WB方法經(jīng)驗總結(jié).doc

WB經(jīng)驗總結(jié)來源于丁香園論壇，由張慧慧（長沙 湘雅附二）推薦來dxy好多年了，這些年陸陸續(xù)續(xù)回復(fù)了一些帖子，可是回來回去，發(fā)現(xiàn)大家提的問題，還是那么幾個，沒有從根本上有所提高，確實出乎意料?？催^很多總結(jié)經(jīng)驗的帖子，不知道該如何評價，要么抄書本，要么人云亦云，缺乏自己的東西，新手參考這些當(dāng)然難獲進(jìn)益。實在受不了，這些混淆視聽的東西，本人把這么多年的回復(fù)，略作整理完善拼湊成WB實戰(zhàn)指南，歡迎行家批評指正。首先，擺擺自己的經(jīng)驗。鄙人做WB有8、9年了，平均下來兩天跑一張多的蛋白膠；文章嘛，湊數(shù)的單篇有上24+，一作單篇15+（系國內(nèi)完成；注：當(dāng)年的IF，現(xiàn)在逐年遞減沒個標(biāo)準(zhǔn)）。其次，由于一些機緣的因素，在實驗室WB體系完善的過程中，很多靠自己摸索；說實話，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的問題都經(jīng)歷了，因此我敢寫這樣一個咚咚給大家分享。再次，我再強調(diào)一點，對我們這類人來說，實驗結(jié)果的可靠、漂亮已經(jīng)不算一個要求；如何縮短操作時間，使實驗進(jìn)行的更有效率也是我們所追求的，因此本文會針對兩個普遍采用的卻可以看成浪費時間的操作，Bradford法蛋白定量和立春紅染膜做專門批判，這在以前的WB操作指南是絕無的，甚至叛離被視為經(jīng)典的分子克隆?？墒牵堄涀?，經(jīng)典是人定的。話不多廢，開始：樣品制備：變性條件SDS LB直接裂解：用常溫或者高溫預(yù)熱過（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會改變）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。通常6孔板細(xì)胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDS LB都是過量的（因此不一定要嚴(yán)格參考SDS LB稀釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣后會發(fā)現(xiàn)tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時候常規(guī)做法有兩種，1. 再煮5min。常規(guī)煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當(dāng)增加SDS LB，繼續(xù)煮；也可以對樣品進(jìn)行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續(xù)WB的意義，請丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層）此方法的缺點，SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實類似）裂解細(xì)胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20g/ml leupeptin, 10g/ml pepstatin A and 10 g/ml aprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復(fù)雜也很貴，其實用0.5mM PMSF替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現(xiàn)加現(xiàn)用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。此方法的優(yōu)點：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細(xì)胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細(xì)胞時染色體會析出，細(xì)胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的復(fù)合體，要得到純化的一些復(fù)合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細(xì)胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破壞核膜結(jié)構(gòu)；可用到1%，但此時染色體會析出，沉淀粘稠。組織塊裂解：組織塊較大用勻漿的方法最合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。當(dāng)組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進(jìn)一步破碎；反復(fù)多次。3. 用上述細(xì)胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集上清液用于WB檢測；如果含量過低，需要用TCA沉淀富集。理論上，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時對細(xì)胞生長條件的影響最小，是最佳的實驗條件；但是這存在隱憂。因為含血清的培養(yǎng)基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類的蛋白質(zhì)，除非你進(jìn)一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會有非常大的麻煩，尤其當(dāng)你的蛋白在60-46 kDa之間的時候；用“任何”抗體去檢測這一區(qū)間的蛋白，會有一片非常強的信號。因為此區(qū)間蛋白（主要是BSA）濃度過于富*非特異性粘附“任意”抗體，從而最終被識別。同理，采用SDS LB裂解細(xì)胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng)基中的BSA。采用無血清培養(yǎng)基收集細(xì)胞上清除了改變細(xì)胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號途徑，諸如AKT等），還會出現(xiàn)的問題是：1. 即使采用了無血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對好很多。2. 選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。a. TCA沉淀對半定量操作要求非常高，因為很容易沉淀不充分或者離心操作丟失，尤其在離心過程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉(zhuǎn)離心兩次。b。重新溶解時，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對麻煩。實際上，如果你不是非常強調(diào)蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測上清，尤其半定量的WB實驗檢測不同樣品間的差異。這里面有實驗操作細(xì)節(jié)的麻煩經(jīng)驗之談，我曾經(jīng)參與的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的數(shù)據(jù)是cell lysis；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為進(jìn)一步分析做準(zhǔn)備。樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDS LB煮沸過的樣品凍融會存在另一個問題，SDS沉淀；SDS 4度就會沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也會出現(xiàn)類似拖尾；上樣過大也會）。在樣品制備過程中，另一個需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計。細(xì)胞樣品可以先計數(shù)再接種，短時間內(nèi)即使細(xì)胞生長有差異也不會對WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大小（稱重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過程也盡量避免蛋白損失。有人會說可以電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白定量的不科學(xué)性，以及裂解液成分對定量的干擾。【補充1】：細(xì)胞有凋亡或生長速率差異時，有一個最直接的辦法針對這個問題，實際上將細(xì)胞收集下來以后，經(jīng)過離心，去除PBS，這時候你可以拿出事先準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)體積去比對，誤差小于50ul的（因為標(biāo)準(zhǔn)品差值可以設(shè)定為50ul),所以基本上肉眼偏差至多只有10ul（細(xì)胞體積），這種小差別在WB結(jié)果中可以忽略不計。其實標(biāo)準(zhǔn)品有多種好處，平時可以用于離心時平衡；可以廢物利用一些用過的effendorf管。最好不要用純水做標(biāo)準(zhǔn)品，我喜歡稀釋一些SDS LB做標(biāo)準(zhǔn)品，因為有藍(lán)黑色對比下，可以更精確估計體積。這相對比測標(biāo)準(zhǔn)曲線，再一一讀值還是快很多；蛋白電泳：電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請參考分子克隆。經(jīng)驗之談，8%膠最底邊約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的的影響都問題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的影響都問題不大（300KDa蛋白如何，沒有嘗試過）。電泳一般采用恒流，45mA-55mA（應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器最高限壓；此條件適合gibco model V16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點，保證最快速度完成電泳（電壓會逐漸增大），省時且減少擴散；但是由于電泳速度過快時會發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。注意事項：1聚丙烯酰胺的30%母液會降解，要4度避光保存。2APS會失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個月左右。-20度分裝長期保存。3注意Tris buff的PH值，以及平時所用的水的PH值。PH值改變會使帶型非常怪異，所有蛋白和溴酚藍(lán)壓成一條細(xì)線（即便在分離膠中），如果溴酚藍(lán)前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)一直延伸到膠底部（溴酚藍(lán)此時涌動極緩慢，位于膠中上部）4上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會過熱。SDS-PAGE膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。5配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會導(dǎo)致局部巨大氣泡，非常難于清除；蛋白膠也會導(dǎo)致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒洗凈的另一個壞處是，由中學(xué)物理知識可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈的玻板會削弱和膠體間的粘附力，拔梳子或邊條時會產(chǎn)生微小的錯動，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個關(guān)系不大）；嚴(yán)重的錯動會使上樣時，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開。為避免拔梳子時的錯動，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水更好，有SDS潤滑）。判斷玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒有疙疙瘩瘩的；最好用洗潔精之類，洗衣粉、肥皂都不好用。6上樣時，不要把tip深入膠孔過深（或者采用細(xì)的尖端拉長的專用上樣槍頭），可能會錯開膠和玻板，樣品會泄露。7未加樣的孔應(yīng)添加高濃度SDS LB平衡，否則最外側(cè)條帶會拉寬變形。通常20ul樣品（含5ul 4*SDS LB），可用8-8.5ul 4*SDS LB平衡。同理，點marker的lane也要加入同樣體積的LB。LB若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會有差異，在新舊LB靠近的地方，條帶會拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保存。8增加上樣量不一定會提高熒光信號強度。增加上樣量的后果通常只能是讓你的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因為增加上樣量最多只能提高幾倍，而WB靈敏度是以10的幾次冪量級的，所有目的蛋白信號的唯一方案就是IP富集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量的另一個壞處是，本來高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。仍以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液和SDS LB通常都是投入200ul（最少80ul，這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時的損失就太大，上樣就很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時上樣量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul時內(nèi)參基本已經(jīng)開始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋；當(dāng)然并非不可以多上樣，再多對WB結(jié)果影響不大（沒有的仍然沒有），且條帶都很丑。9. 不同樣品上樣時，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類似。如果一組IP樣品和一組細(xì)胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15ul，剛好+5ul 4*SDS LB達(dá)到常規(guī)20ul上樣體積；后者第8點提到只上5ul，同樣+5ul SDS LB（比重同，不會互相擠壓），最好補加10ul DDW使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間最好用“空白”泳道隔開（空白僅指無蛋白，仍應(yīng)加入8-8.5ul 4*SDS LB），這樣才能確保每條帶都很美觀。10. SDS PAGE膠配好暫時不用時，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊邊條后的間隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長期4度保存。個人習(xí)慣為，灌好分離膠用飽和的正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。兩種方案都可以。所以如果預(yù)計次日工作量較大，可以提前灌好SDS PAGE。樣品是否一定需要定量再上樣？不是的，這是浪費時間的一個操作。我們首先來討論一下蛋白定量的科學(xué)性。蛋白定量首先需要一個參照系（標(biāo)準(zhǔn)蛋白），參照蛋白通常選擇BSA，也就是說你所謂的定量是對應(yīng)于BSA的濃度的一個參照值。這里面存在一個問題，即忽略了蛋白折疊和空間構(gòu)象對光吸收、折射的影響；不同的蛋白折疊和構(gòu)象還會影響顏料分子的嵌入。因此你其實默認(rèn)將所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折疊狀態(tài)、光吸收情況下，然后做出的一個相對判斷，這就存在一個“系統(tǒng)誤差”還不算上測量誤差等等，就已經(jīng)很不準(zhǔn)確了。其次，裂解組織或細(xì)胞的時候，那些裂解液中，某些溶劑本身會使Coomassie G250或者Bradford法（實際也是Coomassie染色）顯色，尤其是去污劑之類；例如NP40，就會使Coomassie顯藍(lán)色，可以完全覆蓋掉蛋白與Coomassie作用產(chǎn)生的藍(lán)色。因此，如果你的裂解液里面含有這類物質(zhì)，所謂的蛋白定量實際是NP40顏色和蛋白染色的疊加，根本不會符合標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的線性規(guī)律，自然定不準(zhǔn)?！拘枰f明：我目前只知道NP40會這樣，因為我們從來不去定量，沒有做過更深入的研究?！繉嶋H上保證你的內(nèi)參一致，是從樣品制備開始的，上節(jié)末尾有提到，不贅述。如果你從制備樣品時就注意過定量問題，實際上通常內(nèi)參差別不會太大。如果真的有差別，通常我們會先跑少量的樣品，目的是讓Actin或tubulin更清晰、不會粘連、不會過曝光。從而在第二輪跑正式結(jié)果前，根據(jù)第一輪的內(nèi)參的熒光信號做微調(diào)，大致能做到相當(dāng)；最多可能需要第三輪。以上的試驗可以精確到0.1ul差異（我很多體外生化試驗之前的調(diào)整酶量就是這樣進(jìn)行，此時根本不可能有足夠的蛋白讓你去定量）。當(dāng)然憑曝光強弱調(diào)整上樣量的前提是，你的WB技術(shù)很穩(wěn)定，很可靠，這是需要相當(dāng)多的經(jīng)驗積累，如果你一時掌握不了，可以讓經(jīng)驗更豐富的師兄師姐或者導(dǎo)師幫忙。順便提到，有人問過用Quantity One等定量軟件對光密度定量后計算差別從而調(diào)整上樣體積是否可以？不可以。 因為WB結(jié)果經(jīng)過多重放大，精確計量只代表相對于對照組的相對比值，與實際比值還是有誤差，所以按計算值更改上樣量仍會出現(xiàn)偏差。如果非要做定量的話，要注意你的裂解液配方，把每種溶劑都先加入到顯色液中嘗試一下，避免那些本身會顯色的物質(zhì)出現(xiàn)在你的裂解液中；當(dāng)然，某些物質(zhì)的去除可能影響對組織蛋白的提取。所以這是一個兩難的問題。轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印效率對WB結(jié)果的影響并不如書本和網(wǎng)絡(luò)上宣揚的那么大！首先必須澄清的是，很多時候新手會把WB結(jié)果無信號歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實際上轉(zhuǎn)膜效率對最終結(jié)果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識別能力的強弱，以及如何正確使用抗體，這個問題下節(jié)討論。有一個簡單的例證，Biorad提供的3mm厚濾紙初次使用時，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預(yù)染的marker深淺可知），但對多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測沒有任何影響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別稀少或者轉(zhuǎn)膜非常困難的蛋白）。沒有很好的策略可以解決這個新濾紙的問題；嘗試過浸泡（會泡爛的）、預(yù)電泳（會稍微好點）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流；水流太大，紙張會爛掉的），晾干再用；只要沒沖爛可以一直反復(fù)使用。其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但由于WB的流程相對較長，所以每個步驟的疊加作用會被級數(shù)放大，因此在試驗的每個步驟我們?nèi)詴η蟾茫虼艘韵氯詴钊胩接懭绾翁岣咿D(zhuǎn)膜效率。針對提高轉(zhuǎn)膜的效率，個人認(rèn)為最先應(yīng)該考慮到的是儀器的選用。這里不是歧視“made in China”，國內(nèi)的廠家很少注重不斷提高自己產(chǎn)品的品質(zhì)，走低端策略，對于電泳儀這種技術(shù)含量不高的儀器倒可以湊合；但說到轉(zhuǎn)膜儀，能把一個簡單的勻場電極做好的還真不多（就我道聽途說的，國外廠家為了使電極之間場強更加均勻，那種大塊金屬板表面是鍍過極薄的白金層）；因此轉(zhuǎn)膜效率和均勻方面孰優(yōu)孰劣不言而喻。目前，個人使用過的國產(chǎn)電轉(zhuǎn)槽（濕轉(zhuǎn)）唯Tanon仿Biorad的還可以（算替它們免費打個廣告吧，Tanon仿biorad mini3型電泳儀，在某些方面（主要是操作）上還優(yōu)于Biorad原裝；目前我認(rèn)為“中國制造”的靈魂就是仿造并超越前者）；半干轉(zhuǎn)儀一律進(jìn)口，用過Biorad、amersham和英國公司的scieplas。PS：批評一下Biorad。Biorad的半干轉(zhuǎn)儀，其硬質(zhì)塑料外殼會莫名其妙的碎裂（絕非摔裂、磕碰，因為底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除殘留鹽漬，基本不會移動；即便如此它自然就會碎裂），以致于其核心組件未壞的情況下，因外殼碎裂不得不報廢該儀器（其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則無法接通，導(dǎo)致儀器報廢我們先后買過3臺都是這樣的毛病，其間間隔了3年，不能肯定近來Biorad有沒有改進(jìn)這個問題；如果沒有，我想市場遲早會被其他公司所取代）對這三款產(chǎn)品，Biorad的外殼有明顯的質(zhì)量缺陷，容易過早報廢；amersham獨特的蜂窩式設(shè)計確實對轉(zhuǎn)膜效率有所提高，但蜂窩式使得與“三明治”的接觸面減少，電轉(zhuǎn)時散熱不太好，做大蛋白（半干轉(zhuǎn)儀也可以做大蛋白轉(zhuǎn)膜，效率確實不如濕轉(zhuǎn)，但抗體好、蛋白豐度一般時仍可采用）長時程（3hrs）轉(zhuǎn)膜需要在4度冰柜或cold room進(jìn)行；英國的產(chǎn)品，價格較高，公司不太出名國內(nèi)不一定有代理，但質(zhì)量和散熱都非常好。這里談到了半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)。這兩種轉(zhuǎn)印方法各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白，轉(zhuǎn)膜效率最佳，但靡費試劑、溶液，對普通分子量大小的蛋白轉(zhuǎn)染操作時間長于半干轉(zhuǎn)（下文會具體給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時、省試劑。蛋白分子大小如何界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為150KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋白，當(dāng)然這只是一個相對標(biāo)準(zhǔn)。因此，通常對大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會選擇長時程的濕轉(zhuǎn)，那么剛才提到的amersham半干轉(zhuǎn)儀的缺陷實際上沒太多實質(zhì)意義，何況還可以外加條件彌補；而且用半干轉(zhuǎn)做大蛋白轉(zhuǎn)印本來就是高手在懸崖上跳舞，此時轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒有任何意義我說過轉(zhuǎn)印效率對WB結(jié)果不起決定因素。濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)緩沖液配方請參考分子克隆，有必要指出的是，實際上用半干轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復(fù)使用多次（30V，35V附近的時候，保險會自動跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK的，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3hr以后，最大電壓仍為18V（因此足見其散熱性能的優(yōu)良）。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時間的要求是針對PVDF膜的，這里面有一個很有趣的問題。盡管廠家一再表明PVDF膜比NC膜對蛋白的截留更高（但NC帶負(fù)電性，理論上它的吸附量應(yīng)該更高，所以通常同樣使用TBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜對小分子的截留明顯不如NC膜，因此交聯(lián)在預(yù)染marker上的顏料小分子很容易穿過PVDF膜，造成轉(zhuǎn)膜過度的假象（除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也可以考慮增加marker的上樣量）；NC膜沒有這種問題，所以通常它的轉(zhuǎn)膜時間也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，電流控制在200-300mA（16cm*9cm大膠300mA，如果膠面積小很多可以考慮降低，實際上相當(dāng)于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看來是它的強度：干燥的膜易碎。當(dāng)然目前某些廠家為解決這個問題，將NC成分涂在另一種介質(zhì)的表面，這種膜的支持強度和PVDF膜類似，但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有明顯的正反面；因此制作轉(zhuǎn)印三明治的時候要特別注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔徑的轉(zhuǎn)印膜，但也不是一定必須。對于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書本建議采用低濃度膠，如6% SDS-PAGE。但實際操作發(fā)現(xiàn)，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%膠底邊溴酚藍(lán)指示60KDa左右，除非采用壇子上有人提過的灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時跑兩塊膠，因此也不是很推薦。個人經(jīng)驗認(rèn)為300KDa以下8%膠（底邊36KDa）都可以勝任，可以適當(dāng)調(diào)整選擇7-8%膠可以兼顧內(nèi)參和大蛋白。轉(zhuǎn)膜最好在低溫進(jìn)行（高溫會局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒有具體要求，但用預(yù)冷過的電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預(yù)冷的轉(zhuǎn)印效率更高。因此，有條件建議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4度）進(jìn)行。此外，濕轉(zhuǎn)緩沖液可以考慮轉(zhuǎn)印前-20度預(yù)冷，時間不能長于2hrs，否則電泳液凍結(jié)；mini3型有內(nèi)置冰槽的，冰槽置-80度預(yù)冷。制作轉(zhuǎn)膜三明治的過程中，書中強調(diào)過濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒有膠、膜隔開部分的濾紙會因為直接接觸而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓）流，造成升溫過快。但進(jìn)口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新濾紙，消耗過快、初次使用的膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實際上濾紙大一些也不太要緊，但是我會選擇已經(jīng)切割好的和膠面積最接近的濾紙；通常膜的大小會嚴(yán)格控制在與膠面積一致或略小一點點。操作時在保證每一層均無氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個來回，力道要均勻、恰好；力量過大，膠會被拉伸，條帶會扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)趕氣泡（完全可以做到疊加的時候每一層都無任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時可以一張張的疊加），更重要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢岳斫獾氖牵瑢τ诘鞍追肿拥拇笮《?，膠和膜之間的間距是數(shù)十萬倍計的，因此更緊密的接觸無疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵。膠和膜需不需要泡呢？不少公司實驗講座時提出泡膠、泡膜，實際操作中沒有發(fā)現(xiàn)泡和不泡的轉(zhuǎn)膜效率有多大差別。實際上，膠只需要在電轉(zhuǎn)液中浸一下即可（可以減少與濾紙或者膜之間的氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，同樣多沾些緩沖液會有利于減少氣泡（PVDF要先用甲醇濕潤再投入緩沖液；NC直接進(jìn)緩沖液）。如何監(jiān)控轉(zhuǎn)膜的效率呢？在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆的介紹，采用立春紅染膜。只是后來發(fā)現(xiàn)此操作不僅增加額外的操作時間，而且不能說明任何問題，于是拋棄之。首先，立春紅（也包括考染膠）的靈敏度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠(yuǎn)，即使立春紅染膜無顏色，也無法提示W(wǎng)B結(jié)果會不會失?。既灸z無顏色也不能說明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無法提示靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，也許只是另外一個分子量大小相近的蛋白。因此，無論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進(jìn)行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時間，而且增加一輪漂洗的操作，對膜和膜上的蛋白都不好。那么為什么不采用更直觀的預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會增加任何額外的操作（固定marker的上樣量非常必要）。當(dāng)然上面提到針對PVDF膜，由于對小分子截留的局限，顏料分子會在高強度的轉(zhuǎn)印過程中從交聯(lián)的蛋白上脫落并穿過膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過深會使整個lane糊掉；太緊（多）可改變蛋白構(gòu)象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)，這意味著在某些條件下，顏料會從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因為膜分子孔徑以及膜對不同物質(zhì)吸附能力的差異，顏料小分子會輕易穿過膜到濾紙背面，而蛋白則被牢固的截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過度的假象?，F(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換NC膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)膜條件、注意必要的細(xì)節(jié)，就可從根本上忽略掉其對轉(zhuǎn)膜效率的指示，而把預(yù)染的marker僅僅作為一個分子量大小的指針，當(dāng)然同時可確認(rèn)之前的轉(zhuǎn)膜操作無誤（沒有插反電極，放反膜），也可為后續(xù)抗體孵育操作時膜的正反面做必要的提示。不同公司預(yù)染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預(yù)染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（膠大小2030cm），Bioradmini3型（8.27.4cm)MBI最低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清晰?？贵w孵育WB真正的難點：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個脾氣。對WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。無論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，高效和低效之間往往只有數(shù)倍的差異，而抗體的效價可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價不被過分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的最大化。封閉最短可以縮減到5min：很多人把高背景或者黑板，認(rèn)定為封閉不充分，其實這也是沒有吃透WB（說實話，經(jīng)?？吹綁由虾芏嗳诉@樣給人答疑，非常的無語）；實際上封閉（極端點）也是個可有可無的步驟，真正對降低背景起核心作用的是抗體稀釋液中的組分。當(dāng)你的抗體使用次數(shù)較多時，基本不用封閉也可以有較低的背景；如果抗體很新，其實封閉最短可以縮減到5min（沒試過更短的，不一定不可以）。那什么導(dǎo)致高背景甚至黑板呢？抗體的質(zhì)量不太好（主因），或者抗體稀釋液的配方有問題（增大抗體稀釋比略微有所改善）。封閉液的配方可以和抗體稀釋液相同，也可以不同；通常封閉液是最簡單（單方）的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復(fù)方。封閉很少出狀況。不過在milk做封閉劑的封閉液中，milk顆粒未完全溶解時，微小的顆粒會粘附在膜上增加星點狀背景。緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗?？贵w孵育成敗的關(guān)鍵首要在抗體本身的質(zhì)量，包括抗體的效價和背景的強弱，然而歷來商品化的抗體質(zhì)量參差不齊。各家生產(chǎn)的抗體中質(zhì)量問題最嚴(yán)重的是scbt的抗體，但它們的價格卻是最便宜的。其實，scbt在美國的售后服務(wù)還是相當(dāng)不錯的，只要按他們的要求操作仍然能舉證抗體的質(zhì)量問題，可以更換、交換（你指定的他們銷售的另外一種抗體），有時候還會附送一些ProA beads之類的，所以不奇怪它的普及率；也正因為此，如果你參考文獻(xiàn)的話很容易找到這家公司的?？上?，在國內(nèi)代理商不可能提供相應(yīng)的服務(wù)，因此購買他們的商品存在不小的風(fēng)險。所以，通常我更推薦sigma和Abcom、R&D等。諸如Sigma公司銷售的Actin，cat. A5316，clone AC-74，Mab更是作為新手練習(xí)專用的抗體；它的背景很低，效價很高，可以1：30,000稀釋（是普通一抗效價的30倍）。此外，盡管cell signaling是做磷酸化抗體起家的公司，但它們的抗體的質(zhì)量總體感覺也不好，所以有其它公司可以選擇時，我們會刻意避免購買cell signaling的產(chǎn)品，諸如Akt總抗和Ser473（這兩種抗體R&D的產(chǎn)品效價不錯）。（特別注明：前幾年CST的AKT抗體識別的條帶在55KDa左右，而其他公司均認(rèn)定為60KDa；最近還有戰(zhàn)友提問這個抗體，重新檢索了一下，應(yīng)該是原AKT抗體（包括磷酸化）已經(jīng)被CST自己下架了，從目前的幾個抗體示意圖看，大小也已與其他公司一致；因此，要不要買取決你自己）抗體公司在出售抗體的時候，在廣告上會玩很多花樣。A.不給整張膜標(biāo)記的圖示。很多抗體質(zhì)量不好，背景高雜帶多，如果靶蛋白區(qū)域較干凈時，他們通常只給很窄的一條靶蛋白區(qū)域的圖例。B.不給內(nèi)源性蛋白標(biāo)記的圖示，用IP的樣品取代。通過IP可以富集抗原，減少雜蛋白，通常很容易拿到背景很干凈，信號很強的圖例。C.用制備抗體時高表達(dá)的多肽做陽性樣品，不給全長蛋白的圖例。由于多肽可以IP富集，且不存在空間折疊的問題（通常裸露在外），因此很容易標(biāo)記。除以上花樣外，不少抗體用途上還有局限，因此挑選抗體時要睜大眼睛。此外，有一點值得注意的是，scbt銷售的抗體表面上很多（通常1ml，而別的公司通常是200ul或者100ul），然而實際上它的濃度也僅為0.2，所以實際上他們抗體的質(zhì)量也和其他公司的沒區(qū)別都是200ug（常規(guī)）。所以在早期，我一直強調(diào)如果固定即用型一抗的濃度（稀釋的一抗）為1ug/ml時，scbt的抗體最佳稀釋比為1：200。不過近來發(fā)現(xiàn)，實際上他們的抗體1:2K稀釋效價也不錯，因此也許其他公司的一抗可以進(jìn)一步提高稀釋比?，F(xiàn)在判斷當(dāng)時scbt抗體之所以采用1:200稀釋，實際上是因為自制的ECL不夠靈敏，所以建議用靈敏性更好的ECL，這樣可以減少抗體的消耗量，進(jìn)一步降低實驗成本。一抗通常4度過夜，效率較常溫1-1.5hrs高；二抗通常1:5K稀釋，室溫0.5-1hr（過久并不會明顯提高信號強度甚至?xí)p弱（相當(dāng)于洗膜），同時造成高背景進(jìn)一步影響特異與非特異熒光信號強度間的對比。孵育時間過久還會迫使你延長TBST的時間，這對抗原識別能力較弱的抗體更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考慮高鹽洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜時間一般10min*3或者5min*4?？贵w孵育和洗膜時，搖床速度不能過快也不宜過慢，需要簡單摸索一下。聊完以上那些淺顯的基本常識，接下來談我認(rèn)為最麻煩的：首先，抗原抗體識別原理的物理學(xué)解釋，抗體孵育過程實際上就是一個競爭結(jié)合的動力學(xué)過程。由于抗原和抗體特異性結(jié)合的效率是非特異性結(jié)合的數(shù)百萬數(shù)十億倍，所以當(dāng)特異性抗體與非特異性抗體（不好描述，指添加在抗體稀釋液中的封閉蛋白，我們可以把它們看成非特異性的一抗）競爭時，盡管抗體稀釋液中封閉蛋白的濃度是一抗?jié)舛?0K：1以上，在碰撞幾率相同的條件下，由于時間的積累加孵育過程中反復(fù)漂洗（孵育抗體要搖晃，對吧），特異性一抗積累了識別、結(jié)合優(yōu)勢。同樣在TBST等漂洗的情況下，由于親和力等原因，使得一抗很牢靠并進(jìn)一步增加對比優(yōu)勢，再經(jīng)過2抗特異性積累和ECL的最終放大形成特異性條帶和非特異性背景之間熒光信號的巨大差異。由以上碰撞結(jié)合、親和力差異這些基本現(xiàn)象，我們可以解釋W(xué)B中出現(xiàn)的現(xiàn)象。1.在樣品制備章節(jié)中，我強調(diào)PBS漂洗去培養(yǎng)基中BSA的作用。當(dāng)時只描述了不漂洗的后果，是在BSA位置任何抗體都可以非特異性的結(jié)合從而顯影。用碰撞的原理去解釋：當(dāng)雜帶很濃的時候，抗體的特異性已經(jīng)毫無意義，它只符合物理定律中的碰撞幾率原理；因為你的雜帶濃，碰撞幾率大，粘附一抗的機會多，因此它就會顯出來，但切記這是雜帶。當(dāng)雜蛋白含量高到一定程度，“任何”一種一抗都可以在該位置顯出條帶。因此，用條帶的深淺去判斷是否是靶蛋白，這是非常不科學(xué)的。在默認(rèn)抗體有效的情況下，如果抗原靠近區(qū)域沒有雜帶，背景干凈，依據(jù)分子量大小可以初步確認(rèn)靶蛋白的位置；如果有雜帶，并不一定是特異性條帶就比雜帶亮，也許雜帶蛋白濃度大，非特異性粘附的一抗更多。目前判斷雜帶和靶蛋白的唯一標(biāo)準(zhǔn)是分子量；而當(dāng)分子量大小類似時，只有通過增加過表達(dá)或IP純化的樣品做陽性對照，或者KD該蛋白的樣品做陰性對照一起電泳轉(zhuǎn)膜，才能準(zhǔn)確區(qū)分靶蛋白和雜質(zhì)。（用IP或KD樣品也是驗證商品化抗體是否有效的可靠方案）【補充2】：如何確定靶蛋白分子量？由1的解釋可知，雜帶比靶蛋白熒光信號強且干凈一點也不意外，而經(jīng)常不同的公司對同一靶蛋白給出不同的分子量，那么如何確定新上手不熟悉的靶蛋白的分子量呢？A. 用“過表達(dá)或IP純化的樣品做陽性對照”，這是最靠譜的方案。B. 沒有純化蛋白做對照時，對一個蛋白的分子量判斷一般有這樣幾步：a.根據(jù)氨基酸長度自己預(yù)測，如300aa，分子量應(yīng)為33KDa；以這個分子量為基準(zhǔn)進(jìn)行第二步。b.去抗體公司網(wǎng)站search說明書。一般先不要有偏向性，google abcam、Sigma，R&D以及millipore或者其他的scbt，benthyl等等等等吧，很快你至少可以發(fā)現(xiàn)3家是一致或接近的（諸如52KDa，有的寫54KDa，有的51KDa，這些都可以算作一樣，因為表觀分子量也是對應(yīng)marker的相對估算，會有一點點差異；尤其當(dāng)不同公司給的marker在靶蛋白區(qū)域上下差別很大時，比如，你的蛋白100KDa，有的公司在此區(qū)間的marker是180KDa直接jump到80KDa，有的可能中間多一條120KDa，那么這兩種marker估算的表觀分子量可能差10KDa以上尤其蛋白較大時，膠濃度又不低，分離會不太好，一些距離的細(xì)微差異，在軟件估算表觀分子量時偏差可能很大；其他蛋白這類問題不多，因為通常商品化的marker在120KDa以下指示條帶較為密集，而且一般濃度的膠對這些區(qū)段分離都很好，所以估算的表觀分子量差別不大，如上述52KDa例子），那么最終的表觀分子量基本就是你檢索到的。如果和1中一致，那么完全不用懷疑；如果不一致，有條件再用純化的含標(biāo)簽的蛋白做驗證，沒有基本也可以follow多數(shù)意見必須指出，很多抗體公司在具體到每一種抗體的說明書時常見虛假廣告的嫌疑，“恁把雜帶當(dāng)靶蛋白”（最搞的情況是同一公司同一靶蛋白，可能有用不同區(qū)段制備的靶蛋白的抗體，而這幾種抗體識別的靶蛋白分子量還很不一致），所以請follow多數(shù)意見。C. 蛋白一般只可能因為修飾向上遷移，所以表觀分子量比根據(jù)氨基酸長度計算值高常見；反過來，如果表觀分子量比計算值還低，多半就是雜帶；除非你的蛋白會降解，或者有的蛋白在ORF里面還有一個翻譯起始位點。經(jīng)驗之談，對于不熟悉的蛋白，通常都要小心求證，尤其在開始階段；有條件的話，換個抗其他區(qū)段的同一蛋白的抗體或者其他來源（Rab、Gab、Mab）同一蛋白的抗體標(biāo)記試試，兩種抗體能識別同一雜帶的概率還是很小的，尤其不同來源的，因為此時二抗也要相應(yīng)更換，幾率更小。 2.WB結(jié)果白板（無信號）和黑板（高背景）。從抗體孵育角度解釋白板和黑板問題（當(dāng)然也可能與ECL顯影有關(guān)，此點下一節(jié)有闡述），白板主要是可能是抗體本身效價不高，或者抗體稀釋液中封閉蛋白過多，競爭結(jié)合時封閉蛋白完全擠掉了特異性的一抗，特異性條帶和非特異性背景同樣結(jié)合強度無信號。黑板，也主要是因為抗體效價不高，而抗體稀釋液中封閉蛋白的拮抗作用又沒有完全發(fā)揮，此時無法有效識別抗原的一抗會等效的粘附轉(zhuǎn)印膜的任何位置，顯影后整張膜全黑。有時候膜接近全黑，但可以若有如無的觀察到靶蛋白，出現(xiàn)問題的原因雖然仍是抗體效價不高，封閉蛋白不能完全起到作用，不過此時可以通過改變抗體稀釋液的配方，提高特異性和非特異性結(jié)合的信號差異，降低背景?！斑@點非常重要”當(dāng)你的抗體標(biāo)不到抗原時（白板），先弄出條帶（黑板），再解決黑板（高背景）問題。第一步應(yīng)該是通過倍比降低一抗的稀釋比（從1:1K降到1:500到1:250到。；注：二抗稀釋比不要輕易改變，增加二抗?jié)舛葘B結(jié)果不會有太明顯的改變），摸索到一個可以標(biāo)出信號的條件。此時，由于一抗?jié)舛冗^高，背景可能非常高，但背景的問題可以再調(diào)整，有沒有特異性條帶卻沒辦法改變；實在沒有靶蛋白的信號，只能更換別的公司生產(chǎn)的抗體。那么如何通過改變抗體稀釋液的配方，尋求抗體孵育的最佳條件呢？首先要認(rèn)清，抗體稀釋液沒有一個絕對通用的配方；一種抗體一個脾氣。其次，抗體稀釋液的配方要兼顧與特異性抗體競爭抗原的強度，以及對其他區(qū)域的封閉強度兩方面的平衡。目前，抗體稀釋液中可以充當(dāng)封閉蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的樣子 。可是，你有沒有考慮過“復(fù)方”？這下配方無限多了吧。1. 采用milk，BSA和gelatin的單方。3% milk，5% BSA，=0.4%的gelatin，并根據(jù)實際情況改變（若出現(xiàn)白板，請降低封閉劑濃度。；黑板多加）。gelatin大家可能比較陌生，不過如果你翻翻抗體公司賣給你的原裝抗體里面液體的配方，你會發(fā)現(xiàn)很多抗體溶液里都有它。2.很多情況下單方的濃度很高了，背景問題仍不能解決。那么請嘗試兩兩或者三種不同比例混合。不過有些細(xì)節(jié)還是要自己摸索的，比如gelatinBSA時，gelatin濃度不能無限提高（會完全競爭掉抗原抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致白板），BSA的濃度較隨意。3.抗體稀釋液可用低鹽濃度的TBST，也可用高鹽濃度的緩沖液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切記，有的抗體對鹽濃度敏感，包括構(gòu)象和溶解度，因此需要嘗試。如果以上策略仍然無法解決高背景，可將稀釋好的一抗先跟平時實驗剪切下來的membrane的邊角料（新的）放在一起孵育個把小時再用。如果還不行，徹底無解，結(jié)論抗體太差；請更換別的公司或者抗別的區(qū)段的同種抗體。這三種封閉蛋白的差異：milk和gelatin封閉效果不錯且價格便宜，但milk容易發(fā)霉變質(zhì)，且國產(chǎn)milk脫脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗體結(jié)合（拮抗與抗原結(jié)合尤其突出；更不知道三聚氰胺會不會影響抗原抗體結(jié)合或者ECL！？）；BSA封閉效果不佳，且價格較昂貴。個人推薦gelatin，gelatin主要成分是骨膠原，蛋白很大，但可以通過加熱打斷成小蛋白，從而實現(xiàn)封閉各種分子量大小的蛋白。通常，我會將gelatin加到TBST中后直接滅菌，滅菌過程中，不溶的gelatin會逐漸溶解；由于gelatin可以滅菌（milk不可以），所以同樣條件下，gelatin的存放時間明顯長于milk。實際上，抗體可以反復(fù)用很久（通常一般的抗體常規(guī)稀釋比，可以連續(xù)用一個月以上；對于老手用過2、3次的舊抗體更prefer，因此背景降到很低而效價正是最高的時候），通?？贵w最后失效的原因不是因為使用次數(shù)過多，而是染菌；比較舊的抗體都會有很多的沉淀在底部，更長時間還會有異味。稀釋的一抗靠添加NaN3并于4度保存延長使用時間；二抗不能加NaN3，但放在-20度反復(fù)凍融延長使用壽命（抗體并非絕對不可以凍融；只是高濃度的原始管抗體的凍融對效價會有較大影響）?？贵w稀釋液（一抗、二抗稀釋液也可同也可不同）和封閉液可以相同，可以不同，因為抗體稀釋液可以采用復(fù)方的，所以即使混合了少許，不會對抗體的使用產(chǎn)生較大的影響。不過封閉液用milk時，gelatin稀釋的一抗混入少許milk會影響其使用壽命。由于以上諸多可變因素，實在無法總結(jié)出一種萬金油式的抗體稀釋液（只能是多數(shù)通用），因此對待具體問題時，請具體對待（多花點心思摸索吧）。原裝抗體的保存：1. 分裝。每次一管，但是可能太多占地方，而且還會有粘壁的損失，不是很推薦。2. 1：1加甘油，凍于-20度，可長期保存，此方法實際上也被很多國內(nèi)的試劑公司廣泛采用，諸如博士得，中杉，它們小包裝的進(jìn)口抗體通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查 ）。值得注意的是：不是所有的抗體都可以1：1添加甘油，要以抗體說明書為準(zhǔn)，如果說明書中本身存在甘油，或特殊注明外，通?？梢圆捎?。顯影淬滅的禍因當(dāng)抗體孵育、TBST漂洗結(jié)束后，進(jìn)入ECL顯影步驟。當(dāng)然，目前國內(nèi)一些實驗室已經(jīng)換用儀器掃描熒光信號，而我們更是二抗直接連熒光蛋白連ECL和常規(guī)的底片顯影都省略了，因此以下所討論的某些細(xì)節(jié)問題可能不再出現(xiàn)。首先壇子上還有少數(shù)實驗室處于DAB顯色時代，奉勸一句，都走到最后一步了就不要節(jié)省了；DAB顯色的靈敏性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前較為流行的仍是化學(xué)發(fā)光法，下面簡述一下其原理：交聯(lián)在二抗上的HRP酶能夠特異水解過氧化物產(chǎn)生化學(xué)能；ECL中主要包含兩種成分，催化劑和中間遞質(zhì)（白色瓶子主要是過氧化物如雙氧水）。催化劑的作用不用廢話了，其中間遞質(zhì)主要是吸收化學(xué)能并將其傳遞到luminol之類的化合物上產(chǎn)生電子躍遷從而激發(fā)熒光。因此催化劑的效率和中間遞質(zhì)的傳遞效率直接影響熒光的強弱。本人曾自制過ECL并嘗試改良，其間發(fā)現(xiàn)很多化合物、金屬離子如Fe、Cu等能催化并高效傳遞能量，且不依賴于HRP濃度，熒光信號能瞬間曝強；這其實與下文提到的一些粹滅原因有聯(lián)系。當(dāng)初我自制的ECL最大的毛病在于穩(wěn)定性不好，同理，商品化的ECL同樣也有保質(zhì)期的問題，往往最先失效的組分就是過氧化物，盡管他們必然添加過抗還原劑。其實，檢驗ECL是否失效的方法很簡單，取稀釋的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中觀察熒光強度，即可知道ECL是否失效。商品化的ECL價格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：將ECL滴加在保鮮膜上或干凈的支持物上，如廢棄的舊底片、塑料盒，有機玻璃盒等等（注意，國產(chǎn)的保鮮膜很多質(zhì)量不過關(guān)，有兩種潛在的問題，下面詳述），然后倒扣膜于保鮮膜上，夾住一個角來回拖動數(shù)次至ECL均勻（有的產(chǎn)品說明書要求孵育1min）。另外平鋪一張干凈的保鮮膜，將膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后顯影。mini3型膠整張膜孵育，ECL總體積0.7-1ml足矣。哪些因素會影響熒光信號的強弱呢？（這部分實際上與導(dǎo)致熒光淬滅的因素部分重合）1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應(yīng)不充分，另一方面ECL所含液體會溶解試驗臺上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒（也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過某種化合物）、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡述原理時，我曾經(jīng)提到過很多化合物、金屬離子能直接催化過氧化物水解，在極短的時間內(nèi)消耗掉所有的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。b. 保鮮膜的化工原料或拉制過程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價的保鮮膜問題尤多。目前，國產(chǎn)的就“妙潔”比較過關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。如果買不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，最好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過水會吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會干擾熒光強度，所以ECL孵育結(jié)束時需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請注意不能讓膜完全干掉。某些信號較弱的ECL，膜徹底干掉后熒光會消失；較好的試劑盒，熒光相對穩(wěn)定，但完全吸干以后，背景熒光也會升高，而且會嚴(yán)重影響重新標(biāo)記新抗體時的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。3.控干的膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時，包裹保鮮膜時要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過度消耗，呈線條狀淬滅。4.在膜放入壓片夾之前，最好肉眼觀察一下熒光信號的強弱，這有利于判斷實驗可能出現(xiàn)的問題。很多人提問看見很強的熒光了，但怎么壓片都沒有信號，那么就是快速淬滅（閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號）造成的；有這個觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實驗操作應(yīng)該問題不大，而問題主要是淬滅。如果你省略這個步驟，那問題就非常復(fù)雜了，因為之前任何操作都可能導(dǎo)致白板，根本無法判斷。除上述的問題以外，還有哪些因素會導(dǎo)致熒光淬滅呢？1. 抗原濃度太高，熒光信號過強，快速淬滅。在電泳的章節(jié)就曾提過，如果上樣量太大，不僅條帶會粘連、彎曲，更可能導(dǎo)致淬滅。因為局部區(qū)域過多的HRP酶會快速消耗底物呈富氧態(tài)，條帶出現(xiàn)燒灼樣（取出膜會發(fā)現(xiàn)一條明顯的暗黃色的帶），熒光信號會閃滅或者條帶空心（條帶灰黑不實，則可能是顯影液接