（生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)論文）膜電位對(duì)trkb受體活性的調(diào)節(jié).pdfVIP

：海人學(xué)碩l ：學(xué)位論文 原創(chuàng)性聲明 本人聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研 究工作。除了文中恃別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不 包含其他人已發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。參與同一工作的其 他同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的 說(shuō)明并表示了謝意。 期：加鼉7 子 本論文使用授權(quán)說(shuō)明 本人完全了解上海大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī) 定，即：學(xué)校有權(quán)保留論文及送交論文復(fù)印件，允許論文被 查閱和借閱；學(xué)校可以公布論文的全部或部分內(nèi)容。 ( 保密的論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定) 簽名：濫導(dǎo)師簽名：名：煎日期：幽整：2 鼉 f ：海人學(xué)碩i j 學(xué)位論文 摘要 t r k b ( t y r o s i n er e c e p t o rk i n a s eb ) 受體是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ，b d n f ) 的主要功能受體，也是一種受體酪氨酸激酶。 b d n f 與細(xì)胞表面的t r k b 受體結(jié)合激活t r k b 受體胞內(nèi)段的酪氨酸激酶，并使 t r k b 受體胞內(nèi)幾個(gè)特定的酪氨酸殘基發(fā)生自磷酸化而激活下游信號(hào)通路。 b d n f 廠r r k b 參與了活性依賴的突觸可塑性調(diào)節(jié)，即神經(jīng)元活性影響b d n f 對(duì)神 經(jīng)元的效應(yīng)。神經(jīng)元的活性可以增強(qiáng)b d n f 在活化神經(jīng)元或突觸中的合成和分 泌，也可以增強(qiáng)t r k b 受體在活化的神經(jīng)元或突觸中的上膜表達(dá)、b d n f 誘導(dǎo)的 內(nèi)吞、轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸和翻譯等過(guò)程，這些過(guò)程依賴于c a 2 + 信號(hào)通路。但關(guān)于膜電 位對(duì)t 曲受體活性的調(diào)節(jié)及其b d n f 對(duì)神經(jīng)元活性依賴性調(diào)節(jié)的機(jī)制還有很多 未知。本論文就膜電位對(duì)t r k b 受體磷酸化水平調(diào)節(jié)的機(jī)制做了詳細(xì)的研究。 ( 1 ) 免疫印記( w e s t e r nb l o t ) 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠海馬腦片中b d n f 依賴的t r k b 受 體磷酸化( p t r k b ) 水平在高 k + 】細(xì)胞外液處理時(shí)高于正常 k q 細(xì)胞外液處理時(shí)。 高k + 處理可以增加p t r k b t r k b 的比值。 ( 2 ) 將體外轉(zhuǎn)錄的t r k b 受體m r n a 在非洲爪蟾卵母細(xì)胞( 沒(méi)有神經(jīng)元的電 壓門(mén)控通道的表達(dá)) 中表達(dá)。通過(guò)w e s t e r nb l o t 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高【k + 】細(xì)胞外液處理組 p t r k b t r k b 值是j 下?！緆 + 】細(xì)胞外液處理組的2 5 74 - 5 6 。 ( 3 ) 為了排除胞內(nèi)c a 2 + 信號(hào)對(duì)t r k b 受體磷酸化水平的影響，用b a p t a 或 者b a p t a a m 阻斷胞內(nèi)c a 2 + 信號(hào)。w e s t e r nb l o t 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高 k + 】依然可以誘導(dǎo) t r k b 受體磷酸化水平的升高，與沒(méi)有阻斷胞內(nèi)c a 2 + 信號(hào)時(shí)一致。 ( 4 ) 這些結(jié)果強(qiáng)烈提示高【k + 】誘導(dǎo)的去極化激活t r k b 受體酪氨酸激酶而升 高其磷酸化水平其機(jī)制可能是由于t r k b 受體自身可以感受膜電位。為了更加直 接說(shuō)明膜電位對(duì)t r k b 受體活性調(diào)節(jié)的機(jī)制，用c u t o p e n 電壓鉗技術(shù)檢測(cè)t r k b 受體是餐具有膜電壓依賴的門(mén)控電流( g a t i n gc u r r e n t ) 。在表達(dá)t r k b 受體的爪 蟾卵母細(xì)胞中記錄到一個(gè)微小的電流，此電流是否為g a t i n gc u r r e n t 還需要更深的 研究，這部分工作f 在進(jìn)行。 關(guān)鍵詞：酪氨酸激酶受體b ，活性依賴，爪蟾卵母細(xì)胞，c u t o p e n 電壓鉗，膜電 位，門(mén)控電流 l ：海人學(xué)碩l ：學(xué)位論文 a b s t r a c t t r k br e c e p t o ri st h ep r i m a r yf u n c t i o n a lr e c e p t o ro fb r a i nd e r i v e dn e u r o t r o p h i c f a c t o r ( b d n f ) t h eb i n d i n go fb d n ft ot h et r k br e c e p t o ri nt h ec e l lm e m b r a n e a c t i v a t e st r k br e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ，a n dc a u s e st h ea u t o p h o s p h o r y l a t i o no fs e v e r a l c o n s e r v e dt y r o s i n e sp r e s e n ti nt h ec y t o p l a s m i cd o m a i n so ft r k br e c e p t o r , w h i c hi n t u r na c t i v a t e sd o w ns t r e a ms i g n a l i n gp a t h w a y s b d n fh a se m e r g e da sak e yr e g u l a t o r o fa c t i v i t y d e p e n d e n ts y n a p t i cp l a s t i c i t y ，n a m e l y ，n e u r o n a la c t i v i t ye n h a n c e sb d n f s i g n a l i n g n e u r o n a la c t i v i t yc a ne n h a n c eb d n fs y n t h e s i sa n d o rs e c r e t i o ni na c t i v e s y n a p s e g r o w i n ge v i d e n c es u g g e s t st h a tn e u r o n a la c t i v i t yf a c i l i t a t e sc e l l - s u r f a c e e x p r e s s i o no ft r k b 、b d n f - i n d u c e dt r k be n d o c y t o s i s 、t r a n s c r i p t i o n 、t r a n s l a t i o na n d t r a n s p o r ta ta c t i v en e u r o n so rs y n a p s e s b u tt h e r ei st o om u c hi g n o r a n c ea b o u tt h e d i r e c tr e g u l a t i o no ft r k ba c t i v a t i o nb ym e m b r a n ep o t e n t i a l ( m p ) a n dt h em e c h a n i s m o fa c t i v i t y d e p e n d e n tr e g u l m i o no fb d n f o u rt h e s i sm a d ead e t a i lr e s e a r c ha b o u tt h e p o t e n t i a lm e c h a n i s mb ye x a m i n i n gt h ee f f e c to fm pc h a n g eo n t r k bp h o s p h o r y l a t i o n ( p t r k b ) ( 1 ) t h ew e s t e r nb l o ti na c u t eh i p p o c a m p a ls l i c er e v e a l e dt h a tt h el e v e lo ft r k b p h o s p h o r y l a t i o nb yb d n fi nh i g h 【k 十】g r o u pw a sm u c hh i g h e r t h a nt h a to fi nn o r m a l 【k + g r o u p r a t i oo fp t r k b t r k bc a nb ei n c r e a s e db yh i g h k + 】 ( 2 ) a f t e re x p r e s s e dt h et r k br e c e p t o ri nt h ex e n o p u so o c y t e s ，w h i c hh a v ef e w e n d o g e n o u si o nc h a n n e l s ，w e s t e r nb l o te x p e r i m e n t sr e v e a l e dt h a tt h ep - t r k b t r k b r a t i ow a si n c r e a s e di nt h ep r e s e n c eo fh i g h 【k + 】e x t r a c e l l u l a rs o l u t i o n ，a b o u t2 5 7 4 - 5 6 o ft h a ti nn o r m a l 【k 十】e x t r a c e l l u l a rs o l u t i o n ( 3 ) i no r d e rt of u r t h e re x c l u d et h ee f f e c tc a 2 + s i g n a lt ot h e l e v e lo ft r k b p h o s p h o r y l a t i o nu s e db a p t a o rb a p t a a mt ob l o c kt h ei n t r a c e l l u l a rc a + s i g n a l w e s t e r nb l o tf o u n dt h a tt h ed e p o l a r i z a t i o ni n d u c e db yt h eh i g h 【k + 】s o l u t i o ns t i l lc a n e n h a n c et h el e v e lo ft r k bp h o s p h o r y l a t i o n t h er e s u l tw a sc o n s t a n tw i t hp r e v i o u s r e s u l t sw i t h o u tb a p t ao rb a p t a a m ( 4 ) t h er e s u l t ss of a ri n d i c a t et h a tt h ei n c r e a s eo ft r k bp h o s p h o r y l a t i o nb yt h e d e p o l a r i z r t i o n i n d u c e db yt h eh i g h 【k + 】s o l u t i o nr e s u l t sf r o mt h em e m b r a n e 一2一 ：海人學(xué)碩i ：學(xué)位論文 d e p o l a r i z a t i o nb yh i g h 【k + 】s o l u t i o nc a nd i r e c t l ye n h a n c et h ea c t i v i t i e s o ft r k b t y r o s i n ek i n a s e f o rt h em e c h a n i s m ，i ti sl i k e l yt h et r k br e c e p t o ri t s e l fs e n s e st h e m e m b r a n ev o l t a g e t of u r t h e rv a l i d a t et h i sm e c h a n i s m ，u s ec u t - o p e no o c y t ev o l t a g e c l a m pt or e c o r dt h eg a t i n gc u r r e n to ft r k br e c e p t o r as m a l lc u r r e n tw a s r e c o r d e db y t h ec u t o p e no o c y t ev o l t a g ec l a m pi nt r k b - i n j e c t e do o c y t e ，b u tw h e t h e rt h ec u r r e n ti s g a t i n gc u r r e n t ，i tn e e d sf u r * h e rr e s e a r c h w ea r ed o i n gt h i sp a r to f w o r k k e y w o r d s ：t y r o s i n ek i n a s er e c e p t o rb ，a c t i v i t y - d e p e n d e n t ，x e n o p u so o c y t e ， c u t o p e no o c y t ev o l t a g ec l a m p ，m e m b r a n ep o t e n t i a l ，g a t i n gc u r r e n t 3 海人學(xué)碩l ：學(xué)位論文 一緒論 1 b d n f t r l 信號(hào)通路及其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用 1 9 8 7 年，l i c h t m a n 提出了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的概念。認(rèn)為在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中， 細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、遷移以及與其他細(xì)胞建立功能性聯(lián)系或在神經(jīng)再生過(guò)程中軸 突的再生長(zhǎng)等，均可受一類(lèi)可溶性化學(xué)物質(zhì)即神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( n e u r o t r o p h i cf a c t o r s ， n t f s ) 的誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)和控制。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類(lèi)對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有營(yíng) 養(yǎng)作用的活性蛋白，這些小分子蛋白質(zhì)具有5 5 一6 5 相同的氨基酸順序，統(tǒng)稱為 神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族，包括神經(jīng)生長(zhǎng)因( n g f ) 、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( b d n f ) 、神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3 ( n t 3 ) 、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4 5 ( n t 4 5 ) 、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子6 ( n t 6 ) 和神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)因子7 ( n t 7 ) 。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合發(fā)揮其生理功 能。n t f s 受體有兩種不同的家族，一種受體是低親和力的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體 ( p 7 5 ) ，另一種受體是高親和力酪氨酸激酶家族( t r k s ) 受體t r k a 、t r k b 、t r k c ， 其中t r k b 受體是b d n f 的主要功能受體( m o u s e 礦c h a oe t a 1 ，2 0 0 3 ) 。在嚙齒類(lèi) 動(dòng)物中，t r k b 受體基因能產(chǎn)生若干不同的轉(zhuǎn)錄物，其中有兩種m r n a 編碼“全長(zhǎng) 或催化形式的t r k b 受體，分子量為1 4 0k d 左右，是介導(dǎo)b d n f s 三要生物學(xué)活性的 受體。其他的轉(zhuǎn)錄物至少可產(chǎn)生t r k b 的兩個(gè)同形物，它們?nèi)笔О麅?nèi)結(jié)構(gòu)域的大 部分，不顯示蛋白酪氨酸激酶活性，是“截短的 t r k b 受體，是一類(lèi)分子量為 7 5 k d 的糖蛋白( d e c h a n tge t a 1 ，1 9 9 4 ) 。全長(zhǎng)t r k b 受體的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有一跨膜 區(qū)、結(jié)合n t 的胞外部分及具有蛋白酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)部分。胞外區(qū)包括富 含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域，其側(cè)翼有兩個(gè)富含胱氨酸簇，后接兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域， 其中一個(gè)是結(jié)合n t 所必需的。通過(guò)原位雜交顯示，長(zhǎng)片段t r k b 受體在中樞及周 圍神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)神經(jīng)九中表達(dá)，而不在非神經(jīng)元中表達(dá)( j o h n s o nde t a 1 ，1 9 8 6 ； 艨麗畢e t a 1 ，j 9 鲴) 。b d n f 通過(guò)與效應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞表面的t r k b 受體結(jié)合而起作 用。b d n f 與特異的t r k b 受體結(jié)合后，發(fā)生受體的二聚或寡聚化，導(dǎo)致t r k b 受體 內(nèi)在的酪氨酸激酶活性激活，t r k b 受體胞內(nèi)幾個(gè)保守位點(diǎn)的酪氨酸殘基被磷酸 化而激活下游信號(hào)通路。t r k b 酪氨酸磷酸化激活是b d n f 信號(hào)傳導(dǎo)的第一關(guān)鍵事 件。t r k b 酪氨酸磷酸化具有兩種功能。首先，t r k b 酪氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域中的3 個(gè)高度保守的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)為其它位置發(fā)生酪氦酸磷酸化所必需。t r k b 酪 氨酸磷酸化的另一個(gè)功能是為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞蛋白提供識(shí)別或相接位點(diǎn)，可以和 ：海人學(xué)碩l ：學(xué)位論義 一些信號(hào)傳遞蛋白的s h 2 ( s r ch o m o l o g y 2 ) 等結(jié)構(gòu)域結(jié)合( e r i c h u a n ge t a 1 ， 2 d ) 。s h 2 是一種大約為1 0 0 個(gè)氨基酸殘基的序列，因其與s r c 癌基因編碼的蛋 白具有較高的同源性及結(jié)構(gòu)相似性而得名，許多信號(hào)傳遞蛋白都存在s h 2 結(jié)構(gòu) 域。與t r k b 信號(hào)傳遞密切相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)傳遞有磷脂酶c 吖( p l c - 1 , ) 、接頭蛋白 s h c 、p 1 3 激酶，均通過(guò)s h 2 結(jié)構(gòu)域與磷酸化的t r k b 受體結(jié)合( w o l f r a mae t a 1 ， 1 9 9 9 ) ，而且這種結(jié)合是高度特異性的。磷酸化的t 曲受體與胞內(nèi)蛋白形成的 復(fù)合物在信號(hào)傳遞過(guò)程中起重要的中介作用，復(fù)合物的形成通過(guò)多種機(jī)制有利于 信號(hào)傳導(dǎo)。b d n f 通過(guò)t r k b 受體信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的營(yíng)養(yǎng)作用。b d n f 與t r k b 受體結(jié)合后能促進(jìn)背根節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、節(jié)狀節(jié)、巖節(jié)及三叉神經(jīng)中腦 核等感覺(jué)神經(jīng)元的存活和突起生長(zhǎng)。大鼠視神經(jīng)切斷后，用微泵供應(yīng)b d n f 可刺 激再生視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的軸突分支生長(zhǎng)進(jìn)入中樞靶位。b d n f 也可促進(jìn)體外睫狀神 經(jīng)節(jié)及培養(yǎng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活。b d n f 在維持中腦多巴胺能神經(jīng)元胚胎細(xì)胞 存活并向多巴胺能表型分化，能誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)分化、細(xì)胞增大、神經(jīng) 元樹(shù)突分枝增多等過(guò)程中起著重要作用。在體外b d n f 能支持膽堿能細(xì)胞的生存 和上調(diào)這些細(xì)胞膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。發(fā)育及成熟的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)b d n f 也有 依賴作用，且b d n f 可防上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的自然死亡( y u a nqe t a l ，2 0 0 0 ) 。此外， b d n f 尚可增加培養(yǎng)胚胎大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活性，并對(duì)損傷的新生大鼠面神經(jīng)元 有保護(hù)作用。切斷新生大鼠坐骨神經(jīng)后，局部應(yīng)用b d n f 也可挽救9 2 的脊髓運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元，說(shuō)明b d n f 影響著發(fā)育期的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活( e g a nm f e t a 1 ，2 0 0 3 ) 。 b d n f 對(duì)神經(jīng)元損傷修復(fù)與再生起重要作用。嚙齒動(dòng)物切斷海馬傘后，b d n f 對(duì) 切斷的膽堿能神經(jīng)元有支持作用。甚至在黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)損傷數(shù)天后使 用b d n f 仍對(duì)其有修復(fù)作用( l i n d s a y r m e t a 1 ，1 9 9 3 ) 。在體內(nèi)b d n f 對(duì)神經(jīng)突起 生長(zhǎng)和突觸功能具有與體外培養(yǎng)觀察到的相似作用。 b d n f t r k b 除了具有促進(jìn)和維持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化以及修復(fù)的作用 外還具有調(diào)節(jié)突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等功能。b d n f 在神經(jīng)可塑性中起非常 重要的作用，如它是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)( l t p ) 形成和保持所必需( l ube t a 1 ，1 9 9 9 , p a n g p te t a l ，2 0 0 4 ) 。在發(fā)育中和成熟的海馬，b d n f 的水平對(duì)強(qiáng)直毒素介導(dǎo)的l t p 的產(chǎn)生是十分重要( k o r t em e t a l ，2 0 0 0 ) 。剔除b d n f 基因的小鼠，海馬神經(jīng)元 l t p 嚴(yán)重缺陷( k o r t e 脫1 9 9 5 ；p a t t e r s o ns le t a l ，1 9 9 6 ) ，給予外源性b d n f 或轉(zhuǎn) ：海人學(xué)碩l ：學(xué)位論文 染b d n f 基因，受損的海馬l t p 完全恢復(fù)( f i g u r o y ae t a 1 ，1 9 9 6 ) 。b d n f 對(duì)晚期 l t p 的維持產(chǎn)生影響。采用電生理方法可直接觀測(cè)b d n f 對(duì)海馬晚期l t p 的調(diào)控 ( p a n gp t e t a 1 ，2 0 0 4 ) 。在b d n f 基因敲除小鼠，盡管個(gè)別動(dòng)物還存在低幅度早 期l t p ，早期l t p 普遍嚴(yán)重受損；晚期l t p 更從未誘導(dǎo)出，即使在那些早期l t p 尚存的小鼠也沒(méi)有。在l t p 之后3 0 一7 0m i n 給予b d n f 清除劑，可逆轉(zhuǎn)已形成的早 期l t p ，取消晚期l t p 。b d n f 調(diào)控海馬l t p ，提示其參與學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程 ( m u l l e ，de t a 1 ，2 0 0 0 ) 。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在大鼠海馬齒狀回，強(qiáng)直毒素刺激 可促進(jìn)b d n f 釋放，伴有t r k b 的激活，提示l t p 伴隨有b d n f 誘導(dǎo)的t r k b 受體激 活( g o e u e ym e t a 1 ，2 0 0 1 ) ；在出生后的海馬發(fā)育過(guò)程中，隨著年齡的增長(zhǎng)， b d n f 及其受體t r k b 的表達(dá)均增加。這些都可以說(shuō)明t r k b 受體參與了b d n f 的突 觸可塑性調(diào)節(jié)及其l t p 的形成。b d n f 可快速增強(qiáng)海馬神經(jīng)元突觸的傳遞和遞質(zhì) 釋放。研究表明，b d n f 優(yōu)先增強(qiáng)高頻突觸傳遞，b d n f 可以以活性依賴方式在 突觸局部快速釋放，這為b d n f 參與突觸可塑性提供了有力的證據(jù)( k o j i r mm e t a 1 ，2 0 0 1 ) 。b d n f 及其受體t r k b 均存在于突觸后致密帶的事實(shí)，為其參與突 觸可塑性的說(shuō)法提供了形念學(xué)證據(jù)( a o mc e t a 1 ，2 0 0 0 ) 。 b d n f 對(duì)神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用具有活性依賴的特點(diǎn)。也就是說(shuō)神經(jīng)元的活性影 響b d n f 的效應(yīng)實(shí)現(xiàn)在神經(jīng)元可塑性中起作用。例如當(dāng)突觸術(shù)端中度被去極化 時(shí)，b d n f 誘導(dǎo)的神經(jīng)肌肉接頭突觸電位被明顯增強(qiáng)( b o u l a n g e rle t a 1 ，1 9 9 9 ) ； 在海馬，只有當(dāng)突觸前神經(jīng)元受到高頻刺激時(shí)( 5 0 h z ) b d n f 調(diào)節(jié)突觸對(duì)相應(yīng) 刺激做出反應(yīng)( g o t t s c h a l kwe t a l ，j 9 粥) ；在培養(yǎng)的三聯(lián)體系統(tǒng)中一個(gè)興奮性 的神經(jīng)元支配的兩個(gè)突觸后神經(jīng)元，一個(gè)谷氨酸能，一個(gè)g a b a 能，b d n f 可以 選擇性的增強(qiáng)谷氨酸能神經(jīng)元，而不是g a b a 能神經(jīng)元( s c h i n d e ra fe t a 1 ， 2 0 0 0 ) ；在視皮層發(fā)育過(guò)程中，b d n f 調(diào)節(jié)的樹(shù)突突刺的發(fā)育需要提高神經(jīng)元的 活性的提高和n m d a 類(lèi)谷氨酸受體介導(dǎo)的c a 2 + 內(nèi)流( m c a l l i s t e ra k e t a 1 ，1 9 9 6 ) 。 與微弱的突觸前刺激相比，單獨(dú)b d n f 在引導(dǎo)l t p 上沒(méi)有作用。這些實(shí)驗(yàn)顯示 b d n f 誘導(dǎo)的突觸電位具有對(duì)活化的突觸和神經(jīng)元的選擇性或偏愛(ài)性。 ， 有大量證據(jù)提示a d 病人海馬組織、顳葉皮質(zhì)及其它可能皮質(zhì)區(qū)域有b d n f m r n a 及其蛋白降低( g a r z o nde l a l ，2 0 0 2 ) 。且b d n f 蛋白的沉積物與老年斑 有關(guān)，在a d 退行性疾病時(shí)表達(dá)b d n f 或t r k b 的神經(jīng)元被破壞( s o o n t o r u n i y o m k o ：海人學(xué)碩l ：學(xué)位論文 v e t a 1 ，1 9 9 9 ) ；a d 病人海馬組織、大腦皮質(zhì)和基底前腦有t r k b 的表達(dá)( n u m a n se t a 1 ，1 9 9 7 ) 。有研究發(fā)現(xiàn)含t r k b 活性的基底前腦神經(jīng)元在a d 病人中有明顯 下降。a d 病人和j 下常人額葉皮質(zhì)和海馬組織均可表達(dá)催化型( 全長(zhǎng)，具有酪氨 酸激酶活性) 和截?cái)嘈偷膖 r k b 受體，但a d 病人大腦皮質(zhì)和海馬組織中催化型 t r k b 降低( b o i s i e r efe t a 1 ，1 9 9 7 ) ，在某些情況下截?cái)嘈蛅 r k b 增加( 無(wú)酪氨酸 激酶活性) ，這可能會(huì)導(dǎo)致一些依賴于b d n f 的神經(jīng)元死亡。學(xué)習(xí)障礙不能完 全歸咎于海馬或皮質(zhì)功能的改變。前腦的t r k b 信號(hào)對(duì)學(xué)習(xí)是必須的( t a n gy e t a 1 ， 2 d 叩) 。有證據(jù)提示在a d 中這些內(nèi)源性b d n f 的來(lái)源和通過(guò)t r k b 受體介導(dǎo)的 b d n f 的信號(hào)傳遞被損。動(dòng)物內(nèi)源性b d n f 信號(hào)的毀損可破壞學(xué)習(xí)和記l ：l ( m ay l 既a 1 ，1 9 9 8 ) 。應(yīng)用b d n f 似乎不能轉(zhuǎn)改變與年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障礙。b d n f 在學(xué)習(xí)上的生理作用可能依賴于在空間和時(shí)間上都被精細(xì)調(diào)節(jié)的b d n f 表達(dá)和 釋放的短暫變化，而這種變化是不能通過(guò)增加b d n f 表達(dá)或細(xì)胞外濃度被模仿。 一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究提示b d n f 的過(guò)量表達(dá)對(duì)學(xué)習(xí)也是有害的。內(nèi)源性b d n f 的減少可能通過(guò)多種機(jī)制介入a d 的病理生理( m i c h a l s k ibe t a l ，2 0 0 3 ) 。b d n f 在功能和形態(tài)上調(diào)節(jié)突觸可塑性這一觀點(diǎn)已被廣泛接受。在a d 病人腦的神經(jīng)病 理學(xué)上重大的發(fā)現(xiàn)是海馬和大腦皮質(zhì)突觸聯(lián)系的缺失，最近有人提出a d 的主要 缺陷是神經(jīng)元可塑性的喪失，將最終導(dǎo)致所有的神經(jīng)病理和臨床上的表現(xiàn)，包括 老年斑的形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元死亡、突觸聯(lián)系雀失等( c l i m e n tee t a 1 ， 2 0 0 0 ) 。對(duì)b d n f 的分布和作用的研究在近十年有了很大發(fā)展。b d n f 不僅對(duì)外 周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育有重要作用，而且與成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)有密切關(guān) 系，可能涉及一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病和病理生理，特別是a d 和p a r k i n s o n s 病。今后人們更為關(guān)注了解內(nèi)源性b d n f 在a d 和p a r k i n s o n s 病的發(fā)病機(jī)制 和病理生理過(guò)程中所扮演的角色，使患者通過(guò)改善b d n f 的表達(dá)或通過(guò)提高其 受體蛋白的表達(dá)得到治療。 2 膜電位對(duì)電壓敏感性蛋白功能的直接調(diào)節(jié)作用 電壓門(mén)控離子通道是一類(lèi)存在于興奮性細(xì)胞中并與激發(fā)動(dòng)作電位密切相關(guān) 的跨膜蛋白，是生物體電信號(hào)產(chǎn)生和傳播的主要基礎(chǔ)。這一類(lèi)離子通道的功能受 到了細(xì)胞膜電位的影響。膜電位對(duì)離子通道功能的調(diào)節(jié)暗示在細(xì)胞膜內(nèi)部有個(gè) ：海人學(xué)顧l ：學(xué)位論文 電壓感受的機(jī)制。某種形式的跨膜電荷運(yùn)動(dòng)( 例如膜蛋白內(nèi)部偶極子或者帶電氨 基酸感應(yīng)電壓變化而發(fā)生旋轉(zhuǎn)、移動(dòng)) 是感受膜電壓必需的，肯定參與到所有的 電壓調(diào)節(jié)的活性調(diào)節(jié)中。這些帶電粒子旋轉(zhuǎn)、移動(dòng)就會(huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)，因此改 變一個(gè)酶活性或者離子孔道的丌放。這樣的機(jī)制被h o d g k i n 和h u x l e y 用來(lái)解釋 膜電位對(duì)離子通透性的影響( h o d g k i na le t a 1 ，1 9 5 2 ) 。帶電粒子的運(yùn)動(dòng)，必定 會(huì)在蛋白內(nèi)部形成一個(gè)微小的電流即g a t i n gc u r r e n t 。s c h n e i d e r 和c h a n d l e r 在肌 肉細(xì)胞中記錄到了一個(gè)和興奮性收縮相偶聯(lián)的微小電流，首次證明了蛋白內(nèi)部帶 電粒子運(yùn)動(dòng)的存在( s c h n e i d e rm f “以，1 9 7 3 ) 。后來(lái)科學(xué)家們先后在多種電壓 門(mén)控性離子通道中記錄到了g a t i n gc u r r e n t ，并且g a t i n gc u r r e n t 的形成和通道的開(kāi) 放聯(lián)系( a r m s 護(hù)o n gc me t a l ，1 9 7 3 jr a k o w s k ir fe t a 1 ，1 9 9 7 ；l o od d e 1 a 1 ，1 9 9 3 7 c l a y ma r m s r o n ge t a 1 ，1 9 8 1 ) 。 電壓門(mén)控性離子通道具有非常類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，它們都具有4 個(gè)獨(dú)立的蛋白亞基 或者4 個(gè)高度同源的結(jié)構(gòu)域( d 1 d 4 ) 組成，每個(gè)亞基或者結(jié)構(gòu)域均含有6 個(gè)跨 膜螺旋片段( s 1 s 6 ) 。其中s 4 片段高度保守，富含疏水帶電荷氨基酸殘基。此特 征在幾乎所有電壓門(mén)控離子通道中都極為保守，s 4 片段被認(rèn)為是電壓門(mén)控離子 通道的電壓感受器。當(dāng)s 4 片段帶電荷的氨基酸感受膜電位的變化時(shí)發(fā)生相對(duì)的 位移，引起離子通道結(jié)構(gòu)的改變而使通道丌放。電壓敏感性蛋白可以通過(guò)4 種方 式去感受膜電壓的變化。帶電荷的氨基酸殘基如a s p 、g l u 、a r g 、l y s 、h i s 是可能的候選者。因?yàn)樗麄冊(cè)陔妶?chǎng)中可以重新定位，這種電壓感受機(jī)制在電壓門(mén) 控離子通道已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。側(cè)鏈內(nèi)部偶極子的運(yùn)動(dòng)如t y r 在電場(chǎng)中也許可以重新 定位。盡管還沒(méi)有被證實(shí)認(rèn)為是一個(gè)電壓感受器，但a 螺旋和他內(nèi)部的偶極子 運(yùn)動(dòng)代表了一個(gè)可能電壓感受器結(jié)構(gòu)。蛋白內(nèi)部空間駐留的一些自由離子在膜 電場(chǎng)變化時(shí)從蛋白內(nèi)部移出，移出的結(jié)果就是蛋白結(jié)構(gòu)變化，這種機(jī)制在n a + k + 泵中被發(fā)現(xiàn)( f r a n c i s c ob e z a n i l l a , 2 0 0 8 ) 。膜蛋白通過(guò)其內(nèi)部電荷的運(yùn)動(dòng)，位移感 受電場(chǎng)，但是帶電荷的基團(tuán)種類(lèi)、排布、多少、運(yùn)動(dòng)方式都可能不同，然而最終 的結(jié)果都是電場(chǎng)的改變導(dǎo)致了蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變( r i c h a r dh o r ne t a 1 ， 2 0 0 5 ) 。最近幾年對(duì)于g a t i n gc u r r e n t 的研究已不再局限于電壓門(mén)控的離子通道。 已有一些文獻(xiàn)報(bào)道非離子通道的膜蛋白也可以通過(guò)這種機(jī)制直接感受電壓的改 變，引起結(jié)構(gòu)變化，最終使得其自身的功能發(fā)生變化。 海人學(xué)碩i ：學(xué)位論文 y a s u s h io k a m u r a 等在對(duì)a s c i d i a nc i n t e s t i n a l i s 進(jìn)行系統(tǒng)性的基因調(diào)查中發(fā) 現(xiàn)一個(gè)和離子通道，磷酸酶具有高度同源性的基因，這個(gè)基因編碼一個(gè)叫c i v s p 的蛋白。類(lèi)似于電壓門(mén)控離子通道，這個(gè)蛋白包含四個(gè)跨膜片段，其中s 4 片段 每間隔兩個(gè)疏水性氨基酸就有一個(gè)帶正電荷的氨基酸。胞內(nèi)具有一個(gè)與p t e n 結(jié) 構(gòu)很類(lèi)似的磷酸酶活性結(jié)構(gòu)域，其具有磷酸酶活性并且磷酸酶的活性具有電壓依 賴的特點(diǎn)。s 4 片斷可以充當(dāng)一個(gè)電壓感受器的作用。當(dāng)s 4 片斷帶證電荷的幾個(gè) 氨基酸突變掉，c i v s p 蛋白的g a t i n gc u r r e n t 消失。s 4 片斷帶正電荷的幾個(gè)氨 基酸突變掉以后胞內(nèi)段磷酸酶活性的電壓依賴的特點(diǎn)也消失，這說(shuō)明c i v s p 通 過(guò)s 4 片斷中帶正電荷的氨基酸在內(nèi)部相對(duì)位移而去直接感受膜電位的變化，影 響c i v s p 的功能( y o s h i m i c h fm u r a t ae t a 1 ，2 0 0 5 ) 。h a n n ap a m a s 等一開(kāi)始發(fā)現(xiàn) m 2 r 與配體乙酰膽堿的結(jié)合具有電壓依賴的特點(diǎn)，而且這種依賴性不是由于激 活的細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)通路所引起的( y a h b e n c h a i me t a 1 ，2 0 0 3 ) 。通過(guò)c u t o p e n o o c t y ev o l t a g ec l a m p 技術(shù)記錄到了m 2 r 的g a t i n gc u r r e n t ， 并且當(dāng)把兩個(gè)j 下電荷 氨基酸突變掉，g a t i n gc u r r e n t 消失的同時(shí)配受體結(jié)合的電壓依賴的特點(diǎn)也消失。 所以m 2 r 這種g 蛋白偶聯(lián)的受體本身就是一個(gè)電壓敏感性蛋白，可以直接感受 電壓的變化而調(diào)節(jié)配受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)其功能( y a h b e n c h a i me t a 1 ，2 0 0 6 ) 。 3 c u t o p e n 電壓鉗技術(shù) 由于g a t i n gc u r r e n t 是一個(gè)微小且時(shí)間很短的電流，試驗(yàn)記錄時(shí)會(huì)被離子通道 電流、電容電流掩蓋。離子通道電流可以被阻斷，為了減去電容電流，需要假設(shè) 一個(gè)飽和電壓，在這個(gè)電壓下，膜蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)變到最大限度，此時(shí)g a t i n g c u r r e n t 已經(jīng)消失，記錄到的就只有電容電流。通過(guò)電腦軟件設(shè)計(jì)信息采集的 p r o t o c o l 用記錄到的總電流( 包括電容電流和g a t i n gc u r r e n t ) 減去電容電流就可 以檢測(cè)到g a t i n gc u r r e n t 。g a t i n gc u r r e n t 微小且時(shí)間很短，普通的電壓鉗很難記錄， 常采用c u t o p e n 電壓鉗j 支術(shù)記錄。c u t o p e n 電壓鉗制法是9 0 年代初由s t e f a n i 等研究出來(lái)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)過(guò)近十年的發(fā)展已基本成熟。c u t o p e n 設(shè)計(jì)原理 是基于將卵母細(xì)胞分成三個(gè)獨(dú)立部分( 附錄f i g l 所示) 。最下層與細(xì)胞內(nèi)相通， 被鉗制到零電位，中間層和最上層則通過(guò)各自獨(dú)立的電路被鉗制到相同的電位， 電流通過(guò)最上層的記錄電極輸入到放大器。卵母細(xì)胞被特制的細(xì)胞固定槽分成三 ：海人學(xué)碩i ：學(xué)位論文 個(gè)獨(dú)立部分：上槽、中槽和底槽。上槽和中槽底部各有一小圓孔，直徑約為7 0 0 i n n ，四周涂以兒士林油脂使每部分之間絕緣。卵母細(xì)胞被固定于中問(wèn)，但各有 一小部分胞膜通過(guò)小孔暴露于上槽和底槽。各槽中的液體可通過(guò)各自的灌流裝置 進(jìn)行液體灌流。c u t o p e n 的設(shè)計(jì)考慮到了細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的灌流，上槽、中槽用 于細(xì)胞外灌流，底槽用于細(xì)胞內(nèi)灌流。 c u t o p e n 電壓鉗制法主要優(yōu)點(diǎn)有：高頻響應(yīng)及低噪音?？捎糜诜治鐾ǖ赖?激活和失活特性。與膜片鉗技術(shù)相比，具有相似的時(shí)間分辨率，但記錄到的通道 電流較膜片鉗技術(shù)大幾十倍，可達(dá)2 0 3 0 釁。穩(wěn)定記錄可達(dá)數(shù)小時(shí)。相對(duì)而言， 本方法衰減現(xiàn)象不明顯。易于控制細(xì)胞內(nèi)液體成分，可用于研究細(xì)胞內(nèi)藥物對(duì) 通道功能的影響。也可在特殊環(huán)境下研究通道的功能( 蔣學(xué)緩e t a l ，2 0 0 0 ) 。因 此c u t o p e n 電壓鉗技術(shù)已經(jīng)被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室所采用。 4 非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系 非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系是一種功能強(qiáng)大、適用范圍廣的表達(dá)體系，同時(shí)， 也是應(yīng)用最早的基因功能表達(dá)體系之一。1 9 7 1 年，g u r d o n 等人首次將純化的 d n a 注射到爪蟾卵母細(xì)胞獲得了f 確的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)出蛋白質(zhì)之后( g u r d o nj b e t a 1 ，1 9 7 1 ) ，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，其應(yīng)用又有進(jìn)一步的擴(kuò)展。許多不同種 類(lèi)、不同功能的蛋白質(zhì)均可以在其中表達(dá)，并進(jìn)行功能研究。其表達(dá)的適用范圍 從來(lái)源上分為動(dòng)物蛋白質(zhì)和植物蛋白質(zhì)；從功能上分類(lèi)可用于離子通道、泵、受 體、酶等；從亞細(xì)胞定位上分類(lèi)可用于膜蛋白、胞漿蛋白質(zhì)、核蛋白質(zhì)和分泌蛋 白的表達(dá)及功能研究。己被廣泛應(yīng)用于心血管學(xué)、藥理學(xué)及神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域。 如今，爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系已同益成為膜蛋白功能研究的一種重要手段。它具 有將從細(xì)胞或組織中提取的m r n a 、體外轉(zhuǎn)錄合成的c r n a 、基因組d n a 和載 有目的基因的質(zhì)粒翻譯成蛋白的功能，并能將蛋白整合到卵母細(xì)胞膜上，顯示膜 蛋白的原有特性( 附錄f i 酡所示) ，是研究膜蛋白的一種工具。爪蟾卵母細(xì)胞 具有無(wú)季節(jié)性、表達(dá)周期短、體積比較大、便于操作( 實(shí)驗(yàn)用的第五期卵母細(xì)胞 直徑可達(dá)1 2 m m ) 、相對(duì)與其他細(xì)胞要易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。最重要的是非洲爪蟾卵 母細(xì)胞天然不表達(dá)鈉離子通道蛋白，其它一些蛋白表達(dá)也很少，其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相 對(duì)比較簡(jiǎn)單，這可以排除細(xì)胞內(nèi)一些因素的影響，更好地研究目的蛋白的功能等。 ：海人學(xué)顧i ：學(xué)位論文 1 材料 1 1 主要試劑： 二材料與方法 ( 1 ) lo x 人工腦脊液( a r t i f i c i a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d ，a c s f ) 成分： n a c l ：11 9m m k c l ：2 5m m n a h 2 p 0 4 ：1 0m m c a c l 2 ：2 4m m m g s 0 4 ：1 3m m ( p h7 3 ) n a h c 0 3 ：2 6 2m m g l u c o s e d ：11m m 注意最后兩種物質(zhì)使用時(shí)按比例加入。 ( 2 ) 1 0 x 高 k + a - 1 7 腦脊液( a r t i f i c i a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d ，a c s f ) ： n a c l ：l1 9m m k c l ：5 0m m n a h 2 p 0 4 ：1 0m m c a c l 2 ：2 4m m m g s 0 4 ：1 3m m ( p h 7 3 ) n a h c 0 3 ：2 6 2m m g l u c o s e d ：l lm m 注意最后兩種物質(zhì)使用時(shí)按比例加入。 ( 3 ) p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l ： 含有六種主要蛋白酶抑制劑、其名稱、濃度與對(duì)應(yīng)抑制的蛋白酶如表一 ( c a l b i o c h e m 公司) ： l ：海人學(xué)顧l ：學(xué)位論文 p r o d u c t c a t n o m 0 1 w t c o n c e n t r a t i o n t a r g e tp r o t e a s e i n t h e v i a i # a e b s fh y d r o c h l o n d e ，0 1 5 0 02 3 9 5 o om m$ e n n ep r o t e a s e s 6 5 0 9 a p r o t m m ，b o w n e ，r e c o m b i n a n t ， 6 1 6 3 7 18 0p m b r o a ds p e c t r u m ：s e n n e n j c o t l a n as p a m m a l - f r e e 6 5 1 5p r o t e a s e s b e s t a t i n2 0 0 4 8 43 0 8 45m m a m i n o p e p t i d a s eb a n d l e u o n ea m t n o p e p b d a s e e 6 4 p r o t e a s ei n h l b t t o r 3 2 4 8 9 03 5 7 41 5 m m c y s t e m ep r o t e a s e s l e u p e p t m 。h e m t s u l f a t e 1 0 8 9 7 54 7 5 62m m c y s t e i n ep r o t e a s e sa n d t r y p s i n l i k ep r o t e a s e s p e p s t a t i na 5 1 6 4 8 26 8 5 9 1m m a s p a r tj cp r o t e a s e s 表一p r o t e a s ei n h i b i t o r c o c k t a i l 中蛋白酶抑制劑名稱、濃度與對(duì)應(yīng)抑制的蛋白酶 ( 4 ) l y s i sb u f f e r ： n a c l ：1 0 0m m n a f ：5 0m m n a 3 p 0 4 1 0 h 2 0 ：3 0m m e d t a ：2 5m m e g t a ：2 5m m t r i s h c l ：2 0m m t r i t o n 1 0 0 ：1 o 使用時(shí)加入 1 0 s d s( 1 ：1 0 ) p n p p ：( 4 0 m m ) p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l ( 2 0 0 x ) ( 5 ) 5 xr u n n i n gb u f f e r ： t r i s e - b a s e ：1 5 1 9 甘氨酸：9 4 9 10 s d s ：5 0 m l 加水定容到10 0 0 m l 室溫保存 ( 6 ) 10 x t r a n s f e rb u f f e r ： 甘氨酸：2 9 9 t r i s e - b a s e ：5 8 9 10 s d s ：3 7 m l 1 2 一 ：海人學(xué)碩i j 學(xué)位論文 加水定容到1 0 0 0 m l 室溫保存 ( 7 ) 1 0 x t b s ： n a c i ：8 0 9 k c i ：