 結(jié)合區(qū) 其中一個亞 結(jié)構(gòu)域具有一個由 五條多膚鏈組成的開放p 桶芯結(jié)構(gòu) 兩 條螺旋位于桶的 兩個末 端 以及另一條鏈位于桶的外表面 另一個亞結(jié)構(gòu)域是由連有 螺旋的日發(fā)夾結(jié) 構(gòu)組成 因而d i cer 酶是通過 隊2 結(jié)構(gòu) 域與 p re一 m i r na之間 的相互作 用而行 使切割 功能的134 3 010 d r o s h a 大約1 6 0 k d a 大小 全長大 約1 3 0 0 個 氨基酸 是rn a 酶1 1 1 rna s e l l l 家族成員之一 包含 有一個 脯氨酸富 集區(qū) 精氨酸 一 絲 氨酸富集區(qū) 兩個rna 酶1 11 結(jié)構(gòu)域和c 端的一個雙鏈r n a 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 d o u b l e 一 s t r a n d e drna 一 b i n d i n g d o 呱i n d s r b d 樸 dr o s h a 在線蟲 果蠅以及人類中 具有保守性 d r o s h a 在果 蠅體內(nèi)形成一種大約s o ok 兔大小的復(fù)合體 而在人類體內(nèi)形成的復(fù)合體大約 650k da 大 小 這 一 復(fù) 合 體 即 微處 理 器 135 40 d ro sh a 的 主 要 作 用 是 剪 切 pri ir n a 形成具有3 端z nt懸垂的p re ir na 此為rnaseih 作用的主要 特征 生成的 pre 一i rn a 的具 有3 端 znt懸垂的末 端即為成熟m i rna 的一 端 而mi 朋a 另一端是 由 d i c e r 在距離已 知末 端大約 2 2 n t 的 位點 上剪 切而成的 可見 d rosha 的加工決 定著m i rna 的真正序列 其加工的特異性是mirna 的整個生物發(fā)生過程中特異性最 高的 研究發(fā)現(xiàn) p r i 一 mir na的三維結(jié)構(gòu)是底物特異性的 主要決 定因素 剪切位 點附近雙鏈的莖 部結(jié)構(gòu)和末 端的環(huán) 狀結(jié) 構(gòu) 10 nt 也 是非常關(guān)鍵的 135 一 91 而且 drosha復(fù)合體可以測量莖部的長度 一般在距離末端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)約2 個螺旋轉(zhuǎn)角 第 1章 綜述 h e l i c a lt u r n 大約2 2n t 的地方進(jìn)行剪切 此外 研究還發(fā)現(xiàn)d r o sha 間接地 參與了前 核糖體r na的 加工14041 微處理 器的另一個關(guān)鍵成分是p ash a p asha為d srn a 結(jié)合蛋白 參與 d rosha 對底物的識別 抑制該基因的表達(dá)可以使pri 一 mirna 在細(xì)胞核中的堆積增加 d gcrs是第 一個被鑒定出 來的參與體內(nèi) mi朋a加工過程的p asha 進(jìn)化上具有保守 性 約12 ok da 大小 包含有兩個ds洲a 結(jié)合 結(jié)構(gòu) 域和一個已知的 可以與脯氨酸 富集的多膚相互作用的w份結(jié)構(gòu)域 民c rs 的釋結(jié)構(gòu)域很可能是與d rosha 的n 端 脯氨酸富集區(qū)發(fā)生相互作用的部位137 一 dgc rs是染色體的2 2 q ll 2 的預(yù)測的30 個基因中的 一個 在人類最常見的遺傳綜合征 o i g eo r ge綜合征中非等位性缺 失 所以 有人推 測d i g eorge 綜合征的發(fā)病可能與人類 mirna的加 工和表 達(dá)過程 的 紊亂有關(guān) 口 9 引 1 1 3 4微處理器對pri i r na的剪切機制 drosha 對p ri一 毗rn a 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行特異 性識別的機 制尚未完全明了 研究發(fā)現(xiàn) drosha對發(fā)夾狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)有一定的親和力 而且d rosha 也通過一些可以特異識別 p ri 一 mirn a 的中 介因子而招募p ri一 m i rna 到其剪切位點上進(jìn)行剪切 p as ha 即為 一 種已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有助于d r o s h a進(jìn)行底物特異性識別的蛋白質(zhì) h an 等提出了關(guān)于 pr i 一 麗 rn a剪 切 機 制 的 一 個加 工中 心 的 模型 1401 該 模型 認(rèn) 為 d ro sh a 與 p as ha 形成異二聚體 對 p ri一 mir n a的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分 進(jìn)行剪切 其中 d r osh a結(jié)合 在遠(yuǎn)離末端環(huán)的 雙鏈rn a 上 兩 個rnase hi結(jié)構(gòu) 域 r l 工 i da 和r hi d b 形成分子 內(nèi) 二聚體 構(gòu)成 一個加工中心 加工中 心中的兩 個活性位點緊 密相鄰 在距離 末 端環(huán)約兩個螺旋 轉(zhuǎn)角的地方 在相反方向 上剪切 r na 鏈 上鄰近的磷酸二酷鍵141 1 rl工 i da一側(cè)的催 化位點催化3 鏈的剪切 而r l l l db一側(cè)的 催化位點則催化5 鏈 的剪切 活性中 心位點由 對應(yīng)于超耐 熱菌 a q 叮倫萬 aeoiz c u 川 釣 朋 ase i h 中谷氨 酸e 4 0 天冬 氨酸d 44 d i o 7 和ello 而 pash a則結(jié)合在靠 近末端 環(huán)狀結(jié)構(gòu)的部分 有助于p ri i r 卜 a 的 識別及微處理 器在底物分子上的定向l 2 3 spr行 i r n a 的 細(xì)胞核輸出 drosha對pri 一 而rna 加工完畢之后 產(chǎn)生的pre 二i rna 需要 輸出 到細(xì)胞漿中 才 可以在d i c er作用下生成大約22 nt大小的mirna 雙鏈 這一輸出過程需要 pre 一 耐rna 在核孔轉(zhuǎn)運受體的作用下穿過位于核膜上的核孔復(fù) 合體 而進(jìn)入細(xì)胞 漿中 135 刀3 司 現(xiàn) 在已 經(jīng) 確 定 進(jìn)行 p re i rn a輸出 的 主 要 核 孔 轉(zhuǎn) 運 受 體為 e xp 一 50 除 此之外 e x p 一 5 可以 少量地輸出 t r na和腺病毒rnav a e xp 一 5 對 底物進(jìn)行 識別的 第 1 章 綜述 特異 性是由 底物所具 有的 特征性 微小螺旋 所決定的 與序列 無關(guān) 該螺旋中 包含有大于1 4 b p 堿基對 的莖部和 3 一 s nt的 3 端懸垂 而pre 一i rna 所具有的 類 似的莖部結(jié)構(gòu)和大約znt的3 端懸垂使得e xp一 5 對其的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他 兩 種底物 而 且pre i r 刊 a 在細(xì)胞中 的含量相當(dāng)高 所以 很可能pre 一 mi rna 就是e xp一 5 進(jìn)行 輸出的 主要底物 exp s 與r an 一 gtp 以及pre m i 剛a 形成異三聚體 通過核孔到 達(dá)胞漿后 r a n 一 tp轉(zhuǎn)變?yōu)?r an劣dp 釋放出 pr鱺 i r na 此外 還發(fā) 現(xiàn)pre 二i r n a 與 ex p 一 5 結(jié) 合 之后 還 可以 穩(wěn)定 pr e 一 毗 rn ala 401 t 4llticr峨na 的作用機制 mir na 能夠通過兩種沉默機制中的一種指導(dǎo)r l sc下調(diào)目的基因的表達(dá) r n a 的切割或翻譯抑制 如果m rna 與mirna 具有完美的互補性 耐r na就指導(dǎo)m r na特異 性切割 或者如果兩者沒有足夠的互補性 則而rna 就指導(dǎo)翻譯抑制 見圖1 3 4 1 麗r 湘指導(dǎo)靶m 倪 以的切割 大多數(shù)植物mir na與靶序列的開放閱讀框 o r f 完全匹配 因而在植物 中 mi即a 主要進(jìn)入rna 千涉途徑以降解靶分子 植物中的r l sc是由arg o n a u t e ago 蛋白 血rna 或51刪a 及相關(guān)蛋白 組成 3i一 a go蛋白具 有與d i cer 酶一樣的p az結(jié)構(gòu) 域以及 p l wj結(jié)構(gòu)域 pl雨結(jié)構(gòu)域具有與r nas 州類似的結(jié)構(gòu) 據(jù) 報道 mirna 的 3 末 端位 于paz 結(jié)構(gòu)域的親水性結(jié)構(gòu)域內(nèi) 而靶分 子位于 pl肛結(jié)構(gòu) 域中 兩者識別互 補之后 剛a 酶水解作用于靶分子中與 mir n a 的第11或第12堿基 所對應(yīng)的殘基的磷 酸 鍵 隨后 降解靶分子的 5 端序列 因 而當(dāng) m i rna 指導(dǎo)切割時 切點的 位置是由 相 關(guān)的 mi r 刊 a 的 殘 基 所 決 定 即 從 配對 區(qū) 的中 部向 m rn a 的 5 方向 切 割 13 1 在 植 物 中 兩者完全匹配在大多數(shù)情況下是引起切割 但是有時并非如此 m ir一 17 2 與 成r 一 17 2 樣基因與 靶分 子完全匹 配卻 產(chǎn)生翻譯抑制 研究人員發(fā) 現(xiàn) 經(jīng)過切 割之后 靶分子上與 耐r 漱匹配位點相鄰 的序列會產(chǎn)生內(nèi) 源性的sir na 以 增強沉 默效應(yīng) m ir na切割之后 耐rna 仍然是完整的 而且能夠指導(dǎo)另外的m rna 的識別和切割隊 鉚 1 4 2翻譯抑制 通常動物mirna 與靶m 翩a 的3 一 u t r 部分序列反向互補結(jié)合 與rnai不同的是 靶mrna的穩(wěn)定 性不 受影響 而其 翻譯起始后的表 達(dá)受到影響 這種新的調(diào)控機制 首次 在 線蟲 的l i n 一 14 m r na得 到 證實 l i n 一 1 4 m rn a 受l i n 一 4 麗 洲 a 的 調(diào)控 135 1 第 1 章 綜述 m i r n a 可能 抑制翻譯的延伸或終止 或降 解核搪體新合成的新生膚鏈 然而簡單地 影響翻譯延伸是不可能的 因為未受到抑制的多核糖體的形態(tài)與由 耐r na抑制的 靶mrna 的多核糖體的形態(tài)是相同的 當(dāng)lin 一 14蛋白水平下降時 難以區(qū)分處于線 蟲幼蟲第一階段和幼蟲后期階段的l i n 一 14 m r n a 的多核搪體外型 具體的調(diào)控機 制目 前 還 不 是 很 清 楚 有待 于 科 學(xué)家 進(jìn)一 步 研 究 1391 多 數(shù) mi rn a 是以 m ir np形式與 靶m r n a 結(jié)合并使之抑制 最近研究人員發(fā)現(xiàn) 處于不穩(wěn)定狀態(tài)的袱n a的3 一 u tr 中的富含a u 元件 a r e s 能夠指導(dǎo)m r na的降解 參與m irna加工和功能行使的蛋白 即d ice r 一 1 a g ol和a g o 2 是q 腫瘤壞死因子mrna快速降解所必需的 該m r n a 含有 a r e s 元件 人的mir 一 16具有與a r es互補的u a 從u a uu 序列 它使得具有a r e s 的rna 易于降解137 40 1 4 3靶分子的識別 線蟲l i n 一 1 4的3 一 u t r 具有與l i n 一 4 m i r n a的5 區(qū)域互補的核心區(qū)域 這說 明 多 細(xì) 胞 動 物 mi rn 人 5 端互 補的 重 要 性 123 這可 從以 下 事 實 得 到支 持 l 幾 種 無脊椎動物的mirna的2 8殘基與靶m rzna3 utr是完全互補的 2 在第一 個確認(rèn)的無脊椎動物的 mirna 與靶分子的互補位點之間 誡n a 與耐rna z 8殘基 配對的部分在其它種類的同源信息中是完全保守的 一個鄰近的至少六個堿基對 的螺旋幾乎總是出現(xiàn)在這個區(qū)域 3 mirna 的2 8 殘基在同 源的后生動物mir na 中是保守的 4 預(yù)測哺乳動物麗rna 的靶分子時 要求跨越mir n az一8 殘基的七 聚體具有完全的堿基配對 比要求m i rna 的其它任何一個七聚體的配對更有效率 6 2 乃 如果 不考慮互補位點其它區(qū)域的互補程度 與核心區(qū) 域的錯配就可抑制起 始時對靶分子的識別 因而阻止了切割或翻譯抑制 如果同時允許mir na的其余部 分有足夠的配對 將產(chǎn)生切割作用 然而僅由 一些側(cè)翼配對來補充核心配對 再與 ri sc 共同 作用 足以 介導(dǎo) 翻譯 抑制131 一381 1 4 4快速脫腺昔酸化 枷 等人以 mir 一 1 2 5b和l et一 7 兩種代表性的mir na為研究對象 以啟動子一 熒光 素酶或p 球蛋白為報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)它們能夠促進(jìn)m rna 聚腺昔酸尾巴 p oly at ail 的 去 除 135 刁 9 研 究 人員 用3 組 蛋白 莖 一 環(huán) 結(jié) 構(gòu) 取 代聚 腺 昔 酸 尾巴 結(jié) 果發(fā) 現(xiàn)不 但 可以消除 m ir一 1 2 5 b對m r n a 含量的影響 還可以降低對蛋白 質(zhì)合成的作用 由 此 可知 耐rna 通過降低