檢定菌保存、傳代、使用、銷毀標準操作規(guī)程.docx

檢定菌保存、傳代、使用、銷毀標準操作規(guī)程1目的：規(guī)范藥品微生物學檢定用菌的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學檢驗結果的準確可靠。2依據(jù)：ChP2010版（一部）、中國藥品檢驗標準操作規(guī)范（2010年版）。3范圍：本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的申購、保存、傳代、使用及銷毀等。4責任：4.1.QC主管負責菌種的申購、接受、保存、分發(fā)。4.2.微生物檢驗員負責菌種的確認、傳代、使用及銷毀。5.相關文件及術語：5.1術語標準菌種是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。傳代用菌種是指用標準菌種制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。工作用菌種是指用標準菌種或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。6.標準：6.1檢定菌的申購QC主管每年根據(jù)檢定菌種的使用情況（包括臨時檢驗需要），提出購買計劃，交由質(zhì)量管理部部長審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購買凍干菌種（標準菌種）；也可以直接向省（市）藥檢所購買傳代用菌種，購買時，需詢問與確定菌種的代數(shù)，以便傳代時控制代數(shù)。6.2檢定菌的接收菌種到達實驗室后，由QC主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫在檢定菌接收記錄（附表1）上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編號（無編號者按檢定菌種的編號原則編號）、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于48冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。6.3檢定菌的保存6.3.1工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至48冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應滅活處理后銷毀。保存時間根據(jù)菌種種類而不同，細菌：1個月；酵母菌：2個月；霉菌及芽胞：3個月。6.3.2傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。6.3.2.1甘油冷凍管保存法用無菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細菌充分擴散到預先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%），即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管，在-30冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第2代（G2）。可以每隔2年轉(zhuǎn)種一代。使用時，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。6.3.2.2液體石蠟保存法6.3.2.2.1無菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121滅菌30分鐘,置40恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。6.3.2.2.2液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結束后，在層流臺下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20冷凍或28冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。6.3.3各菌種的保存方法、條件及期限，見傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限（附件1）6.4檢定菌的傳代檢定菌菌種的傳代因凍干菌（標準菌種）與傳代用菌種而不完全相同。6.4.1標準菌種的復蘇、確認、傳代6.4.1.1標準菌種的復蘇6.4.1.1.1把凍干菌種管、滅菌毛細滴管（1ml）、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜培養(yǎng)基）數(shù)支，移入接種室或超凈工作臺。6.4.1.1.2將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將標準菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌毛細滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基），滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。6.4.1.1.3取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌毛細滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基）少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基）內(nèi)，并根據(jù)不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下2472小時（細菌需要2448的培養(yǎng)物，酵母菌需要72小時的培養(yǎng)物，形成孢子的微生物則宜保藏孢子，放線菌和絲狀真菌則應培養(yǎng)710天）。最后將毛細滴管及菌種管經(jīng)高溫滅菌（121，45分鐘）。6.4.1.1.4取出培養(yǎng)物，仔細觀察液體培養(yǎng)基是否渾濁，渾濁說明菌種復活生長，若不渾濁，在將其作為無活菌生長的培養(yǎng)物丟棄以前，細菌應至少培養(yǎng)1周以上，真菌和酵母菌至少應培養(yǎng)2周以上，并在丟棄之前應高溫滅活處理（121，45分鐘）。6.4.1.2標準菌種的確認6.4.1.2.1用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細菌）或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或相應的宜于該菌生長的鑒別培養(yǎng)基平板上，然后在3035下培養(yǎng)3天（細菌）；2025下培養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取生長旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養(yǎng)基，每種菌劃4個平皿，以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落，進行保存和鑒定。鑒定時作革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及形態(tài)特征。最后再做生化實驗以進一步鑒定該菌種。若在該平板上發(fā)現(xiàn)有其它菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純，應將此被污染了的培養(yǎng)物滅活處理，并尋找原因。應根據(jù)其原因采取措施重新分離挑選純菌落。6.4.1.2.2菌種的確認結果，記錄在檢定菌種鑒定記錄上。6.4.1.2.3各檢定菌種的復活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見菌種復活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（附件2）。6.4.1.3標準菌種的傳代6.4.1.3.1按菌種說明書要求復溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第1代（G1），復壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當溫度下培養(yǎng)適當時間，分離單個純種菌落，此為第2代（G2）。6.4.1.3.2菌種確認后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，作為保存菌種（G2），也稱傳代用菌種，同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第3代（W3）。6.4.1.3.3將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當溫度下培養(yǎng)適當時間后用于日常檢驗。6.4.1.3.4取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當溫度下培養(yǎng)適當時間后用作工作用菌種，此仍為第3代（W3）。6.4.1.3.5將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的第2代（G2）菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。6.4.1.3.6按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復上述規(guī)程操作，保存和使用菌種。6.4.1.3.7當工作用菌種代數(shù)小于5時，在規(guī)定保存期限內(nèi)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。6.4.2傳代用菌種的傳代當無標準用菌種時，可從省（市）藥檢所購買菌種作為傳代用菌種，不需經(jīng)過復溶增菌，但應劃線接種確認。將購回無異常的傳代用菌種（一般為第3代），根據(jù)日常檢驗工作的需要量，挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種(為第4代)，同時，結合菌種的代數(shù)和最長保存期限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“6.3.2”的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。6.4.3工作用菌種的傳代當工作用菌種代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。取在冰箱48保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔?，并將新傳代的培養(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也可取用“甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法”保存的菌種，進行復蘇，直接作為工作用菌種。細菌每1個月傳代一次；酵母菌每2個月傳代一次；霉菌及芽胞每3個月傳代一次。當超過5代，須用傳代用菌種傳代。6.4.4傳代時注意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時實驗人員也要采取有效的預防措施進行自我保護，如工作時必須穿工作服，佩帶無菌手套，實驗完成以后消毒實驗進行的區(qū)域、實驗儀器和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學檢驗人員應立即向QC主管報告以便及時進行處理。6.4.5傳代后，按檢定菌種的編號原則編號，并在每一支菌種管上貼上標簽，標簽內(nèi)容包括：名稱、編號、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。交QC主管統(tǒng)一保管。同時及時填寫菌種傳代、分離記錄（附表2）。6.5檢定菌種的編號采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母代次傳代日期順序號菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢桿菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙門菌（S.p）代數(shù)用一位帶有下標數(shù)字的字母表示：傳代用菌種用G表示；工作用菌種用W表示；如G3表示傳代用菌種第3代；W3表示工作用菌種第3代。傳代日期用6位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù)，月、日分別用兩位數(shù)。如2012年1月12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號為：E.c-G3-120112-01。6.6檢定菌種的保管6.6.1檢定菌種設專人加雙鎖保管，并對所保存的菌種建立檢定菌種保存、領用登記臺賬（附表3）。6.6.2檢定菌種的定期檢查與鑒定在菌種的保存期間，應每天檢查保存菌種冰箱的溫度、菌種管的塞子是否松動或生霉，并及時填寫檢定菌種觀察記錄（附表4），如有異常應及時處理。菌種在保存期內(nèi)均應根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)及生化特性等項目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好檢定菌種鑒定記錄（附表5）。6.6.3所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個人，需要時應有單位證明和批準手續(xù)方可供應。6.7檢定菌種的領用與使用6.7.1微生物學檢驗人員根據(jù)檢驗需要，需到QC主管領取工作用菌種或傳代用菌種，同時填寫檢定菌種領用登記臺賬相關內(nèi)容。6.7.2微生物學檢驗人員從QC主管領取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗或驗證試驗，使用后及時填寫檢定菌種使用登記臺賬（附表6），以便追蹤菌種使用歷史。6.8檢定菌種（廢棄）的銷毀6.8.1下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121、45分鐘濕熱滅活處理：新一代菌種制備成功后的上一代菌種；使用完后的菌種和帶有標準菌種的器具和培養(yǎng)物；超過有效期的菌種；凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；其他應廢棄的菌種。6.8.2廢棄菌種的銷毀由QC主辦提出申請，交QC主管批準后，由微生物學檢驗員進行滅活處理，并有其他人在場監(jiān)督，并填寫廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄（附表7）。7記錄歸檔本標準涉及的記錄由質(zhì)量管理部保存，保存期5年。8附則：本標準附件二份，附表六份：附件1：傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限附件2：菌種復活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件附表1：檢定菌接收記錄附表2：檢定菌種傳代、分離記錄附表3：檢定菌種保存、領用登記臺賬附表4：檢定菌種觀察記錄附表5：檢定菌種鑒定記錄附表6：檢定菌種使用登記臺賬附表7：廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄附件1：傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌CMCC(B)44102甘油冷凍管-302年金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003甘油冷凍管-302年枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501液體石蠟管2-81年白色念珠菌CMCC(F)98001液體石蠟管2-81年黑曲霉菌CMCC(F)98003液體石蠟管2-81年乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094甘油冷凍管-302年附