（植物學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）大豆糖蜜中功能性低聚糖的純化分離.pdf

j 曩 1 1 o 一 妒1 1 1 1 大豆糖蜜的制備及主要成分 l 1 1 2 大豆糖蜜的研究現(xiàn)狀 一2 1 2 大豆低聚糖 一3 i 2 1 大豆低聚糖的生理功能 4 1 2 2 大豆低聚糖的應(yīng)用 5 1 3 生物純化 5 1 3 1 生物純化的簡(jiǎn)介 5 1 3 2 生物純化優(yōu)點(diǎn) 6 1 4 大孔吸附樹(shù)脂簡(jiǎn)介 7 1 4 1 大孔吸附樹(shù)脂的吸附原理 7 1 4 2 大孔吸附樹(shù)脂的應(yīng)用 7 1 5 離子交換樹(shù)脂簡(jiǎn)介 8 1 5 1 離子交換樹(shù)脂的定義 分類(lèi)及離子交換理論 一8 1 5 2 離子交換樹(shù)脂的應(yīng)用 一9 1 6 研究的目的與意義 1 0 1 7 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容 1 0 2 材料與方法 1 2 2 1 材料與儀器 1 2 2 1 1 試驗(yàn)材料 1 2 2 1 2 試驗(yàn)儀器 1 2 2 1 3 試驗(yàn)試劑 13 2 2 試驗(yàn)方法 1 3 2 2 1 培養(yǎng)基 l3 2 2 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 1 3 2 2 3 成分分析 1 4 2 2 4 色譜條件 1 4 2 2 5 色譜峰的確定 1 4 2 2 6 糖蜜h p l c 測(cè)定的前處理 1 4 2 2 7 乳酸菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 1 5 2 2 8 乳酸菌的馴化處理 1 5 2 2 9 乳酸菌的糖蜜發(fā)酵的前處理 1 5 2 2 1 0 紅f h j 發(fā)酵前的預(yù)處理 一1 5 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩卜學(xué)位論文 2 2 i l 中試發(fā)酵操作 1 6 2 2 1 2 酵母生長(zhǎng)速度測(cè)定方法 1 6 2 2 1 3 蛋白分子量的測(cè)定 1 6 2 3 1 4 福林酚測(cè)蛋向質(zhì)的方法 1 7 2 2 1 5 酸沉蛋白的t 藝研究 1 8 2 2 16 樹(shù)脂的預(yù)處理 l8 2 2 1 7 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 1 9 2 2 1 8 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 1 9 2 2 1 9 離子交換技術(shù)處理粗糖液 1 9 2 2 2 0 大豆低聚糖糖漿主要成分的分析 2 0 3 結(jié)果與分析 一2 1 3 1 生物純化大豆糖蜜中功能性低聚糖菌株的篩選 2l 3 1 1 采用h p l c e l s d 對(duì)大豆糖蜜的檢測(cè)及分析 2 1 3 1 2 大豆糖蜜主要成分含量的分析 2 3 3 1 3 不同濃度蔗糖下的生k 情況 2 3 3 1 4 水蘇糖作為碳源進(jìn)行培養(yǎng) 2 6 3 1 57 號(hào)酵母菌對(duì)大豆糖蜜的利用情況 2 7 3 1 6 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線 2 8 3 1 7 一次馴化活菌數(shù)和p h 值變化 2 9 3 1 8 一次馴化總糖的消耗情況 2 9 3 1 9 純蔗糖發(fā)酵總糖的變化 3 0 3 1 1 0 二次馴化活菌數(shù)和p h 值變化 3 1 3 1 1 l 乳酸菌對(duì)糖蜜的發(fā)酵情況 3 2 3 1 1 2 紅曲對(duì)糖蜜的發(fā)酵情況 3 2 3 1 1 3 乳酸菌和酵母混合發(fā)酵情況 3 3 3 1 1 4 酵母菌和紅曲混合發(fā)酵情況 3 4 3 1 1 5 乳酸菌和紅曲混合發(fā)酵 3 5 3 27 號(hào)酵母實(shí)驗(yàn)室及中試發(fā)酵糖蜜條件的優(yōu)化 3 5 3 2 i 最適p h 值的確定 3 5 3 2 2 最適接種量的確定 3 6 3 2 3 最適糖蜜濃度的確定 3 7 3 2 4 最佳時(shí)間的確定 3 8 3 2 5 發(fā)酵后發(fā)酵液的液相色譜分析 4 0 3 2 6 中試條件下糖蜜發(fā)酵的研究 4 l 3 2 7 發(fā)酵前后各種糖含量的變化 4 4 3 3 大豆糖蜜發(fā)酵液純化工藝的研究 4 4 3 3 1 發(fā)酵液的蛋白分子量測(cè)定 4 4 3 3 2 酸沉蚩白的工藝研究 4 5 i i 附錄 6 6 附錄a 6 6 附錄b 6 8 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 6 9 i l l 1 c o n t e n t s c o n t e n ts c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i i i 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1i n t r o d u c t i o no fm o l a s s e s 1 1 1 1p r e p a r a t i o na n dc o m p o s i t i o no fm o l a s s e s l 1 1 2r e s e a r c ho fm o l a s s e s 2 1 2s o y b c a no l i g o s a c c h a r i d e s 3 1 2 1p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f s o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e s 4 1 2 2a p p l i c a t i o no fs o y b e a r lo l i g o s a c c h a r i d e s 5 1 3b i o l o g i c a lp u r i f i c a t i o n 5 1 3 1i n t r o d u c t i o no f b i o l o g i c a lp u r i f i c a t i o n 5 1 3 2a d v a n t a g eo f b i o l o g i c a lp u r i f i c a t i o n 6 1 4i n t r o d u c t i o no f m a c r o p o r o u sr e s i n 7 1 4 1a d s o r p t i o nt h e o r yo fm a c r o p o r o u sr e s i n 7 1 4 2a p p l i c a t i o no f m a c r o p o r o u sr e s i n 7 1 5i n t r o d u c t i o no f l o ne x c h a n g er e s i n s 8 1 5 1a d s o r p t i o nt h e o r yo f i o ne x c h a n g er e s i n s 8 1 5 2a p p l i c a t i o no f l o ne x c h a n g er e s i n s 9 1 6p u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c eo f t h er e s e a r c h 1 0 1 7s t u d yo f t h es u h j e c t s 1 0 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d 1 2 2 1m a t e r i a l sa n de q u i p m e n t s 1 2 2 1 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 1 2 2 1 2e x p e r i m e n t a le q u i p m e n t s 1 2 2 1 3e x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 13 2 2e x p e r i m e n t a lm e t h o d s 1 3 2 2 1m e d i u m 13 2 2 2p r e p a r a t i o no f s t a n d a r ds o l u t i o n 1 3 2 2 3c o m p o n e n ta n a l y s i s 1 4 2 2 4c h r o m a t o g r a p i cc o n d i t i o n s 1 4 2 2 5d e t e r m i n a t i o no fc h r o m a t o g r a p h i cp e a k 1 4 2 2 6p r e t r e a t m e n to fm o l a s s e sh p l c 1 4 2 2 7d e t e r m i n a t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i ag r o w t hc u r v e 1 5 2 2 8d o m e s t i c a t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i a 1 5 2 2 9m o l a s s e sp r e t r e a t m e n to f l a c t i ca c i db a c t e r i a 1 5 2 2 1 0m o l a s s e sp r e t r e a t m e n to f m o n a s c u sr u b b e r 1 5 v l r 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩十學(xué)位論文 2 2 1lt h eo p e r a t i o no f p i l o tf e r m e n t a t i o n 1 6 2 2 1 2d e t e c tt h ev e l o c i t y o f n o 7 y e a s t 1 6 2 2 1 3d e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h t 1 6 2 3 1 4d e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nc o n t e n t 1 7 2 2 1 5a c i dp r e c i p i t a t i o np r o c e s so f p r o t e i n 1 8 2 2 1 6r e s i n sp r e t r e a t m e n t 1 8 2 2 1 7s t a t i ca d s o r p t i o ne x p e r i m e n t 1 9 2 2 1 8d y n a m i ca d s o r p t i o ne x p e r i m e n t s 1 9 2 2 1 9i o ne x c h a n g et h em o l a s s e s 1 9 2 2 2 0c o m p o n e n ta n a l y s i so f s o y b c a no l i g o s a c c h a r i d es y r u p 2 0 3l 王e s u i ta n da n a l y s i s 2 1 3 1s c r e e no f b a c t e r i u mf o rf e r m e n t a t i o no l i g o s a c c h a r i d e 2 1 3 1 1d e t e c t i o na n da n a l y s i so f m o l a s s e sb yh p l c 2 l 3 1 2c o m p o n e n ta n a l y s i so f m o l a s s e s 2 3 3 1 3t h eb i o m a s so f f i v ey e a s t su n d e rd i f f e r e n ts u c r o s ed e g r e e 2 3 3 1 4s t a c h y o s ea sac a r b o ns o u r c ec u l t u r e 2 6 3 1 5t h es e v e ny e a s to nt h eu t i l i z a t i o no fs o y b e a r lm o l a s s e s 2 7 3 1 6g r o w t hc u r v eo f l a c t i ca c i db a c t e r i a 2 8 3 1 7p a l t ec o u n ta n dp hv a l u eo f t h ef i r s td o m e s t i c a t e d 2 9 3 1 8c o n s u m p t i o ns u g a ro ft h ef i r s td o m e s t i c a t e d 2 9 3 1 9c o n s u m p t i o ns u g a rb ys u c r o s e 3 0 3 1 1 0p a l t ec o u n ta n dp hv a l u eo f t h es e c o n dd o m e s t i c a t e d 3 1 3 1 11l a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n 3 2 3 1 1 2m o n a s c u sf e r m e n t a t i o n 3 2 3 1 1 3m i x e df e r m e n t a t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i aa n dy e a s t 3 3 3 1 1 4m 政e df e r m e n t a t i o no f y e a s ta n dm o n a s c u s 3 4 3 1 1 5m i x e df e r m e n t a t i o no fl a c t i ca c i db a c t e r i aa n dm o n a s c u s 3 5 3 2o p t i m i z a t i o no f7y e a s t 3 5 3 2 1d e t e r m i n a t i o no f t h eo p t i m a lp h 3 5 3 2 2d e t e r m i n a t i o no f o p t i m u mi n o c u l u m 3 6 3 2 3d e t e r m i n et h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no f m o l a s s e s 3 7 3 2 4d e t e r m i n a t i o no f o p t i m u mt i m e 3 8 3 2 5h p l ca n a y l s i so ff e r m e n t a t i o ns o l u t i o n 4 0 3 2 6f e r m e n t a t i o np i l o to fm o l a s s e s 4 1 3 2 7s u g a rc o n t e n ta f t e rf e r m e n t a t i o n z m 3 3p u r i f i c a t i o no fm o l a s s e s z 1 4 3 3 1d e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h t 4 4 3 3 2a c i dp r e c i p i t a t i o np r o c e s so f p r o t e i n 4 5 v i l l 氣 c o n t e n t s 3 3 3s t a t i ca d s o r p t i o ne x p e r i m e n t 4 9 3 3 4d y n a m i ca d s o r p t i o ne x p e r i m e n t s 5 1 3 3 5c o m p o n e n ta n a l y s i so f r e c o v e r ys o l u t i o n 5 z 3 3 6t h ea p p l i c a t i o no f l o ne x c h a n g ei np u r i f i c a t i o no f s o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e 5 3 4d i s c u s s i o n s 5 9 4 1f e n n e n t a t i o nm o l a s s e sf o rr e m o v es u c r o s e 5 9 4 2c o m p a r et h em e t h o d st or e m o v ep r o t e i n 5 9 4 3t h el o s so fs u g a ri ni o ne x c h a n g e 5 9 5c o n c l u s i o na n do u t l o o k 6 0 a c k n o w l e d g e m e n t 6 1 r e f b r e n c e 6 2 a p p e n d i x o o a p p e n d i xa 6 6 a p p e n d i xb 6 8 p u b l i s h e da r t i c l ed u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 6 9 v i l l 研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)聲明和使用授權(quán)書(shū) 獨(dú)創(chuàng)聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的 研究成果 據(jù)我所知 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外 論文中不包含其 他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果 也不包含未獲得 或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)使用過(guò)的材料 與我一同工作的同志對(duì)本研究所做 的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意 學(xué)位論文作者簽名 褊次日期 口f o 年 月乒日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 學(xué)校有權(quán)保 留并向圍家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán) 允許論文被查閱和借閱 本人授權(quán)學(xué)校可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索 可以 采用影印 縮印或掃描等復(fù)制手段保存 匯編學(xué)位論文 保密的學(xué)位論文在解 密后適用本授權(quán)書(shū) 學(xué)位論文作者簽名 糲衣 日期 舶 o 年6 月 日 引一輒芬纓醐偽 引肌日 0 0 5 平行不顯著 四個(gè) 因素的三個(gè)水平有顯著差異 且a b c d 四個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)去除率均有極顯著影響 由 f 值結(jié)果可以看出 影響蛋白質(zhì)去除率的因素大小為 c b d a 即轉(zhuǎn)速 p h 值 攪拌時(shí) 間 不同的酸液 其中每個(gè)因素中四個(gè)水平對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響大小為a l a 3 a 2 b 2 b l b 3 c 2 c l c 3 d 2 d 3 d l 確定最佳提取工藝組合為a l b 2 c 2 d 2 因此酸沉淀法去除 蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件是4 h c l p h 值為3 轉(zhuǎn)速為6 0 0 0 r p m m i m 攪拌時(shí)間為1 0 r a i n 在此 條件 卜 進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 蛋白質(zhì)去除率可達(dá)到5 5 5 0 此結(jié)果大于任何一組正交 試驗(yàn)值 此時(shí)的總糖保留率為9 9 7 3 3 2 7 醇沉前后發(fā)酵液中糖和蛋白的變化 表3 1 5 酸沉前后的變化 t a b l e3 15c h a n g e sa r o u n da c i d p r e c i p i t a t i o 通過(guò)表3 1 5 我們可以看出在酸沉蛋白的過(guò)程中 對(duì)糖的損失兒乎可以不計(jì) 此時(shí)的總 糖保留率為9 9 7 但是總吲含量減少了5 說(shuō)明在清除蛋白的過(guò)程中也將發(fā)酵液中的一些 其它成分同時(shí)清除 如人豆異黃酮等 3 3 3 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 3 3 3 1 樹(shù)脂的篩選 準(zhǔn)確稱(chēng)取5 9 樹(shù)脂 并加入4 0 m l 的人豆糖蜜超濾液 攪拌4 h 后測(cè)定濾液在4 2 0 n m 處的 吸光度 各種樹(shù)脂對(duì)大豆糖蜜超濾液的脫色率及總糖保留率見(jiàn)表4 5 4 9 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩 f j 學(xué)位論文 表3 1 6 不同樹(shù)脂脫色率及總糖保留率 t a b l e3 16d e c o l o r a t i oa n dr e m a i n d e rr a t ef r o md i f f e r e n tm a c r o p o r o u sr e s i n 大豆糖蜜中異黃酮的含量較高 在分離純化異黃酮方面 大孔吸附樹(shù)脂具有極人的優(yōu)越 性 一般主要選擇a b 8 樹(shù)脂 而據(jù)報(bào)道 大豆糖蜜中的色素主要以陰離子的形式存在 a r t i d u m b r e p a t i l 等 2 0 0 8 因此陰離子交換樹(shù)脂在糖液脫色的研究中應(yīng)用的也較多 考慮以上 因素 岡此主要選擇了a b 8 d 2 0 1 和d 3 1 5 這3 種大孔樹(shù)脂 從表3 一1 6 可以看到 a b 8 樹(shù)脂對(duì)大豆糖蜜超濾液的脫色率最高 其次為d 2 0 1 d 3 1 5 樹(shù)脂的脫色效果最差 說(shuō)明樹(shù)脂的極性是影響樹(shù)脂對(duì)料液脫色效果的主要因素 a b 8 樹(shù)脂的 脫色率最高說(shuō)明料液中的有色物質(zhì)主要為弱極性的 與樹(shù)脂的極性相符 同時(shí)由于a b 8 樹(shù) 脂具有較大的比表面積和合適的孔容 因而它對(duì)色素的吸附能力最強(qiáng) d 2 0 1 樹(shù)脂也具有不錯(cuò) 的脫色效果 但是他對(duì)總糖的保留率較低 綜合脫色率和總糖保留率等因素 我們選擇a b 8 為酸沉后發(fā)酵液的脫色樹(shù)脂 3 3 3 2p h 值對(duì)a b 8 樹(shù)脂的脫色率和總糖保留率的影響 1 0 0 承8 0 褂 圈 毖6 0 4 0 345 6 p h 值 圖3 3 8p h 值對(duì)a b 一8 樹(shù)脂的脫色率及總糖保留率的影響 f i g 3 3 8e f f e c to f p hu p o nd e c o l o r a t i oa n dr e m a i n d e rr a t eo f a b 8 大孔吸附樹(shù)脂主要以范德華力與有機(jī)物結(jié)合 因此有機(jī)物的存在形式會(huì)直接影響樹(shù)脂對(duì) 它的吸附效果 由于異黃酮分子中含有酚羥基 呈弱酸性 因此選擇在弱酸或酸性條件下吸 附 圖3 3 8 表明p h 值對(duì)a b 8 樹(shù)脂的脫色率有較大的影響 最佳的p h 值為3 0 脫色率為 9 2 8 3 總糖保留率為9 6 6 5 這與龍禎等 2 0 0 8 有一點(diǎn)差別 他研究的大豆糖蜜超濾液 中a b 一8 脫色的最佳p h 值為4 0 這可能與我們的原來(lái)及純化工藝有所不同造成的 3 3 3 3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程 5 0 012 345 67 時(shí)間 h 圖3 3 9a b 8 樹(shù)脂的靜態(tài)吸附的曲線 f i g 3 3 9t h ea d s o r p t i o nc u r v eo f a b 8 a b 8 樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖3 3 9 可見(jiàn)a b 8 樹(shù)脂對(duì)大豆糖蜜發(fā)酵液的脫色速 度較快 4 0 m i n 后脫色率即可達(dá)9 0 之后脫色率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增加十分緩慢 至l h 時(shí)基 本達(dá)到了吸附平衡點(diǎn) 總糖的損失隨時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢下降 在4 h 前總糖的保留率都在9 0 以上 但在4 h 以后總糖的下降趨勢(shì)增大 綜合脫色率和總糖保留率兩種因素 最終確定靜態(tài) 吸附的時(shí)間為2 h 此時(shí)脫色率為9 3 9 6 總糖保留率為9 6 8 7 3 3 4 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 3 3 4 1 流速對(duì)a b 8 樹(shù)脂脫色率的影響 024681 01 2 1 41 61 82 0 v p b v 圖3 4 0 不同的流速對(duì)a b 8 人孔樹(shù)脂脫色效果的影響 f i g 3 4 0e f f e c to ff l o w r a t eu p o nd e c o l o r i z a t i o n 5 l 佰 弘 o 姍鼬賬 加 薩鏨 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩十學(xué)位論文 控制不同的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 圖3 4 0 表明 流速越慢 脫色效果越好 這是因?yàn)?流速慢 有利于料液中的色素成分在柱床中被充分的吸附 當(dāng)流速為1 5 b v h o 時(shí) 可處理 4 5 b v 左右的料液 并保持9 0 以上的脫色率 在3 b v h 4 5 b v h 的流速下 整體的脫 色率較1 5 b v h 1 的依次下降 因此控制最佳的流速為1 5 b v h 一 3 3 4 2 動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程中總糖濃度的變化 每隔一定的時(shí)間 從流出液中取脫色液l m l 對(duì)其總糖濃度進(jìn)行測(cè)定 圖3 4 1 表示流出 液的總糖濃度 而不是回收液即時(shí)的濃度 所以會(huì)有即時(shí)的濃度大于原液中總糖濃度的狀況 圖3 4 l 為流山液總糖濃度 v p 與樹(shù)脂床層體積 b v 的比值的變化關(guān)系 由該圖可以看到 當(dāng)開(kāi)始的2 5 b v 內(nèi)之所以總糖濃度的變化很大 主要原因在于樹(shù)脂的間隙內(nèi)還殘留了一部分 水 對(duì)料液起了稀釋的作用 同時(shí)由上面的分析可以看到a b 8 樹(shù)脂對(duì)糖也有部分的吸附 料液的處理量為1 5 b v 時(shí) 流出液中總糖的濃度為3 0 2 1 m g m l 大于原液的濃度2 8 6 3 m g m g m l l 這是動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程中 a b 8 吸收的糖分定向堆積造成的濃度變化 最后達(dá)到一種 動(dòng)態(tài)的平衡 隨著流出液體積v p 的增大 糖濃度逐漸下降 到4 5 b v 以后 總糖濃度基本 剛保持不變 保留率為7 5 左右 之后流出液總糖濃度基本維持在一穩(wěn)定的值 而總回收液 在4 5 b v 時(shí)總糖的保留率為9 8 3 0 此時(shí)脫色效果也在9 0 以上 所以在動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程中 我們選擇的流出液體積與床體積的比值為4 5 b v 總糖濃度 02 v p 磊b v 68 圖3 4 lv p b v 的變化 f i g 3 4 lc h a n g e so f v p v b 3 3 5 脫色后回收液成分的測(cè)定 3 3 5 1 脫色前后的色譜圖 為了更好的了解a b 8 樹(shù)脂對(duì)低聚糖的吸附情況 用h p l c 法測(cè)定樹(shù)脂吸附前后大豆糖 蜜超濾液中低聚糖的含量 圖3 4 2 為經(jīng)a b 8 樹(shù)脂吸附前后得到的糖漿的h p l c 圖譜 可以 與圖3 2 6 進(jìn)行比較 5 2 5 0 5 0 5 0 5 o 3 3 2 2 1 1 m 8iii趟篷爨國(guó) 圖3 4 2a b 8 脫色后的糖液色譜圖 f i g 3 4 2c h r o m a t o g r a mo f m o l a s s e ss o l u t i o na f t e rd e c o l o r i z a t i o n b 蔗糖c 棉子糖d 水蘇糖 b s u c r o s ec r a f f m o s ed s t a c h y o s e 3 3 5 2 脫色前后發(fā)酵液中各成分的變化 表3 1 7 脫色前后主要成分對(duì)比 t a b l e3 17t h ec o m p a r i s o no fm a i nc o m p o s i t i o na r o u n dd e c o l o r i z a t i o n 由表3 1 7 可以看到 a b 8 樹(shù)脂具有相當(dāng)不錯(cuò)的脫色效果 總糖占總固含物的含量己由 5 8 6 5 上升到7 5 4 蛋白含量降為酸沉后的7 左右 3 3 6 離子交換技術(shù)在純化大豆低聚糖中的應(yīng)用 3 3 6 1 強(qiáng)酸 強(qiáng)堿離子交換樹(shù)脂的串聯(lián)使用 實(shí)驗(yàn)中選用了f2 6 x 3 0 c m 的玻璃層析柱 裝填高度2 5 c m 流速1 2 b v h 一 寶溫條件下 處理 先將粗糖液泵入0 0 1 x 7 型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂床 每隔一段時(shí)間測(cè)定流出液的p h 值和電導(dǎo)率 具體結(jié)果見(jiàn)表3 1 8 5 3 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩 j 學(xué)位論文 表3 1 8 粗糖液通過(guò)0 0 1 x 7 型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂床的p h 值和電導(dǎo)率變化 t a b l e3 18c h a n g e so fp ha n dc o n d u c t i v i t yi n0 01x 7c a t i o ne x c h a n g er e s i n 由表3 1 8 可以看劍 2 0 m i n 后流出液的p h 值急劇下降 說(shuō)明料液中的陽(yáng)離子與樹(shù)脂上 的h 發(fā)生了交換 之后的p h 基本穩(wěn)定在1 4 1 5 之間 同時(shí)電導(dǎo)率急劇上升 當(dāng)p h 值再次 回升后 此時(shí)停止上樣 此柱對(duì)料液的處理量大約為8 b v 將上述流出液泵入2 0 1 x 7 型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂床 每隔一段時(shí)間測(cè)定流出液的p h 值和電導(dǎo)率 具體結(jié)果見(jiàn)表3 1 9 表3 1 9 粗糖液通過(guò)由表3 1 9 可以看到 1 5 m i n 后p h 值急劇增大 料液中的負(fù)電性離子 與陰離子樹(shù)脂上的o h 發(fā)生交換 電導(dǎo)率則快速下降 說(shuō)明料液經(jīng)過(guò)陽(yáng)一陰床后 已達(dá)到了 很明顯的脫鹽效果 結(jié)果與分析 圖3 1 92 0 1 7 型陰離子交換樹(shù)脂床的p h 值和電導(dǎo)率變化 t a b l e3 1 9c h a n g e so f p ha n dc o n d u c t i v i t yi n2 0 1 7a n i o ne x c h a n g er e s i n 由表中的數(shù)據(jù)可以看出 2 0 1 7 型樹(shù)脂的交換能力下降的很快 在停止進(jìn)樣前的1 2 m i n 料液的p h 值很快回落 同時(shí)由以上兩表還可以看到 強(qiáng)酸性陽(yáng)離子的交換能力遠(yuǎn)大于強(qiáng)堿 性陰離子 此陰離子交換樹(shù)脂可處理大約4 b v 的料液 3 3 6 2 強(qiáng)酸 弱堿離子交換樹(shù)脂的串聯(lián)使用 實(shí)驗(yàn)操作條件同上 粗糖液流經(jīng)陽(yáng)床的p h 值和電導(dǎo)率的變化同表3 1 8 流經(jīng)陰床d 3 0 1 樹(shù)脂的p h 值和電導(dǎo)率的變化如表3 2 0 5 5 導(dǎo)率為1 0 0 9 時(shí)停止了進(jìn)樣 使得電導(dǎo)率維持在1 左右 3 3 6 1 3 過(guò)三種離子交換樹(shù)脂后的總糖 總氮變化 表3 2 1 通過(guò)三種樹(shù)脂后成分變化 t a b l e3 21c h a n g e so fc o m p o s i t i o na f t e rp a s st h r e er e s i n s 通過(guò)表3 2 1 我們可以看出 0 0 1 x 7 與2 0 1 x 7 串聯(lián)對(duì)糖的損壞較人 并且0 0 1 與2 0 l 串聯(lián) 的回收液顏色也為淺黃色 0 0 1 x 7 與d 3 0 1 串聯(lián)的回收液為無(wú)色透明的液體 3 3 6 4 回收樣的凍千 5 6 圖3 4 3 回收凍干樣品的照片 f i g 3 4 3p i c t u r e so ff r e e z e d r i e ds a m p l e 圖3 4 3 是0 0 1 x 7 與d 3 0 1 串聯(lián)和0 0 1 x 7 與2 0 1 x 7 串聯(lián)回收樣品的凍干粉 0 0 1 x 7 與d 3 0 1 串聯(lián)的凍干樣品口感微甜 沒(méi)有任何異味 與目前超市里賣(mài)的低聚糖味道接近 但0 0 1 與2 0 1 串聯(lián)的凍于樣品口感微辣 顏色泛黃 不適合投入市場(chǎng) 并且通過(guò)對(duì)兩種樣品的總糖含量分 析 我們得到d 3 0 1 和2 0 1 x 7 兩種樣品的總糖含量分別為0 9 3 6 6 9 g 1 和0 8 3 4 1 9 g 1 所以最 終確定用d 3 0 1 作為陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行樣品的純化 一 二 鼉 卜 8 h h w j 圖3 鉑通過(guò)d 3 0 1 回收液的液相圖譜 f i g 3 4 4c h r o m a t o g r a mo fc o l l e c t i o np a s s i n gd 3 0 1r e s i n b 蔗糖c 棉子糖d 水蘇糖 b s u c r o s ec r a f f i n o s ed s t a c h y o s e 5 7 r 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩十學(xué)位論文 d 3 0 1 同收液的h p l c 圖3 4 4 與圖4 4 2 對(duì)比我們可以看到各種糖分發(fā)生的變化 糖的 保留率為8 9 7 4 總糖占總固含物9 4 0 0 其中蔗糖占2 0 1 m g m l l 4 7 7 m g m l 1 8 4 1 m g m l 功能性成分占總固形物的8 6 5 2 5 8 一 i p l 4 討論 4 1 糖蜜發(fā)酵除蔗糖 袁其朋等 2 0 0 3 對(duì)大豆乳清進(jìn)行發(fā)酵 乳清中加入酵母膏后 可以使蔗糖全部被分解 掉 而且在發(fā)酵3 6 h 后 水蘇糖和棉籽糖的保留率依然在9 5 以上 本研究中酵母對(duì)糖的利 用能力很強(qiáng) 在蔗糖沒(méi)有完全分解前就開(kāi)始利用棉子糖和水蘇糖 并且在發(fā)酵1 2 h 后蔗糖保 留率就低于1 0 此時(shí)的棉籽糖和水蘇糖就開(kāi)始少量分解 這種差異可能是原料與菌株不同 造成的 劉欣等 2 0 0 6 用乳酸菌對(duì)大豆乳清發(fā)酵 可以順利的清除乳清中的蔗糖 效果明 顯 本研究中用保加利亞乳酸菌對(duì)大豆糖蜜進(jìn)行發(fā)酵 并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖蜜中糖分的利用有 特異性 4 2 蛋白清除方法的比較 目前對(duì)大豆乳清或大豆糖蜜中的蛋白進(jìn)行去除 所用主要的方法為酸沉法 醇沉法 超 濾法或膜分離等方法 由于酸沉法提取液中的蛋白及其他雜質(zhì)較高 醇沉淀法對(duì)低聚糖的損 失有很?chē)?yán)重 馬鶯等 2 0 0 0 所以現(xiàn)在用超濾的方法比較普遍 但是由于超濾法對(duì)蛋白分子 的清除具有選擇性 分子量低于超濾膜孔徑的無(wú)法被分離 而經(jīng)離心后的大豆糖蜜發(fā)酵液上 清液的分子量低于6 0 0 分子量很小 運(yùn)用超濾和膜分離的方法無(wú)法攔截蛋白分子 分離較 困難 而發(fā)酵液p h 值接近于3 運(yùn)用酸沉蛋白的方法不需要再添加過(guò)多酸溶液 就可沉淀去 除蛋白 去除率為5 5 3 0 酸沉后的發(fā)酵液滿足大孔脫色的要求 濾液沒(méi)有對(duì)后期的純化帶 來(lái)困難 所以本實(shí)驗(yàn)推薦用先離心然后酸沉蛋白的方法去除大豆糖蜜發(fā)酵液中的蛋白 4 3 離子交換樹(shù)脂對(duì)糖的損失 蔣麗華等 2 0 0 7 對(duì)運(yùn)用0 0 1 x 7 強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂與2 0 1 x 4 強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂 對(duì)脫色后的大豆糖蜜進(jìn)行離子交換時(shí) 總糖損失較嚴(yán)重 為1 8 3 0 本研究中0 0 1 x 7 強(qiáng)酸性 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂與2 0 1 7 強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂聯(lián)用對(duì)脫色后的火豆糖蜜發(fā)酵液進(jìn)行離子交 換時(shí)總糖損失2 0 2 與其的研究結(jié)果基本一致 但用0 0 1x 7 強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂于d 3 0 1 弱堿性陰離子交換樹(shù)脂聯(lián)用時(shí) 總糖的損失為1 0 6 相對(duì)較小 并且純化出來(lái)的樣品成白 色透明狀 效果較好 可見(jiàn)用一種弱堿性的陰離子交換柱代替強(qiáng)堿性的陰離子交換柱對(duì)總糖 的保留率有所提高 弱極性的離子交換柱有利于低聚糖在純化過(guò)程中的穩(wěn)定性 5 9 二 一 一 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩一 學(xué)位論文 5 結(jié)論 1 對(duì)大豆糖蜜主要成分進(jìn)行測(cè)定 其中總固形物占6 6 5 8 總糖占4 8 6 1 蛋白占 8 1 4 灰分5 5 4 通過(guò)h p l c e l s d 對(duì)大豆糖蜜進(jìn)行測(cè)定 對(duì)照線性回歸方程 得到大豆 糖蜜中含有蔗糖3 1 7 5 3 r a g m l l 棉子糖4 3 6 6 m g m e l 水蘇糖1 7 5 4 2 m g m l 1 2 通過(guò)對(duì)酵母菌 乳酸菌 紅曲及混合發(fā)酵的篩選 確定了酵母7 號(hào)菌才能滿足去除大 豆糖蜜中蔗糖 同時(shí)保留棉子糖 水蘇糖的要求 可以使功能性低聚糖占總糖的比例由原來(lái) 的4 0 2 4 提高到8 8 5 7 3 確定了酵母7 號(hào)菌在實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)酵的最佳條件 發(fā)酵初始p h 為5 0 接種量為 2 大豆糖蜜稀釋8 倍 溫度2 8 1 8 0 r p m m i n 發(fā)酵的時(shí)間是1 2 h 大豆糖蜜發(fā)酵液中 各糖分的保留率為 蔗糖 5 7 6 棉予糖 9 9 6 1 水蘇糖 9 5 7 2 4 確定了在2 0 l 發(fā)酵罐下發(fā)酵的最佳條件 除實(shí)驗(yàn)室下確定的優(yōu)化條件外 還確定了 不需要保持p h 值恒定 發(fā)酵期間不需要控制溶氧 此時(shí)的蔗糖的保留率為1 9 6 9 此時(shí)棉 子糖和水蘇糖的保留率分別為9 8 0 7 9 9 9 6 與實(shí)驗(yàn)室最有條件發(fā)酵的結(jié)果相比 蔗糖保 留率略高 說(shuō)明在不同規(guī)模下發(fā)酵 最佳條件會(huì)有一定的變化 5 確定了發(fā)酵液的酸沉蛋白的最佳條件 4 h c l p h 為3 0 攪拌時(shí)間為1 0 m i n 6 0 0 0 轉(zhuǎn)離心1 0 m i n 正交實(shí)驗(yàn)的最佳結(jié)果是蛋白質(zhì)清除率可達(dá)到5 5 5 0 總糖的保留率為9 9 7 總糖占總固含物由酸沉前的5 3 3 0 提高至5 8 6 5 通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中蛋白分子量的測(cè)定 確 定發(fā)酵液中的蛋白分子量都小于1 0 0 0 更適合用福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 6 酸沉后發(fā)酵液選用a b 8 脫色 靜態(tài)吸附的最佳條件為 p h 值為3 吸附時(shí)間為2 h 此時(shí)脫色率為9 3 9 6 總糖保留率為9 6 8 7 動(dòng)態(tài)吸附的最佳條件 流速在1 5 b v h 一 流 出體積為4 5 b v 此時(shí)脫色率為9 2 總糖保留率為9 8 3 0 總糖占總同含物的7 5 4 7 選用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂0 0 1 x 7 和強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂2 0 1 x 7 強(qiáng)堿性陰離子交 換樹(shù)脂或弱堿性陰離子交換樹(shù)脂d 3 0 1 聯(lián)用的方法對(duì)大孔樹(shù)脂脫色后的粗糖漿進(jìn)行離子交換 確定了0 0 1 x 7 和d 3 0 1 組合對(duì)脫色糖漿的離子交換效果較好 操作條件為 先陽(yáng)后陰的方式 連接 室溫 流速1 2 b v h 1 0 0 i x 7 型樹(shù)脂的交換能力約為9 b v d 3 0 1 型樹(shù)脂的交換能力 為6 b v 左右 最終得到的糖液的所有的含氮物質(zhì)被去除 糖的保留率為8 9 7 4 總糖占總 固含物9 4 0 0 此時(shí)蔗糖占2 0 5m g m l 4 8 8 m g m l 一 1 8 8 7 m g m l l 功能性成分占總固 形物的8 6 5 1 8 將純化的低聚糖液體經(jīng)過(guò)冷凍干燥 0 0 1 x 7 和d 3 0 1 組合的回收液得到了白色透亮的 粉末 味微甜的大豆低聚糖 總糖含量o 9 4 9 g 0 0 1 x 7 和2 0 1 x 7 組合回收的凍干樣品成淺 黃色 總糖含量2 0 1 x 7 為0 8 3 9 g 6 0 k l r 致謝 致謝 三年的研究生學(xué)習(xí)生涯轉(zhuǎn)眼就要過(guò)去了 這三年對(duì)我來(lái)說(shuō)受益匪淺 也感慨頗多 在此 我要特別感謝我的導(dǎo)師常纓教授 正是由于她的推薦我才有機(jī)會(huì)在北京 t 商大學(xué)完成我的研 究生畢業(yè)課題 導(dǎo)師勤奮 嚴(yán)謹(jǐn) 精益求精的治學(xué)態(tài)度給我留下了很深刻的印象 這對(duì)我以 后都將有著很深遠(yuǎn)的影響 此外 常老師在生活上也給了我許多幫助 在此我深表謝意 在北京工商大學(xué)做畢設(shè)期間 我特別要感謝王呂濤教授對(duì)我的悉心指導(dǎo) 無(wú)論在選題 實(shí)驗(yàn)方案 實(shí)驗(yàn)設(shè)備等方面都給我了巨火的幫助 我才能順利的完成本課題 王老師為人謙 遜 對(duì)待學(xué)術(shù)一絲不茍 對(duì)待學(xué)生平易近人 但工作效率非常驚人 從他身上我學(xué)會(huì)了如何 安排時(shí)間 如何更好的完成課題 此外 我還要感謝我的師姐黃慶陽(yáng) 佟偉雙 我的同窗好友李鶴春同學(xué) 無(wú)論是平時(shí)的 生活還是實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題 他們都給予了許多關(guān)懷和幫助 在北京這段時(shí)間 本校里幾乎 所有事情都拜托她們幫忙 平日里如兄弟姐妹般的感情讓我終身難忘 非常感謝他們帶給我 的許多快樂(lè) 我想在我踏入工作崗位后或許很難再尋找到這樣的友誼了 在此論文完成之際 特別感謝我的家人及親友三年來(lái)在物質(zhì) 精神上給予的關(guān)心和支持 這是我不斷進(jìn)取的動(dòng)力 最后 感謝所有關(guān)心和支持我的人 謝謝1 6 l 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩七學(xué)位論文 參考文獻(xiàn) 畢金峰 李春紅 2 0 0 4 酵母發(fā)酵法在分離提純低聚異麥芽糖中應(yīng)用的研究 j 食品科學(xué) l o 大連輕工業(yè)學(xué)院等合編 1 9 9 4 食品分析 m 中國(guó)輕j 二業(yè)出版社 1 9 9 4 董群 鄭麗伊 方積年 1 9 9 6 改良的苯酚硫酸法測(cè)定多糖和寡糖含量的研究 j 中國(guó)藥學(xué)雜 志 31 9 5 5 0 5 5 3 杜連起 張洪新 尚艷芬等 1 9 9 4 國(guó)產(chǎn)干酵母活化方法的研究 j 河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué) 報(bào) 19 9 4 8 0 41 4 4 段素芳 2 0 0 9 微生物提取水蘇糖的研究 j 優(yōu)秀碩士論文 9 3 方偉輝 2 0 0 4 大豆糖蜜分離及低聚糖成分生物凈化的研究 j 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 9 方偉輝 華欲飛 張酷等 2 0 0 4 大豆粕酒精可溶物的成分分離與鑒定 j 中國(guó)油脂 2 9 1 5 7 6 1 高英 俞玉忠 2 0 0 4 福林酚法測(cè)定腦蛋白水解物溶液中的多肽含量 j 海峽藥學(xué) 1 6 龔云表 石安富 1 9 9 3 合成樹(shù)脂與塑料手冊(cè) 上海 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社 3 6 7 谷成燕 2 0 0 9 a b 一8 大孔樹(shù)脂與硅膠柱層析分離姜酚的對(duì)t l j 優(yōu)秀碩士論文 5 何炳林 黃文強(qiáng) 1 9 9 5 離子交換與吸附樹(shù)脂 m 北京 人民衛(wèi)生出版社 1 9 9 5 洪專(zhuān) 黃宏南 許晨 許建中 2 0 0 7 h p l c e l s d 測(cè)定氨基葡萄糖含量 j 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志 1 7 6 1 0 2 5 1 0 2 6 胡箭衛(wèi) 繆正瀛 程瑛等 2 0 0 4 離子交換樹(shù)脂用于蜂蜜脫色的機(jī)理探析 j 養(yǎng)蜂技術(shù) 5 3 7 3 8 黃海 楊瑞金 王璋 2 0 0 2 低聚木糖的脫色工藝 j 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào) 2 1 2 1 2 5 1 2 9 黃賢校 谷克仁 趙一凡 2 0 0 6 大豆低聚糖的生產(chǎn)工藝研究 j 糧油食品科技 1 4 5 2 9 3 0 黃祥斌 于淑娟 高大維 2 0 0 1 幾種離子交換樹(shù)脂用于糖漿脫色的比較研究 j 食品科學(xué) 2 2 4 11 1 3 蔣麗華 2 0 0 7 人豆糖蜜中低聚糖的分離純化 d 碩士學(xué)位論文 無(wú)錫 江南大學(xué)食品學(xué)院 江曼 2 0 0 9 混合菌種固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽的研究 j 山東食品發(fā)酵 l 2 6 2 9 李玫 尚明華 2 0 0 3 影響凱氏定氮法準(zhǔn)確性的因素 j 中國(guó)飼料 9 2 5 2 5 1 李善吉 伍勝君 2 0 0 5 大孔樹(shù)脂的應(yīng)用研究概況 j 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào) 4 2 1 l 1 3 劉國(guó)慶 朱翠萍 王占生 2 0 0 3 大孔樹(shù)脂對(duì)大豆乳清廢水中異黃酮的吸附特性研究 j 離子 交換與吸附 2 0 0 3 1 9 3 2 2 9 2 3 4 劉欣 2 0 0 6 乳酸菌發(fā)酵法生產(chǎn)高活性大豆低聚糖的研究 j 食品 t 業(yè)科技 l1 2 7 龍禎 蔣麗華 華欲飛 2 0 0 8 大孔樹(shù)脂對(duì)人豆糖蜜超濾液的脫色效果研究 j 中國(guó)油脂 3 3 2 孟雷 袁其朋 2 0 0 7 利用大孔樹(shù)脂從大豆糖蜜中回收大豆異黃酮 j 大豆科學(xué) 2 6 3 4 3 5 4 3 8 馬鶯 駱承序 肖志剛 2 0 0 0 超濾法提取大豆低聚糖的研究 j 糧油食品科技 8 5 1 7 1 9 6 2 l 叫 田娟娟 崔元峰 白志明 2 0 0 8 用酸沉淀法分離大豆糖蜜中蛋白質(zhì)的研究 j 黑龍江糧食 1 4 3 4 6 王恩大 邵廣武 2 0 0 0 離子交換樹(shù)脂在玉米淀粉糖生產(chǎn)中的應(yīng)用 j 遼寧化工 2 9 4 2 4 2 2 4 6 冊(cè)21 5 2 0 1 211 王海吉 2 0 0 9 混合乳酸菌發(fā)酵胡蘿卜的研究 j 中國(guó)調(diào)味品 5 3 4 7 5 8 7 汪洪武 劉艷清 2 0 0 5 大孔吸附樹(shù)脂的應(yīng)用研究進(jìn)展 j 材 2 8 4 3 5 3 3 5 6 王立梅 齊斌 周惠明 2 0 0 7 日本曲霉菌體固定化及改性大豆低聚糖的研究 j 食品機(jī)械 2 3 0 l 葉振華等