（遺傳學(xué)專業(yè)論文）棉鈴蟲滯育激素基因啟動子分析.pdf

巾科! 學(xué)技術(shù)人學(xué)碩十! 學(xué)位論文作者洪波 專業(yè)：i i 圣傳，7 a g b h l h b o r n b r c g r p c n s c r e c r e b d h a b d o m i n a lg a n g l i o n b a s i ch e l i x - l o o p - - h e l i x b o m b y xm o r i b r a i n 縮略詞表 c a l c i t o n i ng e n er e l a t e dp e p t i d e c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n t 腹神經(jīng)節(jié) 基礎(chǔ)的螺旋環(huán)螺旋 家蠶 腦 降鈣素基因相關(guān)肽 中樞神經(jīng)系統(tǒng) c a m p 應(yīng)答元件 c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n c a m p 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 d i a p a u s eh o r m o n e d h m b p d h m o d u l a t o r - b i n d i n gp r o t e i n d r m e m s a e p f b h a r i p o u m e f 2 m g m t p b a n p t t h r a c e r p p t s g s l g t b p t g d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s e p i d e r m i s f a tb o d y h e l i c o v e r p aa m i g e r a i n h i b i t o ro fp o u m y o c y t ee n h a n c e rf a c t o r2 m i d g u t m a l p i g h i a nt u b u l e 滯育激素 滯育激素調(diào)節(jié)了結(jié)合蛋白 黑腹果蠅 凝膠阻滯分析 表皮 脂肪體 棉鈴蟲 p o u 的抑制了 肌細(xì)胞增強(qiáng)因予2 中腸 馬氏管 p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n gn e u r o p e p t i d e 性信息素合成激活肽 p r o t h o r a c i c o t r o p i ch o n n o n e r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s r a t p r e p r o t a c h y k i n i n s l i b o e s o p h a g e a lg a n g l i o n s a l i v ag l a n d t a t ab o xb i n d i n gp r o t e i n t h o r a c i cg a n g l i o n 促前胸腺激素 c d n a 末端快速擴(kuò)增 小鼠前速激肽原 咽下神經(jīng)節(jié) 涎腺 t a t a 盒結(jié)合蛋白 胸神經(jīng)節(jié) 巾科。披術(shù)火學(xué)碩士學(xué)位論文作：檔洪波 + 專業(yè)遺傳- 學(xué) 摘要 滯育激素( d h ) 和性信息素合成激活肽( p b a n ) 是調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育利性激素合 成的兩個重要的神經(jīng)肽。它們由同一個基因所編碼，稱為d h p b a n 基因。本研究 重點圍繞著棉鈴蟲d h p b a n 綦因的肩動了的相關(guān)的調(diào)控元件和可能的轉(zhuǎn)錄因了進(jìn) 行了一系列實驗。首先構(gòu)建了不同長度的d h p b a n 基因的啟動了連接到l u c i 熒光 素酶報告基因上游的報告質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)家蠶b m n 細(xì)胞，測定其啟動了的轉(zhuǎn)錄 活性。結(jié)果顯示，在棉鈴蟲d h p b a n 啟動予上包含多個調(diào)節(jié)區(qū)域，它們能激活或 者抑制d h p b a n 啟動予的活性。一個激活區(qū)域( 一4 6 7 3 7 1b p ) 能激活d h p b a n 肩動了的轉(zhuǎn)錄，而另一個抑制區(qū)域( 一9 6 5 一5 3 4 ) 能抑制其肩動了的活性。 凝膠阻滯分析顯示在棉鈴蟲咽下神經(jīng)節(jié)的核蛋白中，兩個可能的轉(zhuǎn)錄因了 h a r d h m b p l 和h a r d h m b p 2 能特異地結(jié)合其激活區(qū)。進(jìn)步，在棉鈴蟲d h p b a n 基因的啟動子上發(fā)現(xiàn)了一個e b o x ( c a g c t g ) 調(diào)控元件，能與一個核蛋白 因了h a r d h m b p 3 結(jié)合。e b o x 是b h l h 家族轉(zhuǎn)錄因了結(jié)合的d n a 核心元件，推 測h a t d h m b p 一3 可能是b h l h 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。e 。b o x 的缺失將導(dǎo)致 d h p b a n 基因的啟動予轉(zhuǎn)錄活性的下降，可能調(diào)節(jié)已經(jīng)定位的激活區(qū)?？傊?，在 棉鈴蟲d h p b a n 基因的啟動予上，多個調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因_ 了包含在d h p b a n 基 因的轉(zhuǎn)錄過程。 在棉鈴蟲d h p b a n 基因的啟動予的上游，發(fā)王見了多個f o r kh e a d 轉(zhuǎn)錄因了結(jié)合 位點。因此，我們克隆了棉鈴蟲的f o r kh e a d 轉(zhuǎn)錄因予，f o r kh e a d 轉(zhuǎn)錄因了在家蠶細(xì) 胞株b r a n 中過量表達(dá)能夠增強(qiáng)棉鈴蟲d h p b a n 啟動了活性。n o r t h e r nb l o t 表明f o r k h e a d 轉(zhuǎn)錄因予表達(dá)在棉鈴蟲的多種組織。半定量r t - p c r 顯示f o r kh e a d 轉(zhuǎn)錄因了在 滯育個體腦中幾乎不表達(dá)。在中腸中，滯育和非滯育的個體f o r kl i e a d 的表達(dá)趨勢j l 乎相同，都是幼蟲期表達(dá)量低，到了預(yù)蛹和蛹期表達(dá)量開始大量增加，這可能與棉 鈴蟲的滯育過程中的一些發(fā)育事件相關(guān)。 關(guān)鍵詞：滯育激素；性信息素合成激活肽；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；e b o x ；轉(zhuǎn)錄因了：棉鈴蟲： f o r kh e a d 轉(zhuǎn)錄因子；滯育。 巾科! 學(xué)技術(shù)大學(xué)碩士學(xué)位論文作者洪波專業(yè)遺傳o a b s t r ac t d i a p a u s eh o r m o n e ( d h ) a n dp h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n gn e u r o p e p t i d e ( p b a n ) a r et w oc r u c i a ln e u r o p e p t i d e sw h i c hr e g u l a t e i n s e c td e v e l o p m e n ta n ds e x p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sr e s p e c t i v e l y t h e s ep e p t i d e sa r ee n c o d e db yas i n g l eg e n e ， t e r m e dd h p b a ng e n e i nt h i ss t u d y ，w ec h a r a c t e r i z e dt h ep r o m o t e ro ft h ed h p b a n g e n e ir a h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ( h a r ) t r a n s i e n tt r a n s f e c t i o na s s a y su s i n gas e r i e so f s t e p w i s ed e l e t i o nf r a g m e n t sl i n k e dt o t h el u c i f e r a s e r e p o r t e rg e n ei n d i c a t e t h a tt h e p r o m o t e rc o n t a i n sm u l t i p l er e g u l a t o rd o m a i n st h a tc a na c t i v a t ea n dr e p r e s sr e p o r t e rg e n e e x p r e s s i o n t h ef r a g m e n ts p a n n i n g 一4 6 7t o 一3 7 1 b po ft h ed h p b a np r o m o t e ri s a n a c t i v a t o rd o m a i no ft r a n s c r i p t i o n ，w h e r e a st h er e g i o nf r o r t i 一9 6 5t o 5 3 4b pr e p r e s s e st h e p r o m o t e ra c t i v i t y i nt h ei n s e c tc e l ll i n eb r a n e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s d e m o n s t r a t et h a ta tl e a s tt w on u c l e a rp r o t e i nf a c t o r sf r o mt h en u c l e a rp r o t e i ne x t r a c t so f ha r m i g e r as u b o e s o p h a g e a lg a n g l i o n ，h a r d h m b p 一1a n d 一2 ( d h - m o d u l a t o 卜b i n d i n g p r o t e ir a ) c a ns p e c i f i c a l l yb i n dt ot h ea c t i v a t i n gr e g i o n f u r t h e r m o r e ，w ec h a r a c t e r i z e di n d e t a ilt h a tt h en u c l e a rp r o t e i nf a c t o rh a r - d h m b p - 3c a ns p e c i f i c a ll yb i n dt oac l a s s i c a l e b o x ，c a g c t gl o c a l i z e da tp o s i t i o n 一3 6 0 一3 5 5b p ，ap o t e n t i a ls i t ef o ri n t e r a c t i o nw i t h b a s i ch e l i x l o o p h e l i xt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s m u t a t i o no ft h i se b o xr e s u i t si nas i g n i f i c a n t r e d u c t i o no ft h ep r o m o t e ra c t i v i t y ，s u g g e s t i n gi tc a nm o d u l a t et h ep r e v i o u s l yi d e n t i f i e d a c t i v a t o rd o m a i n t a k e nt o g e t h e r , m u l t i p a r t i t ec i s e l e m e n t sa n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r si n t h ed h p b a np r o m o t e ra r ei n v o l v e di nr e g u l a t i o no f t h eg e n ee x p r e s s i o n s e v e r a lf o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e sa r ei n v o l v e di nh a r d h - p b a n p r o m o t e r w ec l o n e dt h ef o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o rf r o mh e l i c o v e r p aa r m i g e r a f u n c t i o n a la n a l y s i ss h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i o no ff o r ki l e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o ri n t i l e b o m b y xc e l ll i n eb m n a c t i v a t e dt h ep r o m o t e ro fh a r d h p b a n n o r t h e r nb l o ta n a l y s i s s h o w e dt h a tf o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o rg e n ei s e x p r e s s e din n o n n e u r a ia n dn e u r a l t i s s u e s s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a t f o r kh e a dm r n air at h e b r a i no fd i a p a u s ei n d i v i d u a li sn o te x p r e s s e d i nt h em i d g u to fd i a p a u s ea n dn o n d i a p a u s e t y p e ，t h el e v e lo ff o r kh e a dm r n ao fe a r l ya n dm i d d l es t a g e so f6 mi n s t a rl a r v a ew a s l o w e rt h a ni a t e6 mi n s t a rl a r v a ls t a g ea n de a r l yp u p a ls t a g ei nb o t ht y p e s t h e s e d a t a s u g g e s tap o s s i b l er o l ef o rf o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o ri nt h ed e v e l o p m e n ti nd i a p a u s e p l o c e s so fh e l i c o v e r p aa r m i g e r a k e y w o r d ：d i a p a u s eh o r m o n e ；p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n gn e u r o p e p t i d e ； t r a j l s c l i p t i o n a lr e g u l a t i o n ；e b o x ；t r a n s c r i p t i o nf a c t or ；h e l i c o v e r p aa r m ( g e r a ；f o r kh e a d t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；d i a p a u s e 巾l i 科0 ：技術(shù)人! 學(xué)碩十學(xué)位論文作名洪波 專業(yè)遺傳￥ 棉鈴蟲滯育激素基因啟動子分析 前言 1 神經(jīng)元特異基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 在細(xì)胞中，一些特異基因的表達(dá)決定它的表型。這些基因的表達(dá)是由一些組織 特異的、發(fā)育的和牛理性的刺激的所決定。這些特異基因的表達(dá)由細(xì)胞接受的胞外 信號所激活或者抑制?；虮磉_(dá)能在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控，例如m r n a 的合成；基因表 達(dá)也能在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，例如m r n a 的剪切和穩(wěn)定性。神經(jīng)系統(tǒng)在機(jī)休中是最復(fù) 雜的組織，表現(xiàn)出一種細(xì)胞表型的多樣性。這種多樣性可能反映在細(xì)胞分化過程- 二p 苯因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制的多樣化。在神經(jīng)元中，基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)是非常 復(fù)雜的，通常應(yīng)答于細(xì)胞接受到的多種胞外刺激。另外，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育利隨著神 經(jīng)元分化成獨特的神經(jīng)元的表型過程中，是一個各種基因表達(dá)的激活和抑制的相可 作用的過程。 基因在體內(nèi)是包裝在非常緊密的染色體中。染色體的結(jié)構(gòu)是可變的，如果一些 染色體區(qū)域的結(jié)構(gòu)是濃縮狀態(tài)的，認(rèn)為這個區(qū)域的d n a 不能與大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因了相 瓦作用的，因此這個區(qū)域的基因是轉(zhuǎn)錄沉默的。如果一些染色體區(qū)域的結(jié)構(gòu)是開放 的，則一些轉(zhuǎn)錄因子就可能與這個區(qū)域的d n a 相互作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活。因此研 究神經(jīng)元特異基因的表達(dá)，染色體結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)也是非常重要的一豺i 。 處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)的染色體上的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控取決于基因上游或者基因內(nèi)部 的一些保守的d n a 元件和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。這些轉(zhuǎn)錄因了決定啟動了的活力， 刺激或者抑制基因表達(dá)的水平。在所有基因的啟動了上，存在有限數(shù)量的保守的 d n a 元件，這些元件由一些轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族所識別，而這些蛋白家族的成員常常 表達(dá)在一個組織，有相同的發(fā)育和刺激誘導(dǎo)模式。能識別這些特異的d n a 元件的 蛋白數(shù)量因為各種轉(zhuǎn)錄因予之間形成異二聚體而數(shù)量大增，從而用有限數(shù)量的蛋白 進(jìn)行非常復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，比如一種轉(zhuǎn)錄因了如果與一個它的搭檔形成二聚體， 它j l 哿引起某個基因的轉(zhuǎn)錄激活，但是如果它與另一個它的搭檔形成二聚體，將引起 某個摹因的轉(zhuǎn)錄抑制。在基因的啟動了上存在一些保守的d n a 元件，這些轉(zhuǎn)錄復(fù) 合體有不同的親利力與特異的保守d n a 序列結(jié)合，行使不同的功能。這些d n a 元 件在肩動了上排列和定位導(dǎo)致了結(jié)合在這些元件一l 的轉(zhuǎn)錄因了的相瓦作用。這些 4 科。j j 技術(shù)人學(xué)碩? 卜! 學(xué)位論文作描洪波 d n a 功能元件的組合對于多細(xì)胞生物產(chǎn)?；虮磉_(dá)的多樣性是需要的。| 三i 前，通過 無性繁殖細(xì)胞系的使用，一些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制的已經(jīng)研究。仙有一個前提，那 些要研究的基因在某個細(xì)胞系中是有活力的。通過這個研究可以回答二個問題。 l ，允許轉(zhuǎn)錄因了結(jié)合的d n a 區(qū)域在哪里? 2 ，在各種細(xì)胞系中，或者在細(xì)胞應(yīng)答各種刺激下，j 南動了增強(qiáng)基因表達(dá)的能力如 何? 3 ，和d n a 元件相可作用的轉(zhuǎn)錄因了是什么? l 1 基因表達(dá)的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制 核心肩動予認(rèn)為位于轉(zhuǎn)錄起始位點周圍，由r n a 聚合酶i i 和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因了識別 的區(qū)域，這個區(qū)域?qū)τ谌魏无D(zhuǎn)錄的發(fā)生都是重要的。在真核細(xì)胞中，r n a 聚合酶i i 是大多數(shù)功能基因轉(zhuǎn)錄的聚合酶，至少由十個組分組成的多亞基復(fù)合物( n a k a t a n i e ta 1 19 9 0 ) 。r n a 聚合酶ii 識別的核心肩動予包含t a t ab o x 并l i 通常有一個i n i t i a t o r m o t i f 。r n a 聚合酶i i 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與核心肩動予的結(jié)合是由基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因了t f i i d 經(jīng) t b p ( t a t ab o xb i n d i n gp r o t e i n ) 與t a t ab o x 相瓦作用引發(fā)的( u s h e v ae t a 1 ，1 9 9 2 ) 。然后一系列的其它基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因予和r n a 聚合酶i i 結(jié)合形成一個多亞基的 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物從而轉(zhuǎn)錄起始。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物也是結(jié)合在啟動予其它區(qū)域轉(zhuǎn)錄因 了與之相瓦作用的靶( d y n l a c h te ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 1 2 啟動子上的調(diào)控元件 轉(zhuǎn)錄因了根據(jù)與特異的d n a 序列結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，利與一些蛋白結(jié)合的二聚化的結(jié) 構(gòu)域，可以分成一些家族( h ea n dr o s e n f e l d ，1 9 9 1 ；l a t c h m a n ，1 9 9 3 ；s t r u h l ，1 9 9 1 ) 。 轉(zhuǎn)錄因予以一種序列特異型的方式與d n a 元件相互作用。在肩動了上，有一些有限 數(shù)量的、保守的d n a 元件，它們通常是由6 到1 2 堿基組成的短d n a 序列?；谔囟?家族轉(zhuǎn)錄因子與d n a 元件結(jié)合序列的比對，每個家族的轉(zhuǎn)錄因了結(jié)合的特異d n a 元 件都擁有共同的保守序列( 表1 ) 。這些元件能被一些組織特異性的、發(fā)育的、刺 激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因予家族所識別，因此決定了什么轉(zhuǎn)錄因了與肩動了結(jié)合以及與肩動 了結(jié)合的位置，最終決定了特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機(jī)制 ( 圖1 ) 。 1 3 啟動子功能的分析 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)碩士學(xué)位論文 作者洪波 專業(yè)遺傳學(xué) 1 3 1 報告基因構(gòu)建的瞬時表達(dá)分析 要利用瞬時轉(zhuǎn)染分析對基因的啟動子進(jìn)行研究，必須完成下列步驟：選擇合 適的細(xì)胞系；確定將d n a 導(dǎo)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染程度；選擇報告基因和相應(yīng)的報道分 析方法；鑒定目的基因的假定啟動子區(qū)；將啟動子插入到合適載體內(nèi)報告基因 的上游。上述這些初始步驟完成后，就可以進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染實驗，以確定是否可以檢 測得到啟動子依賴型報道基因的活性。 t + t i 黜硝砸刪砌咖r t i s s u er c s 口i c t e dr e p r o o f r e p r e s e n m i l lh e t e r o d t m s r “哪睜nd l f f o r o r s tm e m b e r so f 竹m 4 t w i qm t r t r l p 矗o nh c 蜘r f a z m l l y l r h ed i f f e r e n t i d r a p r e s e n t sd i s l h l 畸tm i e n so fi l l m tf a m i l y ；g r e yi s u b l q u l t e m f l ys x p r m m e df a c l o rm n d 帥o i h s n s n - 岫u r m s t m t c t s di n 時m l re x p n m s l o n 圖i 一個基因的啟動子區(qū)能與組成型的和組織特異的轉(zhuǎn)錄因子相互作用。這些轉(zhuǎn)錄因子可能是 基因表達(dá)的增強(qiáng)或抑制因子。這些因子以單體或與別的蛋白形成多聚體的形式與d n a 結(jié)合。核 心啟動子與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子和r n a 聚合酶i i 相互作用，這是對轉(zhuǎn)錄的起始非常重要的。 表1 轉(zhuǎn)錄因子家族和它們識別的d n a 元件 f a m i l y c o n s e n s u ss e q u e n c e m e m b e r s a p l t g ac ( 3 t c a b a s i ch e l i x l o o p - h e l i x ( b h l h ) c a n n t g o c t a m e r b i n d i n gp r o t e i n a t g c t a a t c a m p r e s p o n s i v e ( c r e b a t f ) t g a g c t c a c - j u n ，c - f o s ，j u n d u s f ，m y o d ，m a s h ，a p 一4 ，c m y c o c t a m e ri ，b r n3 c r e b ；心f - 1 6 巾科7 ：披術(shù)人t 碩十學(xué)位論文作者洪波 l ，細(xì)胞材料 用于瞬時轉(zhuǎn)染分析的細(xì)胞材料必須符合二項標(biāo)準(zhǔn)：它們應(yīng)表達(dá)含有目的肩動 了的內(nèi)源基因；能使培養(yǎng)物中的細(xì)胞在2 3 天內(nèi)保持?jǐn)?shù)i - ：1 恒定，以保證實驗的完 成：必須有一套將質(zhì)粒d n a 轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的方法。 如果難以獲得表達(dá)內(nèi)源目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，可以嘗試分離表達(dá)i 源目的綦醫(yī)l 的原代芻1 胞的方法。仙是原代細(xì)胞通常難以分離分離科i 保存，且對于常用的轉(zhuǎn)染方 法有抗性。另外，根據(jù)目的調(diào)控區(qū)的性質(zhì)，可以合理地檢測與沒有表達(dá)相關(guān)內(nèi)源苯 區(qū)| 自勺細(xì)胞類型密切相關(guān)的另一種細(xì)胞類型。相關(guān)的細(xì)胞類型中可能含有許多摹因活 性所需的轉(zhuǎn)錄因予。因為在人工瞬時轉(zhuǎn)染分析中，這種相關(guān)細(xì)胞中抑制內(nèi)源基因的 機(jī)制可能不發(fā)揮作用，可能檢測到肩動- 了活性。仙是，該策略遠(yuǎn)不是理想的選擇， 一般用作最后的憑借予段。 2 ，轉(zhuǎn)染程序 已有多種轉(zhuǎn)染方法用于瞬時轉(zhuǎn)染分析，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、d e a e 一葡聚糖轉(zhuǎn)染、 電穿孔轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、利用其他陽離予試劑的轉(zhuǎn)染科i 原牛質(zhì)體轉(zhuǎn)染。對給定的 細(xì)胞系，為確定哪種轉(zhuǎn)染方法最可能成功，應(yīng)首先進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，確定f 哪種方法已 經(jīng)成功地用于某種細(xì)胞株，或相關(guān)細(xì)胞系( 既來源與相似組織的細(xì)胞系) 。 3 ，報告基因，載體和分析方法 瞬時轉(zhuǎn)染中，除了鑒定合適來源的細(xì)胞外，還要選擇一種合適的報告基因，將 報告撼因的m r n a 、蛋白質(zhì)和酶水平( 或活性) 作為衡量肩動了活性的指標(biāo)。利用 報道基因，而不用受調(diào)控區(qū)控制的生理基因，其優(yōu)點使報道基因能消除將質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄 物和內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物區(qū)分的網(wǎng)難。 最常用的報告基因來源于昆蟲( 熒光素酶) 或原核牛物( c a t 矛i 1 1 3 - 半乳糖苷 酶) ，它們所編碼的酶活性在大多數(shù)真核細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)。一般：睜k t 的肩動了區(qū)捅入 報道摹因編碼序列的上游，因為報道基因通常含有k o z a k 共有序列( e l i 含有真核翻 i ：g ：1 記- h - 一, ，密碼了的序列) 和下游p o l ya 信號，由r n a 聚合酶i i 合成的r n r n a 能有效地 翻譯成蛋白質(zhì)。通常測定相應(yīng)的酶活性可檢測到這些報道基因表達(dá)活性于肩動了轉(zhuǎn) 錄起始頻率大致成比例，因此報道基因檢測提供了一種合理又精確的肩動了活性評 價方法。 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)碩士學(xué)位論文 作者洪波專業(yè)遺傳學(xué) 4 ，質(zhì)粒的構(gòu)建 要分析啟動子的活性，就必須將假定的啟動子序列插入到報道基因的上游。為 了選擇要插入報道載體的合適d n a 片段，必須首先確定翻譯起始密碼子和轉(zhuǎn)錄起始 位點的位置。 一般來講，初步研究過程中啟動子片段的下游界限應(yīng)選擇在轉(zhuǎn)錄起始位點和 a t g 之間。已有報道說明功能性啟動子元件位于這一轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)區(qū)中，因此，插入片 段應(yīng)包括盡可能多的非翻譯區(qū)。 插入報道載體啟動子片斷的合適上游界限更難進(jìn)行界定。有些啟動子具有強(qiáng)的 活性，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 0 0 - - 一3 0 0 b p 處進(jìn)行正確的調(diào)控。而有些啟動子如果不帶 有遠(yuǎn)距離調(diào)控區(qū)( 如增強(qiáng)子) ，則不能行使調(diào)控，就不可能產(chǎn)生可檢測的活性。 1 3 2 轉(zhuǎn)基因分析 利用轉(zhuǎn)基因的方法，果蠅的f m r f a 神經(jīng)肽的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理得到了深入的研究。 把f m r f a 基因的上游序列連接到一個報告基因上游，通過p 轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因， 可以在活體水平上分析啟動子上與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的重要單元盒。利用這種方法，發(fā) 現(xiàn)了f m r f a 基因的一個增強(qiáng)子上有三個轉(zhuǎn)錄因子a p t e r o u s 的結(jié)合位點，它們對基 因的特異表達(dá)起到關(guān)鍵作用( 圖2 ；b e n v e n i s t ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。a p t e r o u s 是一個具有 l i m 同源盒結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。 a a8 c bc 圖2 通過果蠅轉(zhuǎn)基因的方法研究轉(zhuǎn)錄因子a p t e r o u s 對 f m r f a 神經(jīng)肽的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。( a ) f i v r f a 神經(jīng)肽上游 增強(qiáng)子上由三個轉(zhuǎn)錄因子a p t e r o u s 的潛在結(jié)合位點( - - 個 空白區(qū)) ，把野生型和a p t e r o u s 結(jié)合位點突變的增強(qiáng)子連 在h s p 基本啟動子的上游，下游接有l(wèi) a c z 報告基因。把構(gòu) 建好的片段通過p 轉(zhuǎn)座子整合到果蠅基因組中。( b ) 野生 型增強(qiáng)子能驅(qū)動l a c z 報告基因在表達(dá)特異表達(dá)f m r f a 的 神經(jīng)分泌細(xì)胞中表達(dá)。( c ) a p t e r o u s 結(jié)合位點被突變后， 則檢測不到l a c z 活性。( 引自b e n v e n i s t e e t a l 1 9 9 8 ) 。 中國科學(xué)技術(shù)太學(xué)碩士學(xué)位論文作者洪皺 專業(yè)遺傳學(xué) 1 3 3 利用昆蟲桿狀病毒瞬時轉(zhuǎn)染分析 最近，s h i o m i 等對于家蠶p t t h 神經(jīng)肽的啟動子活性的研究中，建立了一套 利用重組桿狀病毒a c n i w 轉(zhuǎn)染p t t h 啟動子連接報告基因綠色熒光蛋白( g f p ) 進(jìn)入中心神經(jīng)系統(tǒng)的方法( s h i o m i e ta i ，2 0 0 3 ) 。使用這個系統(tǒng)，他們能很好的在家 蠶腦的兩對分泌p t t h 的神經(jīng)分泌細(xì)胞中觀察到在p t t h 啟動子控制下的綠色熒光 蛋白( g f p ) 的表達(dá)。從而找到了一個參與家蠶p t t h 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄 因子m y o c y t ee n h a n c e r f a c t o r 2 q v i e v 2 ) ( 圖3 ：s h i o m ie ta 1 2 0 0 5 ) 圖3 通過昆蟲桿狀病毒瞬時轉(zhuǎn)染分析的方法研究家蠶p t t h 基因啟動子在家蠶p t t h 神經(jīng)分泌 細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性。( a ) p i t h 神經(jīng)肽基因啟動子下游接有g(shù) f p 報告基因。把構(gòu)建好的片段 通過昆蟲桿狀病毒a c n p v 轉(zhuǎn)染到家蠶中樞神經(jīng)系統(tǒng)。( b i ) 不同長度p t t h 啟動子驅(qū)動的g f p 在家蠶p m 神經(jīng)分泌細(xì)胞的特異性表達(dá)。其中b 為最長的啟動子s 7 0 b p ，i 為最短長度的啟動 子8 0 b p 。從b 到l ，扁動子長度依次變短。( j ) 不同長度p ”h 啟動子驅(qū)動的g f p 在家蠶p t t h 申經(jīng)分泌細(xì)胞的特異性表達(dá)的相對熒光強(qiáng)度( 引自s h i a m ie t a l 2 0 0 5 ) 。 9 巾科! j o 技術(shù)大學(xué)碩士學(xué)位論文作者洪波 i 4 調(diào)節(jié)神經(jīng)元特異基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族 1 4 1 轉(zhuǎn)錄激活子a p 1 a p 1 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物識另i j t g ac gt c a 保守的d n a 序列， c - j z l n ，c - f o s 家族的 成員利別的組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體( c u r r a na n df r a n z a ，1 9 8 8 ；f r a n z ae ta 1 ， 1 9 8 8 ) 。a p 1 已經(jīng)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注，因為它是最早特征的轉(zhuǎn)錄因 了之一，在許多神經(jīng)元和神經(jīng)元驅(qū)動的細(xì)胞中，它應(yīng)答許多胞外信號而向上調(diào)控的 ( c u r r a na n dm o r g a n ，1 9 8 5 ；m o r g a na n dc u r r a n ，1 9 9 1 ；n a t a n j oe ta 1 ，1 9 9 】a ，1 9 9 1 b ) 。 然而在基因調(diào)節(jié)的過程中，a p 1 的各種功能仍然不清楚。 大量的研究已經(jīng)顯示a p 一1 家族轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答與多種胞外刺激，包括神經(jīng)牛長因 了( n g f ) ，疼痛和有毒物質(zhì)的刺激( m i l b r a n d t ，】9 8 6 ；n a r a n j oe ta 1 ，1 9 9 1 b ；q u i n n ， l9 9 1 ；s o n n e n b e r ge ta 1 ，1 9 8 9 ) 。a p 一1 可以與c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n s ( c r e b ) 形成異二聚體，從而與c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n t ( c r e ) 或者a p 一1 識別的保 守序列結(jié)合，應(yīng)答c a m p 信號。a p 一1 可以與不同的蛋白結(jié)合形成不同的異二聚體， 從而應(yīng)答不同的刺激。 a p 1 還可以與一些鄰近的結(jié)合在啟動子上的轉(zhuǎn)錄因了協(xié)同作用履行神經(jīng)元特 異基因的表達(dá)。a p 一】位點與e b o x 的協(xié)同作用已經(jīng)報道在小鼠神經(jīng)肽 p r e p r o t a c h y k i n i n a ( r p p t ) 啟動予的研究中( m e r m o de ta 1 ，19 8 8 ) 。 1 4 2 組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子 有限數(shù)量的d n a 元件存在所有基因的啟動子上，相同的d n a 元件可能被來自相 同家族的不同成員結(jié)合。因此，結(jié)合這些元件的一些組織特異性轉(zhuǎn)錄因子可能是一 個轉(zhuǎn)錄因- 了家族的不同的變異體。雖然它們有低的同源性，但是它們與d n a 結(jié)合的 結(jié)構(gòu)域是非常保守的，一些蛋白二聚化的結(jié)構(gòu)域也是保守的。 b a s i ch e l i x 1 0 0 p h e l i x ( b h l h ) 家族轉(zhuǎn)錄因予結(jié)合到一個叫做e b o x 的d n a 元件， 參與多個組織特異性基因的表達(dá)。b h l h 家族轉(zhuǎn)錄因了形成同源二聚體或異源二聚 體是它與d n a 結(jié)合的先決條件( c h u r c he ta 1 ，19 8 5 ；m u r r ee ta 1 ，19 9 4 ；m u r r ee ta 1 ， 19 8 9 ) 。b h l h 家族轉(zhuǎn)錄因了通過結(jié)合e b o x 調(diào)節(jié)許多神經(jīng)肽基因的表達(dá)，比如i n s u l i n ( n a y a e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，s e c r e t i n ( m u t o he ta 1 ，1 9 9 7 ) ，v a s o p r e s s i n ( g r a c ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。廣泛 表達(dá)的b h l h 家族轉(zhuǎn)錄因了與組織特異性表達(dá)的這個家族的轉(zhuǎn)錄因了形成異二聚體 巾h 科學(xué)技術(shù)人學(xué)碩七! 學(xué)位論文作者洪波 與e - b o x 結(jié)合作為組織特異性基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制( r a s h b a s se ta 1 ，19 9 2 ；s a w a d a a n dl i t t m a n ，1 9 9 3 ) 。許多研究發(fā)現(xiàn)b h l h 家族轉(zhuǎn)錄因了在神經(jīng)元特異表達(dá)的基因轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié)過程中扮演重要的角色( y u t z e ya n dk o n i e c z n y ，1 9 9 2 ) 。 另一個家族的組織特異性轉(zhuǎn)錄因予是p o u 家族的轉(zhuǎn)錄因子。p o u 的名字來源與 二種最先發(fā)現(xiàn)的這個家族的轉(zhuǎn)錄因子。它們是p i tf ，o c t a m e rb i n d i n gp r o t e i n ，u n c1 p o u 轉(zhuǎn)錄因了的特征是含有一個p o u 結(jié)構(gòu)域，它包括p o us p e c i f i c 一利p o uh o m e o d o m a i n 。p o u 的結(jié)合位點一般為八聚體序列，但與周圍的序列也有關(guān)( a n d e r s e na n d r o s e n f e l d ，2 0 0 1 ) 。p o u 在果蠅中的同源蛋白是c f l a d r i f t e r ，它首先被證明的功能 是參與神經(jīng)元中多巴胺脫羧酶( d o p ad e c a r b o x y l a s e ) 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)( j o h n s o na n dh i r s h ， l9 9 0 ) ，此后還發(fā)現(xiàn)它與氣管和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的遷移相關(guān)( a n d e r s o ne ta 1 ，19 9 5 ) 。 c f l a d r i f t e r 歸屬于p o ui i i 亞家族，哺乳動物p o u1 1 1 亞家族成員的豐要功能是與神 經(jīng)系統(tǒng)，尤其是下丘腦一垂體神經(jīng)分泌系統(tǒng)的發(fā)育相關(guān)，而且能直接作用于某些神經(jīng) 肽基因的上游，影響它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控( a n d e r s e na n dr o s e n f e l d ，2 0 0 1 ) 。p o u 家族的 轉(zhuǎn)錄因子能夠激活和抑制一些基因的表達(dá)，研究表明p o u 對基因的表達(dá)是抑制還是 激活取決與p o u 結(jié)合位點在啟動子上定位( d eg r a z i ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。p o u 還能與一 些蛋白形成異二聚體，從而抑鋁1 o c t a m e rb i n d i n gp r o t e i n 結(jié)合到啟動了上。果蠅的p o u 蛋白c f l _ a 可以與i p o u ( i n h i b i t o ro f p o u ) 形成異二聚體，抑制c f l a 結(jié)合到啟動了 上的功能( t r e a c y e ta 1 ，1 9 9 1 ；t r e a c ye ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 2 家蠶和棉鈴蟲d h p b a n 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 2 1 昆蟲滯育激素基因的結(jié)構(gòu)和功能 滯育激素( d h ) 首先在家蠶中被純化測序( i m a i e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，它含有2 4 個氨 基酸，c 端被酰胺化，它可誘導(dǎo)家蠶進(jìn)入胚胎滯育( y a m a s h i t a ，19 9 6 ) 。隨后，家 蠶的d hc d n a 也被克隆得到，發(fā)現(xiàn)它編碼的1 9 4 個氨基酸前體肽還包括一個性信息 素合成激活肽( p b a n ) ，利三個新神經(jīng)肽，并命名為o 【，p ，1 ，一s g 神經(jīng)肽( s u b o e s o p h a d e a l g a n g l i o nn e u r o p e p t i d e ，s g n p ) ( 圖4 ) ，因此編碼d h 的基因也叫做d h p b a n 基因 ( s a t oe ta 1 、19 9 1 ) 。d h 特異的表達(dá)在食道下神經(jīng)節(jié)中有l(wèi)2 個陽性細(xì)胞( 劉d h p b a n 表達(dá)細(xì)胞) ，他們成簇分布在沿食道下神經(jīng)節(jié)腹中線的三個特定區(qū)域內(nèi)，其中4 個細(xì) 葉科。、技術(shù)人0 1 ：碩十! 學(xué)位論文作者洪波 專業(yè)遺化 胞分兩對位于一i 顎神經(jīng)元( r n a n d i b u l a rn e u r o m e r e ) 。6 個細(xì)胞分二對位于下顎襯l 經(jīng) 元( m a x i l l a r yn e u r o m e r e ) ，余下2 個細(xì)胞作為一對位于下唇神經(jīng)元( 1 a b i a l1 1 e u i o m e r e ) ( s a t oe ta 1 ，1 9 9 4 ，s u ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 d h p b a nc d n a 在昆蟲中廣泛存在，先后在棉鈴蟲( h e l i c o v e r p aa r m i g e l 一臼) ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 a ) ，玉米夜蛾( h e l i c o v e r p az e a ) ( m ae ta 1 ，19 9 4 ) ，煙青蟲 ( h e l i c m ，e r p aa s s u l t a ) ( c h o ie ta 1 ，19 9 8 ) ，小地老虎( a g r o t i si p s i l o n ) ( d u p o r t e t se ta 1 ， 19 9 9 ) ，?；页嵋苟? s p o d o p t e r al i t t o r a l i s ) ( i g l e s i a se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，煙芽夜蛾( h e l i o t h i ， v i r e s c e n s ) ( x ua n dd e n l i n g e r ，2 0 0 3 ) ，茶姬卷葉蛾( a d o x o p h y e ss p ) ( c h o ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ， 甘藍(lán)夜蛾( m a m e s t r ab r a s s i c a e ) ( j a c q u i n j o l ye ta 1 ，19 9 8 ) ，蓖麻蠶( s a m i ac y n t h i a r i c i n i ) ( w e ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ，和柞蠶( a n t h e r a e ap e r n y i ) ( g e n b a n k1 1 0 a y 4 4 5 6 5 8 ) 等 昆蟲中被克隆，它們的c d n a 結(jié)構(gòu)都很相似。然而d h 在這些昆蟲種中所起的牛物學(xué) 意義仍然是未知的。有趣的是，d h 可以加速蛹發(fā)育和終止蛹滯育的一個新功能已經(jīng) 在夜蛾科種棉鈴蟲( ha r m i g e r a ) ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 b ) ，煙青蟲( ha s s u l t a ) ( z h a o e ta 1 ，2 0 0 3 ) ，煙芽夜蛾( hv i r e s c e n s ) ( x ua n dd e n l i n g e r ，2 0 0 3 ) 中被揭示。 迄今為止，d h p b a n 基因序列已經(jīng)分別在家蠶( x ue ta 1 ，1 9 9 5 ) 和棉鈴蟲( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 4