（細胞生物學專業(yè)論文）小麥及其麥芽的木聚糖和木聚糖酶的研究.pdf

目錄 摘要 1 a b s t r a c t 3 l 引言 5 1 1 啤酒 5 1 2 我國小麥生產(chǎn)與加工現(xiàn)狀 8 1 3 小麥啤酒 9 1 4 小麥芽 1 1 1 5 阿拉伯木聚糖 1 2 1 5 1 結構 1 2 1 5 2 理化性質 1 4 1 5 3 含量 1 5 1 5 4 阿拉伯木聚糖對釀酒的影響 1 8 1 5 5 阿拉伯木聚糖的提取 純化與測定 1 8 1 6 木聚糖酶 1 9 1 6 1 來源 1 9 1 6 2 結構 2 0 1 6 3 作用機理 2 0 1 6 4 酶學性質 2 1 1 6 5 純化 2 4 1 6 6 測定 2 5 1 7 立題背景及研究的目的意義 2 6 1 8 主要研究內(nèi)容與目標 2 6 2 材料與方法 2 7 2 1 試驗材料 2 7 2 2 主要藥品 2 7 2 3 主要儀器 2 8 2 4 試劑 2 8 2 5 試驗方法 2 9 2 5 1 制麥芽 2 9 7川6 l唧6 8 7 ii l y 2 5 2 間苯三酚標準工作曲線的制作 2 9 2 5 3 木聚糖的提取 31 2 5 4 木聚糖樣品測定 3 l 2 5 5 木糖與d n s 反應標準工作曲線 31 2 5 6 木聚糖降解酶系粗酶液的提取 3 2 2 5 7 木聚糖酶酶活測定 3 2 2 5 8 酶活計算 3 2 2 5 9 酶學性質 3 3 2 5 1 0 浸麥度對木聚糖含量和木聚糖酶活的影響 3 4 2 5 1 1 制麥過程中木聚糖酶酶活變化 3 4 2 6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 3 4 3 結果與分析 3 4 3 1 間苯三酚木糖反應掃描圖譜標準工作曲線 3 4 3 2 間苯三酚反應條件 3 4 3 3 阿拉伯木聚糖含量 3 7 3 3 1 堿溶性木聚糖含量 3 7 3 3 2 水溶性木聚糖含量 3 8 3 3 3 小結 3 9 3 4d n s 標準曲線 3 9 3 5d n s 反應條件 3 9 3 6 小麥與麥芽木聚糖酶 4 2 3 7 阿拉伯木聚糖含量和木聚糖酶酶活的相關性分析 4 3 3 8 木聚糖酶酶學性質 4 4 3 8 1 最適溫度 4 4 3 8 2 最適p h 4 4 3 8 3 最適反應時間 4 4 3 8 4 最適e s 4 5 3 8 5 最適底物濃度 4 6 3 8 6 小結 4 7 3 9 浸麥度的影響 4 7 8 致謝 6 3 9 攻讀學位期間發(fā)表論文情況 6 4 山東農(nóng)業(yè)人學碩士學位論文 摘要 小麥麥芽是良好的啤酒釀造原料 釀出的啤酒風味獨特 符合啤酒 的發(fā)展潮流 應用前景廣闊 研究篩選適宜釀造的小麥品種 作為延長 小麥產(chǎn)業(yè)鏈條 提高小麥附加值的一種方式可以擴大小麥出路 刺激小 麥種植業(yè)以加工為導向發(fā)展 拉動小麥內(nèi)需 增加農(nóng)民收入 推動我國 小麥產(chǎn)業(yè) 麥芽工業(yè) 啤酒工業(yè)健康發(fā)展 其經(jīng)濟意義 社會意義巨大 然而小麥芽中富含的阿拉伯木聚糖對小麥芽在釀酒中的應用又很大的 影響 因此研究阿拉伯木聚糖含量與木聚糖降解酶系的酶活成為重要項 目之一 本研究對1 1 個小麥品種的阿拉伯木聚糖含量及木聚糖酶酶活 進行測定 并對木聚糖酶的酶學性質進行了研究 為適于釀酒小麥品種 的篩選提供基礎 主要結果如下 1 間苯三酚 冰醋酸法的最適條件是反應液用量1 0m l 反應2 0 m i n 冷卻后3 0 m i n 內(nèi)基本穩(wěn)定 尸 o 0 5 28 9 1 0 號小麥中堿溶性阿拉伯木聚糖含量最低 p o 0 5 分 別為o 5 8 11 0 0 1 2 7 0 6 6 0 5 4 0 0 6 2 0 和0 6 6 0 3 0 0 3 0 1 9 1 0 號麥 芽中堿溶性阿拉伯木聚糖最低 尸 o 0 5 含量分別為0 9 7 4 6 4 0 0 0 8 5 和o 7 7 9 7 4 0 0 5 0 8 34 8 1 0 號小麥中水溶性阿拉伯木聚糖含量最低 尸 0 0 5 分 別為o 5 4 2 3 4 0 0 6 4 5 0 4 6 8 1 4 0 0 1 2 7 和0 3 8 2 8 4 0 0 4 0 3 而在麥芽中 7 8 號品種最低 尸 o 0 5 含量為0 3 3 6 2 4 0 0 5 1 8 和0 2 4 2 9 4 0 0 4 6 7 4 小麥發(fā)芽后 大部分品種堿溶性阿拉伯木聚糖含量升高 增大最 多的是4 7 8 號品種 尸 0 0 5 只有3 號品種略微減少 水溶性阿 拉伯木聚糖含量都降低 5d n s 反應最適條件為反應液用量3m l 反應15 r a i n 反應完成后 3 5 m i n 內(nèi)基本穩(wěn)定 尸 0 0 5 6 小麥發(fā)芽后木聚糖酶酶活均增大 小麥的酶活都在6 5 0 0 8 5 0 0 i u g 之間 而在麥芽中各個品種間的差異不顯著 尸 o 0 5 都在 1 0 0 0 0 1 1 5 0 0i u m l 之間 7 原小麥中水溶性阿拉伯木聚糖含量與堿溶性阿拉伯木聚糖含量 呈極顯著正相關 尸 0 0 1 而木聚糖酶酶活與阿拉伯木聚糖含量呈負 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 相關 p 0 0 5 而在小麥芽中水溶性阿拉伯木聚糖含量與堿溶性阿拉 伯木聚糖含量呈負相關 尸 0 0 5 而木聚糖酶酶活與水溶性阿拉伯木 聚糖含量呈負相關 尸 o 0 5 而與堿溶性阿拉伯木聚糖呈極顯著正相 關 j p 0 0 5 2t h en o 8 n o 9a n dn o 10o fw h e a th a dt h el o w e s tc o n t e n t so fa e a x w h i c hw e r e0 5 811 0 012 7 0 6 6 0 5 士0 0 6 2 0 a n d0 6 6 0 3 士0 0 3 0l r e s p e c t i v e l y p o 0 5 t h en o 9a n dn o 10o fw h e a tm a l t sh a dt h el o w e s t c o n t e n to fa e a x w h i c hw e r e0 9 7 4 6 士0 0 0 8 5 a n d0 7 7 9 7 士0 0 5 0 8 r e s p e c t i v e l y p 0 0 5 3f o rc o n t e n to f w b 氣x t h en o 4 n o 8a n dn o 1 0o f w h e a t s p o 0 5 a n dt h en o 7a n dn o 8o fw h e a tm a l t s p 0 0 5 h a dt h el o w e s t w h i c hw e r e 0 5 4 2 3 士0 0 6 4 5 0 4 6 8 1 土0 0 1 2 7 0 3 8 2 8 士0 0 4 0 3 0 3 3 6 2 士0 0 5 1 8 a n d o 2 4 2 9 士0 0 4 6 7 s e v e r a l l y n o 7a n dn o 8w a sm a x i m u m p o 0 5 4w e a xc o n t e n t so fa l lt h ew h e a tc u l t i v a r sw e r ed e c l i n e da n d x y l a n a s e sa c t i v i t i e so fa l lt h ew h e a tc u l t i v a r sw e r er a i s e d 5t h eo p t i m a ld e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n so fx y l a n a s ea c t i v i t i e sw e r ea s 3 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 f o l l o w s 3m ld n s r e a c tt i m el5 m i n a n dw i t h i n3 5 m i nt h er e a c t i o n p r o d u c tw a ss t a b l e p o 0 5 6i nt h ew h e a t sr e s e a r c h e d t h ex y l a n a s ea c t i v i t i e sw e r eb e t w e e n 6 5 0 0 8 5 0 0i u m l a n d1 0 0 0 0 11 5 0 0i u m la f t e rm a l t i n g 儼 o 0 5 7i nw h e a t s t h ec o n t e n t so fw a t e re x t r a c t a b l ea r a b i n o x y l a n sa n d a l k a l i n ee x t r a c t a b l ea r a b i n o x y l a ns h o w e ds i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o n 伊 0 01 a n dx y l a n a s ea c t i v i t i e sa n dt h ec o n t e n to fa r a b i n o x y l a n sw a s n e g a t i v ec o r r e l a t i o n p 0 0 5 h o w e v e r i nw h e a tm a l t s t h ec o n t e n t so f w a t e re x t r a c t a b l e a r a b i n o x y l a n sa n da l k a l i n e e x t r a c t a b l e a r a b i n o x y l a n s h o w e dn e g a t i v ec o r r e l a t i o n p 0 0 5 s od i dx y l a n a s ea c t i v i t i e sa n dt h e c o n t e n to f w a t e re x t r a c t a b l ea r a b i n o x y l a n s p 0 0 5 a n dx y l a n a s ea c t i v i t i e s a n dt h ec o n t e n to fa l k a l i n ee x t r a c t a b l ea r a b i n o x y l a n ss h o w e ds i g n i f i c a n t p o s i t i v ec o r r e l a t i o n p 3 0 k d 可由植物 真菌和細菌產(chǎn)生 通常只具有木 聚糖酶活性 g 1 1 家族木聚糖酶分子量較小 2 0 3 0 k d 可由真菌和細 菌產(chǎn)生 具有木聚糖酶和纖維素酶雙重活性 應用范圍較廣 b e a u g r a n d 2 0 0 6 1 6 3 作用機理 木聚糖酶是一組可將底物木聚糖降解成低聚糖和木糖的復合酶系 因此通常也被稱為木聚糖降解酶系統(tǒng) 木聚糖降解酶系統(tǒng)中作用于主鏈 的酶包括內(nèi)切p 1 4 d 一木聚糖酶 e n d o 1 3 1 4 d x y l a n a s e e c3 2 1 8 內(nèi)切p 1 3 一d 木聚糖酶 e n d o p 一1 3 一x y l a n a s e c h e n 1 9 6 8 a r a k i 1 9 9 9 e c3 2 1 3 2 內(nèi)切c 1 3 木聚糖酶 外切木聚糖酶 e x t r a x y l a n a s e 外切b 木糖苷酶 e x t r a p x y l o s i d a s e e c3 2 1 3 7 等 作用是參與降解 木聚糖主鏈骨架 產(chǎn)生無取代基的和含有支鏈或酯化的寡糖 p e t i t b e n v e g e n l9 9 8 山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 f l g l r e r p c u i h吣 噸 ct l 旺l 5 卜oo 口oo5 臼 x y 硼e 1 4 x y 埠1 4 x y 平t 一4 x y 平l 4 x y 埠t 一4 x r 埠1 4 x 坤l z x y 單l 4 x 忡l 4 殉坤l 4 x y p l 4 x r l 4 x y 埠l 2 2 l 臼l 一 t i 缸 g k a 圖2 木聚稽酶系水解不恿圖 f i g u r e2d e g r a d a t i o no f x y l a nb yx y l a n o l y t i cs y s t e m 注 x y l 代表木糖基 m c g i c a 代表甲基葡萄糖醛酸基 a r a f 代表阿拉伯糖基 a c 代表乙?；?1 1 代表1 3 1 4 d 木聚糖酶 e n d o p i 4 d x y l a n a s e e c3 2 1 8 作用位點 代表外切木聚糖酶 c x t r a x y l 鋤a s c 或外切p 木糖苷酶 e x t r a p x y l o s i d a s c e c 3 2 1 3 7 1 f f y l l 虢o 代表a l 呋喃阿 拉伯糖苷酶 e c3 2 1 5 5 或a d 葡萄糖醛酸酶 e c3 2 1 1 3 9 作用位點 代表乙酰木聚糖酯酶 e c3 2 1 7 2 阿魏酸酯酶或香豆酸酯酶作用位點 張勤良 2 0 0 5 內(nèi)切b 1 4 d 木聚糖酶催化p 1 4 木糖苷鍵的水解 從木聚糖的主鏈 內(nèi)部作用于木糖苷鍵 將大分子的木聚糖降解成寡聚木糖 木二糖及少 量的木糖 能夠降低水溶性阿拉伯木聚糖的分子量 從而降低粘度 削 弱凝膠化作用 同時賦予w u a x 可溶性 王妮婭 2 0 0 8 周素梅 2 0 0 9 外切p 木糖苷酶 e x t r a 1 3 x y l a n x y l o h y d r o l a s e e c 3 2 1 3 7 該酶通 過水解低聚木糖的末端來催化釋放木糖殘基 n a k a m u r a 1 9 9 4 s c h o f i e l d 1 9 9 3 d a h l b e r g 1 9 9 3 3 l 4 夕 切木聚糖酶 作用于木聚糖和木寡糖的 非還原端 產(chǎn)物為木糖 a l 呋哺型阿拉伯糖苷酶 a 葡萄糖醛酸苷酶 乙酰木聚糖酯酶及能降解木聚糖上阿拉伯糖側鏈殘基與酚酸 如阿魏酸 或香豆酸 形成的酯鍵酚酸酯酶等 石軍 2 0 0 2 1 6 4 酶學性質 1 6 4 1 金屬離子 金屬離子對不同來源的木聚糖酶酶活性的影響各不相同 g o u k a 1 9 9 6 不同離子之間的相互作用對木聚糖酶的活性也有影響 研究表 明 不同水平梯度的離子組合對木聚糖酶活性有顯著的影響 離子能夠通過改變酶的構象影響木聚糖酶的穩(wěn)定性 一般情況下 2 l 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 a g 離子濃度lm m o l l 抑制酶活達1 0 0 h 9 2 離子濃度lm m o l l 抑制酶活達7 0 3 c u 2 離子濃度2 0 0m g m l 抑制酶活達2 5 4 2 等離子抑制木聚糖酶的活性 m 9 2 離子濃度2 0 0m g m l 提高酶活達 6 m n 2 離子濃度1m m o l l 提高酶活達2 4 等離子則能提高木 聚糖酶的活性 聶國興 2 0 0 4 i r e n a 2 0 0 6 p e t e r 2 0 0 3 1 6 4 2 溫度 加熱條件下 酶分子運動能力加強 非共價鍵斷裂 酶蛋白失活 溫度越高 熱作用時間越長 失活越嚴重 水能顯著促進蛋白質變性 水合作用導致蛋白質腫脹 提高了多肽鏈的移動性和柔性 使酶蛋白表 現(xiàn)出比干熱條件下更大的不穩(wěn)定性 木聚糖酶分子中糖的含量顯著影響其熱穩(wěn)定性 糖含量高的酶蛋白 熱穩(wěn)定性較高 微生物木聚糖酶的糖基化現(xiàn)象十分普遍 通常認為糖基 化可以維持酶蛋白的穩(wěn)定性 提高其抵御極端環(huán)境的能力 真菌木聚糖 酶和細菌木聚糖酶的最適溫度一般均在4 0 7 5 之間 通常細菌木聚 糖酶比真菌木聚糖酶具有較高的熱穩(wěn)定 純化后木聚糖酶液中含有雜蛋白較少 提高了酶分子與底物的結合 幾率 產(chǎn)生較高的酶活力 酶的熱穩(wěn)定性提高 1 6 4 3p h p h 值對木聚糖酶穩(wěn)定性有顯著影響 木聚糖酶的p h 值范圍為 3 0 1 0 0 最適p h 值4 0 7 0 真菌木聚糖酶的最適p h 值較低于細菌木 聚糖酶 與未純化木聚糖酶相比 純化后木聚糖酶最適p h 值下降 且 在不同p h 值下均具有較高的酶活性 明紅 2 0 0 7 p h 值影響酶蛋白活性部位中質子移變基團的離子化狀態(tài) 而質子 移變基團可以保持酶活性部位的正確構象并參與酶與底物的結合 底物 轉變成產(chǎn)物等過程 在較高或較低p h 值條件下 p h 值直接影響木聚糖 酶活性部位的正確構象 導致酶與底物結合較差 影響酶對底物的水解 效率 1 6 4 4 底物特異性 不同來源的木聚糖酶的分子組成和結構不盡相同 決定了其底物特 異性也不同 進而表現(xiàn)出對不同來源的木聚糖的活性差異 但和p h 穩(wěn) 山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 l 一 表4 不同來源木聚糖酶酶學性質 t a b l e4c h a r a c t e r i s t i c so fx y l a n a s ef r o md i f f e r e n tr e s o u r c e 微生物來源 木聚糖生長最佳條件 酶活力最適條件 酶 p h溫度 p h 溫度 耐熱細菌 嗜酸耐熱菌 b a c i l l u sa c i d o c a l d a r i u s 地農(nóng)芽孢桿菌 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa 9 9 芽孢桿菌 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u st 6 芽孢桿菌 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u sn o 2 1 芽孢桿菌 b a c i l l u st h e r m o a l k a l o p h i l u s 丙酮丁醇梭桿菌 c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m 梭桿菌 c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u mh x 1 梭桿菌 c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u mf 9 梭桿菌 c l o s t r i d i u mt h e r m o l a c t i c u mt c 21 d i c o o g l o m u st h e r m o p h i l u mb 1 m i c r o t e t r a s p o r a f l e x u o s asi ix 耐熟芽孢桿菌 t h e r m o p h i l i cb a c i l l u ss t r a i n x e 耐熱芽孢桿菌 t h e r m o p h i l i cb a c i l l u ss p 耐熱菌 t h e r m o p h i l i cb a c t e r i ai t i2 8 3 1 1 i 2 3 6 t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u ms p j w s l y s 4 8 5 棲熱胞菌 t h e r m a t o g as p f j s s 2 b 1 棲熱胞菌 t h e r m a t o g a m a r i t i m am s b8 高溫單胞菌 t h e r m o m o n o s p o r ac u r v a t a 高溫單胞菌 t h e r m o m o n o s p o r ac h r o m o g e n a m t 8 1 4 高溫單胞菌 t h e r m o m o n o s p o r a f u s c ab d 2 1 3 5 4 06 54 08 0 7 o6 07 05 0 1 67 0 v 7 3 6 09 06 5 a7 0 5 57 06 0 9 06 06 o 一7 06 0 7 0 a6 03 75 05 0 b3 75 5 6 0 6 0 d6 o 一7 o6 06 57 5 a6 o 一7 o6 56 57 5 6 o 一7 06 56 5 8 0 7 06 87 08 0 6 08 09 05 2 7 05 56 07 5 7 o 7 5 6 o 6 8 7 o 7 0 6 o 7 0 6 o 7 0 8 o 6 5 6 5 7 0 6 5 3 o 6 2 5 3 6 2 5 4 6 o 7 o 7 8 7 2 6 8 5 o 8 o 7 8 8 0 1 0 5 一l l o 9 2 1 0 5 8 0 9 0 l o o 7 5 7 5 7 5 7 5 8 05 0 6 o 8 06 5 高溫甲胞菌 t h e r m o m o n o s p o r a f u s c 口y x 8 0 5 06 0 8 0 7 0 印舳 弱 卯 a a b l 2 l 2 3 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 定性及熱穩(wěn)定性不同 木聚糖酶純化前后底物特異性基本一致 對不同 來源的木聚糖按親和力大小排列為 玉米芯木聚糖 蔗渣木聚糖 樺木 木聚糖 燕麥木聚糖 k u l k a m i 1 9 9 9 1 6 5 純化 2 4 山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 木聚糖酶的分離與純化 一般采用離子交換 凝膠滲透色譜 等電 點聚焦和區(qū)帶電泳等蛋白質純化技術 目前 研究者在研究基于雙水相 純化技術 a q u e o u st w o p h a s es y s t e m a t p s 的衍生技術 t e o t i a 2 0 0 1 三相分離體系 t h r e e p h a s ep a r t i t i o n i n g t p p a p a m a 2 0 0 2 r o y 2 0 0 4 和擴張床吸附技術 e x p a n d e db e da d s o r p t i o n e b d s a n t o s 2 0 0 2 色譜法純化木聚糖酶需經(jīng)過3 個步驟 粗酶預處理 粗酶沉淀 色 譜分離 粗酶沉淀一般采用硫酸銨分級沉淀 超濾 透析濃縮或乙醇沉 淀 初步去除大部分雜質與色素 再通過離子交換 凝膠過濾 疏水色 譜 親和色譜或色譜聚焦等色譜技術進行分離 色譜純化技術多用離子 交換或凝膠過濾 色譜法純化步驟多 回收率低 研究者嘗試通過專一 吸附的親和純化技術來取代多步純化的色譜技術 根據(jù)多肽融合標簽重 組蛋白純化技術 通過純化含糖類結合域 c b m 標簽的重組蛋白 可 一步將木聚糖酶純化到單一組分 c b m 存在于許多糖苷水解酶如木聚 糖酶中 是結構和功能上獨立的1 個非催化功能區(qū)域 多數(shù)聚糖水解酶 常包含1 個催化區(qū)域和多個c b m 研究表明 不同c b m 有著不同的配 基專一性及結合位點 可結合到甘露聚糖 葡甘露聚糖 木聚糖 葡聚 糖 纖維素等糖類上 c b m s 與配基結合的選擇性 為親和純化提供了 便利條件 雙水相系統(tǒng) a q u e o u s t w o p h a s es y s t e m a t p s 純化法是通 過混合2 種水溶性高聚物溶液或者一種高聚物溶液與一種鹽溶液形成 當2 種溶液有疏水性差異時形成分開的兩相 在現(xiàn)有研究中 a t p s 中 最常用的2 種系統(tǒng)為聚乙二醇 葡聚糖體系和聚乙二醇 磷酸鉀體系 這2 種系統(tǒng)由于無毒被廣泛用于各種物質的分離與研究中 三相分離體系 t h r e e p h a s ep a r t i t i o n i n g t p p 純化法與a t p s 相比 在上下相之間有 一界面相 1 6 6 測定 木聚糖酶活的測定大多基于部分可溶的木聚糖底物還原糖的釋放 t a ne ta 1 1 9 8 5 另外還有一些方法是基于不溶性阿拉伯木聚糖渾濁 度的降低 n u m m i 1 9 8 5 b a i l e y 1 9 8 9 或者是從染色木聚糖底物可溶性 染色碎片的釋放 b i e l y 1 9 8 5 測定木聚糖酶活性的方法通常有r b b x y l a n r e m a z o lb r i l l i a n t 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 b l u e x y l a n 法 放射瓊脂擴散法 還原糖法等 r b b x y l a n 法是依據(jù)r b b x y l a n 中釋放出的染色碎片來測定 此法 可以排除其它相關酶的干擾 測定結果準確度較高 并且還可以通過判 斷是否出現(xiàn)透明圈的方法 應用于產(chǎn)木聚糖酶微生物的篩選中 但 r b b x y l a n 法的費用昂貴 多用于基因克隆工作 以剛果紅為展開劑的瓊脂擴散法的靈敏度很高 但由于受底物濃 度 反應溫度 反應時間 瓊脂盤的p h 值以及染色方式等諸多因素的 影響 目前廣泛應用于工廠抽查檢測 還原糖法是依據(jù)酶反應后釋放出的還原糖量測定 代表性的有 s o m o g y i n e l s o n 法 d n s 法等 s o m o g y i n e l s o n 法測定值較d n s 法測 定結果要低 而且試劑有一定的毒性 d n s 法應用比較廣泛 反應顏色 穩(wěn)定性好 操作簡單 可以用標準還原糖制作標準曲線 測定結果精確 1 7 立題背景及研究的目的意義 小麥麥芽是良好的啤酒原料 含有豐富的淀粉酶 糖化力大大高于 大麥芽 無皮殼 小麥淀粉易糊化 糖化浸出率高 糖蛋白含量高 釀 出啤酒泡沫優(yōu) 單寧含量低 有利于啤酒的膠體和風味穩(wěn)定性 可溶性 氮多 有利于快速發(fā)酵 添加小麥芽釀制的啤酒營養(yǎng)豐富 熱量高 富 含各種礦物質 維生素 有機酸等營養(yǎng)成分 口味獨特 使用輔料多 成本低 釀出的啤酒風味獨特 符合啤酒的發(fā)展潮流 應用前景廣闊 研究篩選出適宜釀造的小麥品種 作為延長小麥產(chǎn)業(yè)鏈條提高小麥的附 加值的一種方式可以擴大小麥出路 帶動小麥產(chǎn)業(yè)以加工為導向發(fā)展 但在啤酒生產(chǎn)過程中 大量阿拉伯木聚糖在釀造過程中存在直到最 終的啤酒產(chǎn)品 c o o t e 1 9 7 6 如果不能充分降解會造成麥汁浸出率低 黏度高 v i n 2 0 0 4 過濾困難 s a d o s k y 2 0 0 2 甚至造成啤酒渾濁等 問題 因此 研究阿拉伯木聚糖含量與木聚糖降解酶系的酶活成為當前 小麥品質及小麥育種等研究工作中的重要項目之一 1 8 主要研究內(nèi)容與目標 本項目以適合制麥芽小麥品種篩選為主線 通過研究小麥及小麥芽 中阿拉伯木聚糖含量及木聚糖酶酶活 為選取適合制麥芽小麥品種的篩 山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 選提供基礎 具體研究內(nèi)容如下 1 8 1 間苯三酚反應最適條件的確定 1 8 2 小麥及相應小麥芽中阿拉伯木聚糖含量的測定 1 8 3 木聚糖酶活測定d n s 反應最適條件的確定 1 8 4 小麥及相應小麥芽中木聚糖酶酶活的測定 1 8 5 木聚糖酶酶學性質的研究 1 8 6 制麥工藝的影響 2 材料與方法 2 1 試驗材料 1 1 個小麥品種 分別標號為l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 號 2 2 主要藥品 名稱生產(chǎn)單位 氫氧化鈉 鹽酸 葡萄糖 無水乙醇 間苯三酚 冰醋酸 木糖 木聚糖 檸檬酸 磷酸氫二鈉 酒石酸鉀鈉 二硝基水楊酸 苯酚 亞硫酸鈉 天津市凱通化學試劑有限公司 淄博化學試劑場有限公司 f l u k a 股份有限公司 天津市百世化工有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 f i u k a 股份有限公司 s i g m a 股份有限公司 天津市凱通化學試劑有限公司 天津市凱通化學試劑有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司 天津市大茂化學試劑廠 天津市津北精細化工有限公司 2 7 純級 分析純 分析純 h p l c 分析純 分析純 分析純 h p l c 分析純 分析純 分析純 分析純 化學純 分析純 分析純 小麥及j 麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 2 3 主要儀器 名稱 產(chǎn)地 u v 2 4 5 0 型白外掃描儀日本島津公司 1 0 1 a 電熱鼓風干燥箱黃驊市卸甲綜合電器廠 a l 2 0 4 電子天平梅特勒 托利多儀器有限公司 電子調(diào)溫萬用電爐龍1 2 1 市文太電爐制造有限公司 h h 4 數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市雙捷電子儀器設備廠 振蕩器海門市其林貝爾儀器制造有限公司 往復式搖床江蘇金壇市中大儀器廠 u v 2 1 0 0 型分光光度計尤尼柯 上海 儀器有限公司 8 0 2 型離心沉淀機江蘇金壇市中大儀器廠 2 4 試劑 2 4 1 間苯三酚 冰醋酸反應液 試劑用量 m l 冰醋酸 1 1 0 濃鹽酸 2 2 5 2 0 間苯三酚 乙醇 5 1 7 5 葡萄糖 l 2 4 2d n s 反應液 1 取酒石酸鉀鈉1 8 2 9 溶于5 0 0 m l 水中 加熱 2 在熱溶液中依次加入3 5 二硝基水楊酸6 3 9 2 m 的n a o h2 6 2m l 苯酚5m l 亞硫酸鈉5g 攪拌使它們?nèi)芙?3 冷卻后定容至1 0 0 0m l 貯藏于棕色瓶中靜置一周后使用 2 4 3p i 1 4 8 的0 0 5 m 檸檬酸緩沖液 1 配制0 2 mn a 2 h p 0 4 溶液和o 1 m 檸檬酸溶液 2 取配好的n a 2 h p 0 4 溶液4 9 3m l 加入檸檬酸溶液5 0 7m l 混合均 勻 配成1 0 0 0m l 的p h 4 8 的檸檬酸緩沖液 山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 2 4 51 0 0 0 0 木聚糖底物配制 1 準確稱取1 0 0 0 0 9 木聚糖 加入8 0m l 預熱至6 0 c 的檸檬酸緩沖液 2 加熱至沸點 同時磁力攪拌直至溶解 3 室溫放置過夜 用檸檬酸緩沖液定容至1 0 0m l 2 5 試驗方法 2 5 1 制麥芽 標準制麥法工藝流程 圖3 糠灰 雜質 鐵塊小粒麥 原料小麥一粗選上精選r 分級上小麥一稱量一儲藏一浸麥一 雜谷類 熱空氣 i 濕小麥一發(fā)芽一綠麥芽一千燥一除根一干麥芽一儲藏一成品麥芽 ff 飽和濕空氣石灰 空氣 圖3 制麥工藝流程 t a b l e3m a l t i n gp r o c e s s 2 5 2 間苯三酚標準工作曲線的制作 1 準確稱取1 0 m g 木糖溶于1 0 0m l 水中 配制濃度為6 6 6m m 的木糖 溶液 2 分別取出o o o o 2 5 0 5 0 o 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0m l 配制的木糖 溶液 置于1 5m l 離心管中 加入雙蒸水至2m l 3 加入間苯三酚 冰醋酸反應液1 0m l 后 沸水浴反應2 0 m i n 4 冰浴中終止反應 5 分光光度計測定各濃度木糖在5 5 3 n m 和5 1 0 n m 的吸光度值 6 計算差值 輸入已知的木糖濃度值 建立標準曲線 圖5 2 9 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 魁 米 督 0 8 0 0 o 6 0 0 o 4 0 0 0 2 0 0 o 0 0 0 4 0 04 5 0 0 1 8 0 0 1 5 0 0 1 2 0 瑙 裝o 0 9 0 督 0 0 6 0 0 0 3 0 0 0 0 0 s 5 5 0 波長a m 圖44 0 0 6 0 0 h m 吸光度掃描 f i g u r e4s c a no f a b s o r b a n c ef r o m4 0 0 r i mt o6 0 0 r i m 0o 0 20 0 4o 0 6 0 0 80 10 1 20 1 40 1 6 木糖濃度 m g 圖5 術糖 間苯三酚反應標準工作曲線 f i g u r e5s t a n d a r dc u r v e so fx y l o s e p h l o r o g l u c i n o l 廣 一 山東農(nóng)業(yè)大學碩上學位論文 2 5 3 木聚糖的提取 1 樣品置于1 3 0 1 5 h 鈍化各種酶 2 堿溶性木聚糖提取 1 在2 0 0 m g 樣品中加入5m l1 n a o h 在6 0 下超聲波抽提3 0 r a i n 2 3 0 0 0 9 離一t l 1 5 m i n 取上清 3 沉淀再加入5m l5 n a o h 在2 0 抽提l h 4 3 0 0 0g 離心1 5 m i n 合并上清液 5 取0 2 5m l 上清液加入4 倍體積無水乙醇 用鹽酸調(diào)節(jié)p h 值至中性 沉淀多糖 6 離心后收集沉淀 3 水溶性木聚糖的提取 1 在2 0 0m g 樣品中加入1 0m l 水 混合均勻 2 置于往復式搖床上震蕩3 0 m i n 3 3 0 0 0g 離心1 5 m i n 留取上清液測定 2 5 4 木聚糖樣品測定 1 堿溶性木聚糖測定時將沉淀用2m l 蒸餾水溶解 水溶性木聚糖測定 時取上清液o 5m l 用水補至2m l 2 上述溶液中加入1 0m l 間苯三酚 冰醋酸反應液 沸水浴反應2 0 m i n 3 冰浴冷卻后立即測定5 5 3 n m 和5 1 0 n m 的吸光度值 4 根據(jù)標準工作曲線查出木糖含量 木聚糖含量 木糖含量 o 8 8 其中o 8 8 為木聚糖與木糖的轉化系數(shù) 2 5 5 木糖與i n s 反應標準工作曲線 1 稱取0 1 5g 木糖 用檸檬酸緩沖液配制成1 0 0m l 標準溶液 2 稱取1m l 標準溶液 分別加入l 2 3 4 m l 蒸餾水配成一系列濃 度不同的標準溶液 3 在試驗管和空白管中各加入1 8m l 底物 5 0 水浴中預熱5 m i n 4 加入各濃度木糖標準溶液0 2m l 5 0 c 精確反應5 r a i n 5 冰浴終止反應 立即加入3m ld n s 反應液 沸水浴反應1 5 m i n 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 6 冰浴終止反應 冷卻后加入5m l 水 7 測定5 4 0 n m 吸光度值 制作標準曲線 圖6 2 5 6 木聚糖降解酶系粗酶液的提取 1 稱樣品0 5 9 置于試管中 加入2 5m l 檸檬酸緩沖液 室溫下浸提2 4 h 2 過濾 用檸檬酸緩沖液定容至5 0m l 作為待測粗酶液 2 5 7 木聚糖酶酶活測定 1 在試驗管和空白管中各加入1 8m l 底物 5 0 c 水浴中預熱5 m i n 2 在試驗管中加2 0 0g l 粗酶提取液 在空白管中加2 0 0 斗l 檸檬酸緩沖 液 搖勻后 5 0 精確反應5 m i n 3 冰浴終止反應 立即加入3m ld n s 反應液 沸水浴反應1 5 m i n 4 冰浴終止反應 冷卻后加入5m l 水 測定5 4 0 n m 吸光度值 粗酶液對照 用檸檬酸緩沖液代替木聚糖底物 測定粗酶液中的游離 木糖 0 8 0 0 0 7 0 0 0 6 0 0 0 5 0 0 蜊 裝0 4 0 0 整 0 3 0 0 0 2 0 0 o 1 0 0 0 0 0 0 00 0 5o 1 0 1 50 2 木糖濃度c r a g 2 5 8 酶活計算 圖6d n s 與木糖反應標準工作曲線 f i g u r e6s t a n d a r dc u r v eo fd n s x y l o s e 3 2 廠 一 山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 酶促反應的吸光度減去粗酶液對照測得的吸光度的平均值 吸光度差值 根據(jù)標準工作曲線查出木糖含量 酶活 i u m l 木糖含量 n m o f m l 1 6 6 7 i u n k m 反應時間 s 酶活單位i u 定義為每分鐘催化產(chǎn)生一個微摩爾產(chǎn)物所需酶量 2 5 9 酶學性質 選取7 種小麥品種進行酶學性質的研究 分別為1 2 3 4 7 9 1 1 號品種 2 5 9 1 酶反應的最適溫度 底物濃度 1 0 0 0 0 酶與底物的比例 1 9 p h 5 0 反應溫度 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 反應時間5 m i n 2 5 9 2 酶反應的最適p h 值 底物濃度 酶與底物的比例 p h 反應溫度 反應時間 2 5 9 3 酶促反應時間 底物濃度 酶與底物的比例 p h 反應溫度 反應時間 2 5 9 4 酶與底物的比例 e s 底物濃度 酶與底物的比例 p h 1 0 0 0 0 1 9 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 5 0 5 m i n 1 0 0 0 0 1 9 5 0 5 0 l 3 5 7 9 1 l m i n 1 0 0 0 0 1 19 1 d 3 1 7 1 4 1 3 5 0 小麥及其麥芽阿拉伯木聚糖與木聚糖酶的研究 反應溫度 5 0 反應時間 5 m i n 2 5 9 5 底物濃度 對底物進行稀釋 分別吸取濃度1 0 0 0 0 的木聚糖溶液1 8 1 6 1 4 1 2 1 o 0 8m l 用檸檬酸 磷酸氫二鈉緩沖液補齊至1 8m l 酶與底物的比例分別是1 9 溫度為5 04 c 反應時間分別為5 m i n 測 定不同底物濃度下酶的活力 2 5 1 0 浸麥度對木聚糖含量和木聚糖酶活的影響 選取1 號和2 號品種進行常規(guī)制麥 1 號 1 和2 號 1 浸麥度為3 8 1 號 2 和2 號 2 浸麥度為4 5 2 5 1 1 制麥過程中木聚糖酶酶活變化 選取9 號品種在制麥過程中測定每次升溫時的木聚糖酶酶活 2 6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 使用e x c e l 軟件處理數(shù)據(jù) 作圖 使用m i n i t a b l 5 分析數(shù)據(jù)差異性 3 結果與分析 3 1 間苯三酚木糖反應掃描圖譜標準工作曲線 圖4 顯示木糖與間苯三酚 冰醋酸反應液反應產(chǎn)物在5 5 3 n m 處又最 大吸收峰 圖5 顯示間苯三酚工作曲線方程為y 2 0 7 6 8 x 相關系數(shù)r 為0 9 9 9 6 r 大于o 9 9 表明在此范圍內(nèi)木糖含量與吸光度值成正比 3 2 間苯三酚反應條件 3 2 1 間苯三酚反應液用量 一定條件下間苯三酚與木聚糖反應隨著反應劑用量的增加 戊聚糖 測定值提高 p 0 0 5 反應液用量在1 0m l 時測得的木聚糖含量最大 之后再增加反應液用量 測定值降低 p 0 0 5 因此1 0m l 反應液用 量為最適用量 山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 更 刪 缸 寨 張 2 3 0 0 0 2 1 0 0 0 1 9 0 0 0 1 7 0 0 0 i 5 0 0 0 1 3 0 0 0 1 1 0 0 0 0 9 0 0 0 0 7 0 0 0 0 5 0 0 0 l 67891 0l l1 21 31 4 反應液用量 m l 圖7 間苯三酚反應液用量對木聚糖測定的影響 f i g u r e7i m p a c to nd e t e r m i n a t i o no f a xm a d eb ya m o u n to f p h i o r o g l u c i n o i 1 差異性由m i n i t a b l 5 分析 小寫字母表示 置信水平9 5 p 0 0 5 不同品種間存在相同的 字母 表示差異性不顯著 沒有相同字母表示存在顯著性差異 3 2 2 間苯三酚反應時間 圖8 顯示反應前2 0 m i n 木聚糖測定值隨時間增大 反應時間在2 0 m i n 以后測得的木聚糖含量減小 尸 o 0 5 因此2 0 m i n 為最佳測定時間 3 2 3 反應后放置時間 圖9 顯示反應完成后 測定的木聚糖含量降低 但3 0 m i n 內(nèi)的測定 結果沒有顯著差異性 j p 0 0 5 基本穩(wěn)定 3 0 m i n 后差異顯著 p 0 0 5 分別為1 2 1 9 0 士0 0 4 7 6 1 2 2 7 1 士0 0 3 3 6 和 1 2 0 4 8 士0 0 4 1 5 最少的是8 9 1 0 號三個品種 尸 0 0 5 分別為 0 5 8 1 1 士0 0 1 2 7 0 6 6 0 5 1 0 0 6 2 0 和0 6 6 0 3 士0 0 3 0 1 而在麥芽中 含 量最大的是4 號和7 號品種 尸 0 0 5 分別為2 4 0 6 8 士0 2 2 4 2 和 2 7 0 6 2 土0 2 4 8 1 最少的是9 號品種和1 0 號品種 p o 0 5 含量為 0 9 7 4 6 士0 0 0 8 5 和o 7 7 9 7 土0 0 5 0 8 由以上數(shù)據(jù)分析大部分小麥發(fā)芽后 堿溶性阿拉伯木聚糖含量升高 其中4 7 8 號品種含量增加最多 p 0 0 5 分別為1 6 9 1 6 1 6 7 3 2 和1 6 2 3 3 只有3 號品種略微減 少 為0 0 1 5 5 3 3 2 水溶性木聚糖含量 表6 水溶性阿拉伯木聚糖 w e a x 含量 f i g u r e6c o n t e n to fw a t e re x t r a c t a b l ea r a b i n o x y l a n s 品種小麥中水溶性阿拉伯木聚糖麥芽中水溶性阿拉伯木聚糖麥芽與小麥中含量差 含量 0 7 9 7 2 士o 1 4 7 9 o 9 9 7 2 士o 0 0 4 2 o 9 2 6 5 士o 15 2 3 0 5 4 2 3 士0 0 6 4 5 o 8 8 5 帕 o 0 5 9 9 差異性1 a a a b a 含量 差異性1含量 差異性1 0 3 6 1 6 士0 0 3 4 2 0 7 6 5 5 士o 0 2 7 2 0 5 31 2 士o 0 4 8 3 o 3 8 1 4 士 0 0 2 5 4 0 8 6 7 2 士0 0 1 7 6 0 7 9 4 8 0 0 6 5 6 a0 6 6 3 8 i 0 0 3 8 2 0 9 4 6 0 a 0 0 4 0 3 0 3 8 2 8 0 0 4 0 3 0 5 9 9 8 t 0 0 3 9 7 a b c d o 3 3 6 2 士o 0 5 1 8 o 2 4 2 9 士o 0 4 6 7 0 5 7 0 6 士o 0 1 9 6 0 4 3 5 7 o 2 3 1 6 0 3 9 5 2 o 1 6 0 9 o 0 1 7 8 o 1 3 l o 0 6 0 9 8 o 1 3 9 8 0 0 2 9 1 1 0 0 4 6 8 1 士0 0 1 2 7b e0 4 3 5 0 a 0 0 3 5 3a c0 0 3 3 1b 1 差異性由m i n i t a b l 5 分析 小寫字母表爪小麥中的水溶性阿拉伯小聚糖差異 大寫字母表 i 麥 3 8 刪 比 如 f n 甜 n a 髓 a 叻 e 燈