（應(yīng)用化學(xué)專業(yè)論文）中低密度生物芯片點(diǎn)樣儀研制及親疏水基底研究.pdf

摘要 摘要 生物芯片是指通過微加工工藝同時(shí)將大量的探針分子固定到固相支持物上 后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交配對(duì)，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)進(jìn)而實(shí)現(xiàn) 對(duì)細(xì)胞、蛋白、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快捷、大信息量的檢測(cè)。它是集 物理學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、機(jī)械學(xué)和生命科學(xué)等相關(guān)學(xué)科交叉綜合的高科技研究 課題，是一門既具有重大的學(xué)術(shù)價(jià)值，又同時(shí)具有明顯產(chǎn)業(yè)化前景的快速發(fā)展的 高新科技學(xué)科。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)低密度生物芯片是生物芯片進(jìn)入 臨床檢測(cè)的切入口，因此，作為生物芯片關(guān)鍵部分一點(diǎn)樣頭也隨之進(jìn)入中低密 度的研究。針對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有微陣列制備技術(shù)在中低密度存在的一些不足，主要研 究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 1 提出一種新型的、實(shí)用的微陣列生物芯片制各技術(shù)集成化低密度表 面張力驅(qū)動(dòng)微陣列液體轉(zhuǎn)移芯片，根據(jù)實(shí)際需求與工作原理設(shè)計(jì)芯片結(jié)構(gòu)由儲(chǔ)液 槽、微通道、親水膜組成。實(shí)驗(yàn)使用c 0 2 激光為主要加工設(shè)備制作液體轉(zhuǎn)移芯 片，其主要參數(shù)：芯片大小為7 5 x 3 0 m m 2 ，內(nèi)有3 x 8 橢圓陣列，行中心間距為4 m m ， 列中心間距為8 m m ，儲(chǔ)液槽為5 x 3 m m 2 ，深2 m m ，微通道設(shè)計(jì)平均直徑為0 5 m m ， 長(zhǎng)l m m ，親水膜附著于微通道尾端中心，平均直徑為1 9 7 m m 。 2 參照現(xiàn)有點(diǎn)樣儀主要參數(shù)，組裝點(diǎn)樣儀并進(jìn)行改進(jìn)，調(diào)試。點(diǎn)樣儀每次 點(diǎn)樣最多2 x 6 片，在點(diǎn)樣針高為5 m m 時(shí)，最高效率為1 7 0s p o t s s ，最低效率為： 1 7s p o t s s 。分析了操作過程中各參數(shù)意義及其設(shè)定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)。 3 使用自制點(diǎn)樣頭及點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。在不同的基底材料上，點(diǎn)樣參數(shù)相同， 所得樣點(diǎn)直徑不同，樣點(diǎn)直徑c v 值均在0 3 以下。采用f i t c 熒光物質(zhì)樣品點(diǎn) 樣發(fā)現(xiàn)，樣點(diǎn)熒光強(qiáng)度基本相同，說明各樣點(diǎn)點(diǎn)樣體積基本一致；單一樣點(diǎn)內(nèi)熒 光強(qiáng)度呈中間最大、扁平，邊緣逐漸衰減，消除了傳統(tǒng)針式點(diǎn)樣樣點(diǎn)內(nèi)熒光“咖 啡環(huán)”效應(yīng)，樣點(diǎn)中間熒光強(qiáng)度大且扁平說明樣點(diǎn)內(nèi)部樣品分布均一，能顯著提 高樣點(diǎn)質(zhì)量。從點(diǎn)樣原理和實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)點(diǎn)樣過程中的影響因素進(jìn)行討論，影響樣 點(diǎn)質(zhì)量的主要因素有點(diǎn)樣頭本身及基底表面性質(zhì)、點(diǎn)樣過程中因素如點(diǎn)樣接觸時(shí) 間與間隔時(shí)間、點(diǎn)樣環(huán)境因素及樣品物化性質(zhì)等。 4 初步探索了超疏水表面的一般性質(zhì)，模板法制備了間距缸m ，邊長(zhǎng)1 4 t m ， 塑l 璧一 _ _ 一一一一 高1 私m 微柱陣列的規(guī)則超疏水p d m s 表面，其靜態(tài)接觸角為1 5 1 。制備了親 疏水圖案化基底，對(duì)并其在生物芯片點(diǎn)樣中的應(yīng)用作了初步考察，研究表明，親 疏水基底作為生物芯片基底比具有單一性質(zhì)基底優(yōu)越，具體表現(xiàn)為樣點(diǎn)面積均一 性良好，形狀一致性加強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度得到提高，即很大程度上提高了樣點(diǎn)質(zhì)量。 關(guān)鍵詞：微陣列生物芯片；c 0 2 激光加工；點(diǎn)樣儀；點(diǎn)樣；親疏水基底 n a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o m a r r a y sb i o c h i p si sae x a c t ，q u i c ka n dh i 【g ht h r o u g h o u td e t e c t i o no fc e l l ， p r o t e i n ，d n aa n do t h e rb i o - c o n s t i t u e n t sb yo b s e r v eh y b r i d i z es i g n so fe a c hs a m p l e ， t h es a m p l el a b e l l e df l u o r e s c e n c em a t e r i a l sh y b r i d i z et op r o b ew h i c hi m m o b i l i z eo n s o l i ds u b s t r a t eb ym i c r o f a b r i c a t o nt e c h n o l o g y m i c r o m a r r a y sb i o c h i p si n t e g r a t e p h y s i c s ，c h e m i s t r y , m i c r o e l e c t r o n i c s ，m e c h a n i c sa n dl i f es c i e n c ea n do t h e rc o r r e l a t i v e f i e l d s i ti sah i g hs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yp r o b l e mb o t hw i t hi m p o r t a n c ea c a d e m i c v a l u ea n db r i g h ti n d u s t r i a l i z a t i o nf o r e g r o u n d a sr e s e a r c hf o rm o r et h a n1 0y e a r s ， m i d d l e l o w d e n s i t ys p o ti sas u i t a b l ea p p l i c a t i o nf o rc l i n i cd e t e c t i o n a sar e s u l t ，t h e k e yt e c h n o l o g yo fm i c r o m a r r a y sb i o c h i p s - - - - - d i s p e n s e r , t u mt om i d d l e l o w - d e n s i t y s p o t t i n g r e s e a r c h f o c u so nt h ew e a k n e s s e so ft h ef a b r i c a t em i d d l e l o w - d e n s i t y s p o t t i n gt e c h n o l o g i e sa tp r e s e n t ，t h em a i nw o r ka n dr e s u l t sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 p r o p o s e d an e wt y p e ，p r a c t i c a b l y m i c r o m a r r a y sb i o c h i p f a b r i c a t i o n t e c h n o l o g y - _ i n t e g r a t em i d d l e l o w - d e n s i t yd i s p e n s e rs p o t t i n gb ys u r f a c et e n s i o n d r i v i n g a c c o r d i n gt or e q u i r e m e n ta n dw o r k i n gp r i n c i p l e ，t h ed i s p e n s e rc o n t a i n s r e s e r v o i r s ，c h a n n e la n dh y d r o p h i l i cm e m b r a n e c 0 2l a s e rw a su s e dt o a b l a t et h e 7 5 x 3 0 m m 2d i s p e n s e rw h i c hc o n t a i n s3 x 8e l l i p s er e s e r v o i r s e a c hr e s e r v o i ri sa sl a r g e a s5 x 3 m m z ，d e e pi n2 m m t h ec e n t e rd i s t a n c eo fl i n ea n dr o wb e t w e e nr e s e r v o i r sa r e 4 m m ，8 m mr e s p e c t i v e l y t h ec h a n n e lw i t ht h ea v e r a g ed i a m e t e ro f0 5 m m ，l e n g t ho f l m mh a sah y d r o p h i l i cm e m b r a n ew h i c hd i a m e t e ro f1 9 7 r a mo nt h eb o t t o m 2 a s s e m b l e dm i c r o m a r r a y e rs y s t e ma n dd e b u g g i n gb yr e f e r e n c ec o m m e r c i a l m i c r o m a r r a y e r t h em i c r o m a r r a y e rc a ns p o t2 x 6t i m e sa t at i m e ，w i t hah i 【g h e f f i c i e n c yo f1 7 0s p o t s sa n dl o we f f i c i e n c yo f1 7s p o t s sw h i l et h ed i s p e n s e rl i f t sa h i 曲o f5 m m t h em e a n i n go fo p e r a t i o np a r a m e t e ra n dn o t e so fo p e r a t i o na r e a n a l y s i s 3 s p o t t i n gu s i n gs e l f - f a b r i c a t i o nd i s p e n s e r t h es p o td i a m e t e rc h a n g ew i t ht h e s u b s t r a t ec h a n g ea tt h es a m es p o t t i n gp a r a m e t e r , t h ec vo ft h ed i a m e t e ro fs p o t si s h i a b s t r a c t b e l o w0 3 f i t ca sas p o t t i n gs a m p l ef o rr e s e a r c h ，t h ei n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c eo f s p o t sa r ct h es a m ew i t ht h es a m es p o tv o l u m e ；i nas i n g l es p o t ，f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y i sf l a ta n dm a x i m u mi n s i d e ，w h i l ea t t e n u a t et oz e r oa tt h ec d g e t h e “c o f f e er i n g e f f e c tw h i c ho c c u r su s i n gc o n v e n t i o n a lm i c r o m a r r a y e rs p o r i n gw a sd i s a p p e a r e d f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sf l a ta n dm a x i m u mi n s i d em e a n i n gt h a tt h es a m p l ew a s d i s t r i b u t eh o m o g e n e o u si n s i d e ，t h i sc a ni m p r o v es p o tq u a l i t yo u to fq u e s t i o n i n f l u e n c eo fs p o tq u a l i t yw h i c hw a sd i s c u s s e df r o ms p o t t i n gp r i n c i p l ea n dr e s u l t sa s f o l l o w s ：d i s p e n s e ra n ds u b s t r a t e ，c o n t a c tt i m ea n di n t e r v a l t i m ed u r i n gs p o t t i n g ， c i r c u m s t a n c ea n dp h y s i c a l c h e m i c a lc h a r a c t e ro fs a m p l e 4 g e n e r a lc h a r a c t e ro fs u p e r d y d r o p h o b i cw a gs t u d i e d am i c o p i l l a ra r r a yp d m s s u r f a c ew h i c ht h eb i g g e s to fw c ac a nr e a c ht oa b o u t1 5 1 0a tt h es i z e , d i s t a n c e , h e i g h t o ft h em i c r o p i l l a ro f1 4 m ，單m ，1 4 z mr e s p e c t i v e l yw a sp r e p a r e db yi c pe t c h i n g m o d e l s e v e r a ls u b s t r a t e sw i t hh y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cp a t t e r nw e r ef a b r i c a t e da n d d o i n gs o m ep r i m a lr e s e a r c ho fe f f e c to fa p p l i e dt h i s s u b s t r a t et ob i o c h i p s i t s i n d i c a t e st h a ts u b s t r a t e sw i t hh y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cp a t t e r na sab i o c h i ps u b s t r a t e h a v em a n ym e r i t s ：h o m o g e n e o u ss p o ts i z e ，u n i f o r ms p o tt o p o g r a p h y , h i g hd e t e c t i o n s e n s i t i v i t y i naw o r d ，t h i ss u b s t r a t ec a l li m p r o v es p o tq u a l i t yo fb i o c h i p k e yw o r d s ：m i c r o m a r r a y sb i o c h i p s ；c o ：l a s e ra b l a t i o n ；m i c r o m a r r a y e r ；s p o t t i n g ； h y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cs u b s t r a t e 本文中用到的縮寫詞列表 本文中用到的縮寫詞列表 英文縮寫英文全名中文名 d n a d e o x y r i b o n u c l e i c脫氧核糖核酸 p c r p o l yc h a i nr e a c t i o n聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) m b 蝎m a s k l e s sa r r a ys y n t h e s i z e r非掩蔽膜陣列合成 器 d m d d y n a m i c m i c r o m i r r o rd e v i c e動(dòng)態(tài)微透鏡裝置 p o s a mp i e z o e l e c t r i co l i g o n u c l e o t i d e壓電寡核苷酸微陣 s y n t h e s i z e ra n dm i c r o a r r a y e r列合成器 c vc o e f f i c i e n tv a r i a t i o n變異系數(shù) p d m s p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) 聚二甲基硅氧烷 m e m sm i c r o e l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m s微機(jī)電系統(tǒng) c c d c h a r g ec o u p l e dd e v i c e 電荷耦合裝置 t s p st - s t r u c t u r ep o l y d i m e t h y l s i l a x a n e多聚二甲基甲硅烷 p p l p o l y ( p h e n y l a l a n i n e )聚苯丙氨酸一賴氨 酸 f i t cf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e熒光素異硫氰酸脂 d p i d o t p e r i n c h分辨率 p p ip i x e lp e ri n c h圖像分辨率 3 a p s 3 - a m i n o p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e 氨基硅烷 i c p i n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m a感應(yīng)耦合等離子體 r s dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 w c a w a t e rc o n t a c ta n g l e水接觸角 p m m a p o l y ( m e t h y l m e t h a c r y l a t e ) 聚甲基丙烯酸甲酯 n d ：y a g n e o d y m i u m ：y t t r i u ma l u m i n u mg a r n e t 釹：釔鋁石榴石 1 0 2 廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 茲呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究 成果。本人在論文寫作中參考的其他個(gè)人或集體的研究成 果，均在文中以明確方式表明。本人依法享有和承擔(dān)由此論 文而產(chǎn)生的權(quán)利和責(zé)任。 聲明人( 簽名) ：蘇f 虱卉 明年么月心日 廈門大學(xué)學(xué)位論文著作權(quán)使用聲明 本人完全了解廈門大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。廈 門大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的紙 質(zhì)版和電子版，有權(quán)將學(xué)位論文用于非贏利目的的少量復(fù)制并允 許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱，有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān) 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。保密 的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。 本學(xué)位論文屬于 1 、保密() ，在年解密后適用本授權(quán)書。 2 、不保密( ) ( 請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)括號(hào)內(nèi)打“4 ”) 作者簽名： 導(dǎo)師簽名： 日期：年月日 日期：年月 日 第一章緒論 第一章緒論 九十年代初生命科學(xué)及相關(guān)科學(xué)研究的需要，促使一門新興的交叉學(xué)科 生物芯片的誕生。生物芯片( b i o c h i p ) 是指通過微加工工藝同時(shí)將大量的探針分子 固定到固相支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交配對(duì)，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子 的雜交信號(hào)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快捷、大信 息量的檢測(cè)。它是集物理學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、機(jī)械學(xué)和生命科學(xué)等相關(guān)學(xué)科交 叉綜合的高科技研究課題，是一門既具有重大的學(xué)術(shù)價(jià)值，又同時(shí)具有明顯產(chǎn)業(yè) 化前景的快速發(fā)展的高新科技學(xué)科。狹義上的生物芯片也稱為微陣列生物芯片， 包括基因芯片、蛋白( 多肽) 芯片、多糖芯片和神經(jīng)元芯片、細(xì)胞芯片、組織原 位芯片等種類1 2 l 。 生物芯片的主要特點(diǎn)是高通量、微型化和自動(dòng)化。芯片上集成的分子微陣列 能在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)分析大量的生物分子，效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍。生 物芯片和傳統(tǒng)儀器相比具有體積小、重量輕、便于攜帶、污染小、分析過程自動(dòng) 化、分析速度快、所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)。 生物芯片技術(shù)的飛速發(fā)展引起了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注和重視。1 9 9 8 年6 月 2 9 日美國(guó)宣布正式啟動(dòng)生物芯片計(jì)劃，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生部、能源部、商業(yè)部、司 法部、國(guó)防部、中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。世界大型知名公司如a f f y m e t r i x 、 a g i l e n t 、m e r g o n 也介入這一領(lǐng)域，開發(fā)和銷售自己的芯片設(shè)備和技術(shù)。英國(guó)劍 橋大學(xué)、歐亞公司也正在從事該領(lǐng)域的研究。以生物芯片為核心的相關(guān)產(chǎn)業(yè)已在 全球崛起。我國(guó)政府、科技界和商業(yè)界幾乎同時(shí)意識(shí)到生物芯片技術(shù)的重大戰(zhàn)略 意義和蘊(yùn)藏的無限商機(jī)，開展了生物芯片技術(shù)研發(fā)。其中最具代表性的事件就是 2 0 0 0 年初由國(guó)內(nèi)從事生物芯片技術(shù)研究的多家單位進(jìn)行強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合成立了國(guó)家生 物芯片技術(shù)中心。目前國(guó)內(nèi)已有多家科研單位開始從事這方面的研究。例如，清 華大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院等幾十家單位在國(guó)內(nèi)開展了生物芯片技術(shù) 研究，建立了生物芯片技術(shù)體系，并己在生物芯片技術(shù)和產(chǎn)品開發(fā)方面取得了較 大突破。 生物芯片用途廣泛，如可以應(yīng)用于尋找新基因、d n a 測(cè)序、疾病診斷、藥 廈門大學(xué)工學(xué)碩士學(xué)位論文 物篩選、毒理基因組學(xué)研究、農(nóng)作物優(yōu)育和優(yōu)選、環(huán)境監(jiān)測(cè)和防治、食品衛(wèi)生監(jiān) 督以及司法鑒定等等。生物芯片技術(shù)的深入研究和廣泛應(yīng)用，將對(duì)2 1 世紀(jì)人類 生活和健康產(chǎn)生極其深遠(yuǎn)的影響。 1 1 微陣列生物芯片的歷史及研究現(xiàn)狀 1 1 1 微陣列生物芯片的發(fā)展簡(jiǎn)史 2 0 世紀(jì)9 0 年代初，為適應(yīng)“后基因組時(shí)代”的到來，產(chǎn)生了一項(xiàng)新的技術(shù)， 即以基因芯片為先導(dǎo)的生物芯片技術(shù)。從起源上來說，生物芯片技術(shù)可追溯到一 個(gè)多世紀(jì)前。e d s o u t h e r n 等發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的核酸分子能夠與另一被固化的核酸分 子進(jìn)行配對(duì)雜交，并建立了現(xiàn)在普遍應(yīng)用的s o u t h e r n 印跡技術(shù)【。因此，s o u t h e r n 印跡可以看作最早的生物芯片。早在1 9 8 8 年，w b a i n s 等人就將短的d n a 片段 固定到支持物上，借助雜交方式進(jìn)行測(cè)序。生命科學(xué)與眾多相關(guān)學(xué)科，如計(jì)算機(jī) 科學(xué)、材料科學(xué)、微加工技術(shù)、有機(jī)合成技術(shù)等的迅猛發(fā)展，為生物芯片技術(shù)的 發(fā)展提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。探針固相原位合成技術(shù)和照相平版印刷技術(shù)的有機(jī) 結(jié)合，以及激光共聚光顯微鏡的引入，促使基因芯片從實(shí)驗(yàn)室研究走向工業(yè)化應(yīng) 用。以上這些技術(shù)使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計(jì)的基因探針分子變得切實(shí)可 行，而且借助激光共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)雜交信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn) 確的檢測(cè)和分析。 從2 0 世紀(jì)8 0 年代初雜交測(cè)序( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n ，s b h ) 的概念的提 出，到9 0 年代初以美國(guó)為主開始研究和開發(fā)各種生物芯片的短短1 0 年時(shí)間，生 物芯片技術(shù)獲得了迅速發(fā)展： ( 堇) 1 9 9 1 年s f o d o r 等人首先提出d n a 芯片的概念【2 】 用光刻技術(shù)經(jīng)過十步 光控合成，制成含有1 0 2 4 個(gè)縮氨酸樣點(diǎn)的微陣列芯片，并利用落射式熒光顯微 鏡檢驗(yàn)其與單克隆抗體的反應(yīng)。同年a f f y m e t f i x 公司率先生產(chǎn)了世界上第一塊寡 核苷酸基因芯片【3 1 ，用于科研領(lǐng)域。這兩個(gè)工作開創(chuàng)了制備微陣列生物芯片的原 位合成技術(shù)。 ( g ) 1 9 9 5 年，m s c h e n a 首次發(fā)表關(guān)于基因芯片的論文【4 1 ，介紹他們使用高速 機(jī)械手在玻璃片上點(diǎn)上d n a 探針，并利用雙熒光標(biāo)記一次性檢測(cè)4 5 個(gè)基因表 2 第一章緒論 達(dá)的結(jié)果。該工作則開創(chuàng)了制備微陣列生物芯片的點(diǎn)樣技術(shù)。 1 9 9 7 年已在a f f y m e t r i x 公司的s f o d o r 充分結(jié)合光控合成和激光共聚焦掃 描兩種技術(shù)，并借助照相平板印刷、計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、d n a 合成、熒光標(biāo)記、 探針雜交及分子生物學(xué)的其他技術(shù)，創(chuàng)造了第一塊成熟的基因芯片【5 1 。 生物芯片技術(shù)已成為生物學(xué)研究的一種重要手段，同時(shí)也顯示出很好的市場(chǎng) 開發(fā)前景。目前，國(guó)際上已有上百家從事生物芯片研究和開發(fā)的專業(yè)公司。其中， 以應(yīng)用專利性光蝕刻技術(shù)通過原位合成制備寡核苷酸芯片的a f f y m e t r i x 公司被 公認(rèn)為生物芯片行業(yè)的領(lǐng)頭羊，主導(dǎo)并影響生物芯片行業(yè)的發(fā)展方向。 生物芯片的出現(xiàn)和應(yīng)用，引起了國(guó)際上的廣泛關(guān)注。美國(guó)商業(yè)權(quán)威雜志 f o r t u n e 在1 9 9 7 年3 月刊中以封面為題撰文對(duì)生物芯片的重要性進(jìn)行了闡述， “微處理器在本世紀(jì)是我們的經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了根本改變，基因芯片給人類帶 來的影響可能會(huì)更大，它可以從根本上改變醫(yī)學(xué)行為和我們的生活質(zhì)量，從而改 變世界面貌”。s c i e n c e 期刊還把生物芯片技術(shù)評(píng)選為1 9 9 8 年的世界十大科 技突破之一。 1 1 2 微陣列生物芯片的研究現(xiàn)狀 1 121 國(guó)外研究現(xiàn)狀 在過去的十年里，美國(guó)政府和產(chǎn)業(yè)界共投入2 0 億美元用于以基因芯片為主 的生物芯片技術(shù)的研究開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化；歐洲與日本對(duì)生物芯片的研究支持力度也 越來越大；國(guó)際著名跨國(guó)公司，如摩托羅拉、惠普、m m 以及日立都開始投資 和開發(fā)基因芯片技術(shù)；幾乎所有的跨國(guó)制藥公司都投入巨資建立生物技術(shù)平臺(tái)， 開展新藥的超高通量篩選和對(duì)藥物毒理學(xué)、藥物基因組學(xué)等進(jìn)行研究。美國(guó)于 1 9 9 8 年正式啟動(dòng)生物芯片計(jì)劃。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院( h i 、能源部、商業(yè)部、 司法部、國(guó)防部、中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。幾乎美國(guó)所有的大學(xué)和研究機(jī) 構(gòu)如斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院以及a r g o n n eo a k r i d g e 國(guó)家實(shí)驗(yàn)室都參加了生物 芯片的研究和開發(fā)。至今，美國(guó)已有多家生物芯片公司產(chǎn)品開始投放市場(chǎng)，納斯 達(dá)克( m 峪d a q ) 反應(yīng)熱烈。 生物芯片的發(fā)展方向主要有三個(gè)方面【6 】：( 1 ) 無標(biāo)記雜交信號(hào)檢測(cè)；( 2 ) 高度 自動(dòng)化的雜交流水作業(yè)系統(tǒng)；( 3 ) 強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理軟件。根據(jù)芯片載體中的探針 3 廈門大學(xué)工學(xué)碩士學(xué)位論文 數(shù)量，可將生物芯片分為高密度生物芯片和中低密度生物芯片。高密度生物芯片 主要用于基因功能研究，疾病相關(guān)基因研究和疾病診斷，藥物作用機(jī)理，毒理研 究與新藥篩選等方面。迄今為止，細(xì)菌、真菌、植物、高等哺乳動(dòng)物及人類的高 密度基因表達(dá)譜芯片都在研究和開發(fā)中。低密度生物芯片主要用于按功能分類的 基因表達(dá)譜分析、基因突變檢測(cè)或特異性抗原抗體檢測(cè)等領(lǐng)域。低密度生物芯片 主要集中在c d n a 芯片和蛋白質(zhì)芯片，并相繼開發(fā)了一系列相關(guān)產(chǎn)品。 1 1 2 2 國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀 我國(guó)對(duì)生物芯片十分重視。早在1 9 9 7 年國(guó)家科委( 現(xiàn)國(guó)家科技部) 就專門討 論了生物芯片的發(fā)展大計(jì)。在基金支持上，2 0 0 2 年國(guó)家科技部在8 6 3 高技術(shù)項(xiàng) 目中正式啟動(dòng)了功能基因和生物芯片重大專項(xiàng)，對(duì)生物芯片研發(fā)給予了強(qiáng)大的支 持。在組織機(jī)構(gòu)上，2 0 0 0 年和2 0 0 3 年分別成立了國(guó)家生物芯片技術(shù)北京工程中 心和生物芯片上海國(guó)家生物芯片工程中心。此外，國(guó)內(nèi)從事生物芯片研究和開發(fā) 的單位超過幾十家。 從目前研究來看，國(guó)內(nèi)尚無成型的高密度芯片研究成功，基本處于研發(fā)狀態(tài) 或與國(guó)外進(jìn)行合作研發(fā)。中低密度生物芯片是國(guó)內(nèi)生物芯片技術(shù)研究和開發(fā)的主 流，但還處于研發(fā)階段，產(chǎn)業(yè)化受技術(shù)原因( 穩(wěn)定性、特異性、重復(fù)性、敏感性 等) 還無法生產(chǎn)出完全符合潛在客戶需要的能實(shí)際使用的產(chǎn)品。今年來，在農(nóng)產(chǎn) 品檢測(cè)芯片、乙肝病毒基因檢測(cè)、病毒耐藥性檢測(cè)和病毒分型芯片等方面取得了 較大進(jìn)展，相關(guān)產(chǎn)品也陸續(xù)投放市場(chǎng)。 1 2 微陣列生物芯片的基本原理及關(guān)鍵技術(shù) 微陣列生物芯片技術(shù)包括四個(gè)基本步驟【7 1 ，分別是： 芯片微陣列的構(gòu)建：通常采用硝酸纖維素膜、尼龍膜、玻璃、硅片等固相 支持物作為基底。在構(gòu)建陣列前首先需要對(duì)基底表面進(jìn)行活化處理，即通過化學(xué) 反應(yīng)用各種不同的活化試劑在基底表面鍵合上各種各樣的活性基團(tuán)，用來固定各 種不同的活性生物分子。 而陣列的構(gòu)建則是其中最為關(guān)鍵的步驟，目前構(gòu)建陣列主要通過原位合成法 或點(diǎn)樣法將大量不同探針陣列式固定在基底上。 4 第一章緒論 樣品的獲得和標(biāo)記：樣品的獲得主要通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( p c r ) j 差行體外 擴(kuò)增，然后用熒光進(jìn)行標(biāo)記。 雜交反應(yīng)：主要是利用特異性的分子間相互作用，如核酸雜交、抗原一抗 體特異行結(jié)合、蛋白一蛋白間特異性結(jié)合等使已經(jīng)標(biāo)記了的待測(cè)樣品與生物芯片 反應(yīng)。 信號(hào)檢測(cè)與結(jié)果分析：目前主要是利用激光共聚焦熒光掃描儀等檢測(cè)手段 獲取反應(yīng)信息，經(jīng)電腦系統(tǒng)處理，分析得到信號(hào)值，而這個(gè)信號(hào)值就代表了結(jié)合 在探針上的待測(cè)樣本中的特定大分子的信息。 以上四個(gè)基本步驟包括的細(xì)節(jié)即是生物芯片技術(shù)的關(guān)鍵部分。 1 3 微陣列生物芯片制備技術(shù) 微陣列生物芯片以樣點(diǎn)的微陣列存在形式為主要特征，所以微陣列的構(gòu)筑技 術(shù)在生物芯片中有著極其重要的地位。目前微陣列生物芯片的微陣列構(gòu)筑方法主 要有原位合成法( j ns i t us y n t h e s i s ) 和合成后微點(diǎn)樣法兩大類【8 9 1 ，后者也稱合成后 交聯(lián)( p o s t - s y n t h e t i ca t t a c h m e n t ) 、離片合成等。 1 2 1 原位合成法 原位合成目前多采用光刻合成法、分子印章法、點(diǎn)合成法等，其主要適用于 商品化、規(guī)?；母呙芏然蛐酒闹苽浜蛻?yīng)用領(lǐng)域。 在這種制備技術(shù)中，微陣列是在基底上用原位合成的方法逐步制備核酸和一 些其它的生物高聚物陣列。在每步的合成反應(yīng)中，大量的核苷酸被加入而增加探 針的鏈長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的長(zhǎng)度。 在原位合成技術(shù)中，按合成的方式又分為以下四種： 1 2 1 1 光導(dǎo)化學(xué)合成法( 1 i g h t - d i r e c t e dc h e m i c a ls y n t h e s i s ) 光導(dǎo)化學(xué)合成法首先是由美國(guó)的a f f y m a t r i x 公司發(fā)展起來的，它是將光刻技 術(shù)( p h o t o l i t h o g r a p h y ) 和固相d n a 合成( s o l i d - p h a s ed n as y n t h e s i s ) 技術(shù)有機(jī)結(jié)合在 一起制造高密度核酸陣列基因芯片的一種技術(shù)【2 , 5 1 0 , 1 1 l 。具體步驟主要是先將支持 物表面氨基化或羥基化，即在玻璃上鋪上一層連接分子( 1 i n k e r ) ，然后修飾上光敏 保護(hù)基團(tuán)，用光敏保護(hù)基團(tuán)將支持物表面的氨基保護(hù)起來。當(dāng)光線通過掩模( m a s k ) 5 廈門大學(xué)工學(xué)碩j j 學(xué)位論義 照在支持物上時(shí)，有光線通過的地方光保護(hù)基團(tuán)脫去，表面氨基被活化。然后加 入第一批羥基保護(hù)的脫氧核苷酸，此單體分子就連接到支持物表面的氨基上。接 下去，通過不同的掩摸，光照選擇性的激活表面氨基，用另一羥基保護(hù)的脫氧核 苷酸取代，并且循環(huán)發(fā)生著這些化學(xué)反應(yīng)，直至合成所需要序列長(zhǎng)度的寡核苷酸 陣列，如圖1 1 。如果用氨基酸代替脫氧核苷酸來合成，則得到的是蛋白質(zhì)芯片。 光導(dǎo)化學(xué)合成法主要優(yōu)點(diǎn)是芯片密度高、分辨率高；以及設(shè)計(jì)方便，可以直 接制備探針；并且能夠標(biāo)準(zhǔn)化、批量化、可靠性高。 光導(dǎo)化學(xué)合成法缺點(diǎn)也十分明顯：利用光活性基團(tuán)合成，其合成效率較低， 且每步合成有一定的錯(cuò)誤率，導(dǎo)致只能合成較短的寡核苷酸探針( 低于2 5 m e r s ) ， 特異性較差。并且需要用到專利技術(shù)和大型復(fù)雜設(shè)備，造價(jià)較高。另外需要花費(fèi) 大最的時(shí)和成本來制備掩模板，因?yàn)楣押藸I(yíng)酸的每個(gè)堿基位需要4 塊掩模板，合 成一個(gè)2 5 個(gè)堿基對(duì)的微陣列芯片就需要1 0 0 塊掩模板，對(duì)雜交和檢測(cè)的要求亦 高。只能分析一些已知基因，應(yīng)用面較窄。 罱= 言罱百”“k 。io i 。i 。io i c h e m i c a i i f 甲1 i c 0 “p i 、 h oh 0 0 0 0 嬲目隧；粼 二二出_ 一溯 l l 口砷 i c c p r a k ，c n l 一r a 5 k 鋤戳蹦 g tt0 0 0 瀚掰辯黜囂ttc c 0 搿辮馥鞲。o i 甾鹽；渤瞻e 一嗣王主主二主 r e p 到 曩赫裁薯 ttooo 三三三主 c a t at agctg - 了cc g 三主主主王 圖1 1a ，光導(dǎo)向寡核苷酸陣列合成流程。b ，光源、掩模和陣列示意圖，圖片 復(fù)制f l 文獻(xiàn) 1 1 】 在光導(dǎo)化學(xué)合成法當(dāng)中制作每一塊芯片都需要大量的掩蔽模，而制作掩模成 本很高，大大提高生物芯片的制作成本。所以一種不用掩蔽模的光化學(xué)合成法 ( m a s k l e s sa r r a ys y n t h e s i z e rm a s ) 1 2 ，1 3 】應(yīng)運(yùn)而生，這種方法主要用計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的動(dòng) 態(tài)微透鏡裝置( d y n a m i cm i c r o m i r r o rd e v i c ed m d ) 代替?zhèn)鹘y(tǒng)用鉻做的掩蔽模，如圖 1 2 。 該方法能顯著提高合成效率，但制作的芯片密度較低，目6 仃芯片最多只能承 第一章緒論 載8 0 0 0 個(gè)探針，還不能得到廣泛應(yīng)用。 圖1 2m a s 合成芯片原理示意圖，圖片復(fù)制自文獻(xiàn) a 2 】 i b m 公司所研發(fā)成功的光刻膠保護(hù)合成法則是在光敏保護(hù)基團(tuán)上的改進(jìn) 1 4 , 1 5 j 。光刻膠保護(hù)合成法首先在基底上涂抹上一層光刻膠，利用光刻顯影得到圖 案，通常用酸脫去三苯甲基保護(hù)基團(tuán)，露出活性羥基就可以和與脫氧核苷酸氨基 磷酸脂反應(yīng)，再將基片送入流通池，經(jīng)過偶聯(lián)、氧化、戴帽、脫保護(hù)和清洗程序， 不斷重復(fù)這些步驟，按照設(shè)計(jì)的d n a 序列，就可構(gòu)建不同密度不同序列的寡核苷 酸芯片。 對(duì)于蛋白芯片【1 6 2 1 1 ，一般采用圖1 3 制作方法。 該方法適用于制備高密度的陣列芯片，所得芯片精度和準(zhǔn)確度非常高，但同 樣具有耗時(shí)、昂貴的缺點(diǎn)。 7 奎 一 廈門人學(xué)工學(xué)碩i j 學(xué)位論文 ； , 1 1 1 丫了甲? 丫下 ； 心壘 渙豢鼉 圖1 3 蛋自芯片光導(dǎo)化學(xué)法制作方法不恿，圖片復(fù)制自文獻(xiàn) 2 0 1 2 i 2 點(diǎn)合成法( s p o t s y n t h e s i s ) 點(diǎn)合成法由r o n a l df r a n k 于1 9 9 2 首先年提出【2 1 。該方法的具體步驟是將大 量單獨(dú)的點(diǎn)陣列式的排列在一層纖維素膜上，然后通過手工或者自動(dòng)加入一些適 當(dāng)?shù)臉悠贩謩e合成每一個(gè)不同的點(diǎn)【2 3 - 2 5 1 。 b l a n c h a r d 和h o o d 提出得壓電噴印合成法也是一種點(diǎn)合成法。壓電噴印合成 法其原理與噴墨打印類似，不過是芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒裝的是4 種堿 基等液體而不是碳粉。壓電噴印合成法非常靈活，可快速合成寡核苷酸陣列。隨 后很快發(fā)展到p o s a m ( p i e z o e l e c t r i co l i g o n u c l e o t i d e s y n t h e s i z e r a n d m i c r o a r r a y e r ) 2 6 , 2 7 】，該系統(tǒng)主要是利用連接有六條微通道的廉價(jià)壓電噴印頭，其 中四條用來轉(zhuǎn)移氨基磷酸脂前體，另外兩條用來轉(zhuǎn)移催化劑和基底表面聯(lián)結(jié)劑， 如圖1 4 。合成時(shí)整個(gè)噴印頭利用三維精密移動(dòng)系統(tǒng)在芯片上移動(dòng)，根據(jù)芯片上 不同位點(diǎn)的序列需要將特定的堿基噴印到芯片的特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原 理和傳統(tǒng)的d n a 固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學(xué)試劑。 相對(duì)于傳統(tǒng)的光化學(xué)合成法的耗時(shí)、昂貴，點(diǎn)合成法合成過程簡(jiǎn)單、設(shè)備廉 第一章緒論 價(jià)、并且能在一天內(nèi)完成芯片的設(shè)計(jì)、合成、雜交反應(yīng)和掃描。但是點(diǎn)合成法所 制備的芯片探針數(shù)量較少( 大約9 8 0 0 個(gè)) ，這樣使其應(yīng)用有一定的局限性。 嘲：i 瞞 圖1 4p o s a m 系統(tǒng)實(shí)物圖，圖片復(fù)制自文獻(xiàn)【2 6 】 1 2 1 3 微電子刻蝕技術(shù)合成法【2 8 】 微電子刻蝕技術(shù)主要指利用集成電路工藝中的氧化、化學(xué)氣相沉積、蒸發(fā)、 濺射、光刻、腐蝕等一系列技術(shù)預(yù)先構(gòu)建陣列小坑，這些小坑就是d n a 反應(yīng)池。 然后在小坑內(nèi)包被氨基硅烷或多聚賴氨酸，使其帶上正電荷，以吸附帶負(fù)電的堿 基。合成時(shí)按探針上預(yù)定的堿基種類，將芯片浸入該種類的堿基溶液中，每浸入 一次，就增加一個(gè)堿基。同樣是采用屏蔽掩模系統(tǒng)和光敏覆蓋物，重復(fù)操作就可 以合成所需要的探針( 圖1 5 ) 。 該方法重復(fù)操作性好，有利于大批量生產(chǎn)，此外，該方法采用電化學(xué)檢測(cè)方 法，避免使用龐大而又昂貴的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)，有利于發(fā)展芯片實(shí)驗(yàn)室。 但是目前來看，這種集成的電化學(xué)檢測(cè)單元的靈敏度、可信度還有待于發(fā)展。 螺 竹 a 圖1 5 ( a ) ，微流路版 到局部示意圖。( b ) ，點(diǎn)陣版圖局部示意圖。 圖片復(fù)制自文獻(xiàn)【2 8 】 9 廈門大學(xué)工學(xué)碩士學(xué)位論文 l 214 分子印章法 分子印章法是由東南大學(xué)吳健雄實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的【2 9 3 3 1 ，其原理如圖1 6 所示。 他們?cè)O(shè)計(jì)了一臺(tái)在片壓印半自動(dòng)合成d n a 芯片的裝置，即采用分子印章方法多 次壓印原位定點(diǎn)d n a 合成制備基因芯片。該方法首先根據(jù)所需制備的寡核苷酸 微陣列設(shè)計(jì)并制備出一組不同圖形有凹凸的微印章，然后根據(jù)預(yù)先的設(shè)計(jì)在制備 印章上涂布對(duì)應(yīng)的單核苷酸，最后按照設(shè)計(jì)的順序依次壓印在同一基片表面。利 用可以自動(dòng)進(jìn)行清洗和脫保護(hù)、氧化及封閉等化學(xué)反應(yīng)的液體流動(dòng)池，按照設(shè)計(jì) 的序列進(jìn)行原位d n a 合成。每次壓印后，基片表面的化學(xué)基團(tuán)被重新激活，進(jìn) 入下一次壓印，在基片表面的活性基團(tuán)上連接新的化學(xué)基團(tuán)。通過一系列可控的 壓印過程，最終得到所需要的序列長(zhǎng)度寡核苷酸微陣列。 分子印章法采用商品化的十分成熟的d n a 合成試劑，進(jìn)行d n s 探針的原 位合成，可節(jié)省原料成本和縮短研發(fā)周期。該方法利用的軟光刻技術(shù)使得制備的 硅橡膠分子印章分辨率很高，可以達(dá)到亞微米量級(jí)。 不過目前分子印章法原位合成只是在化學(xué)合成原理上可行，實(shí)際應(yīng)用中還遠(yuǎn) 遠(yuǎn)不夠，而且其所合成的探針也由于合成效率的影響只能很短( 目前只成功的合 成了2 0 m e r 的寡核苷酸) 。 刪咖。 輜a ：西_ 茵寶髓a gc t 至 刪。斛| 四十黌至 刪鼬叫；豳；霸主， 圖1 6 分子印章原位合成芯片流程圖 1 0 一碉 粕田 第一章緒論 1 2 2 合成后微點(diǎn)樣法 合成后微點(diǎn)樣法是采用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法預(yù)先合成所需的d n a 探 針，然后再通過特定的高速精密機(jī)械手將探針直接點(diǎn)在芯片上。常用的機(jī)械手有 一套計(jì)算機(jī)控制的三維移動(dòng)裝置，多個(gè)點(diǎn)樣頭、一個(gè)減震底座，上面可放內(nèi)盛探 針的多孔板和多張芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置， 打印噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。根據(jù)探針轉(zhuǎn)移時(shí)針 頭有無與芯片接觸分為接觸式點(diǎn)樣和非接觸式噴點(diǎn)兩種【州。 1 2 2 1 非接觸式噴點(diǎn)( n o n c o n t a c ti n k j e tp r i n t i n g ) 3 5 】 非接觸式噴點(diǎn)原理與工業(yè)噴墨印刷機(jī)相同，將探針樣品放入印刷針頭，然后 移動(dòng)基底( 或針頭) 的位置，來自印刷頭的探針樣品經(jīng)加壓后通過小口噴射到基片 表面( 圖1 7 ) 。非接觸式噴點(diǎn)法優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)，缺點(diǎn) 是噴印斑點(diǎn)大，探針用量大，制作的陣列密度低。根據(jù)加壓方式不同和噴頭不同 又可細(xì)分如下幾種。 翠蘭可蘭孥! 竺 圖1 7 非接觸模式點(diǎn)樣工作流程圖，圖片復(fù)制白文獻(xiàn)【8 】 壓電技術(shù)( p i e z o e l e c t r i ct e c h n o l o g y ) 3 5 】 壓電技術(shù)是用一個(gè)壓電晶體接通液休貯罐，樣品從中吸出，當(dāng)晶體加上偏壓 時(shí)，偏壓引起晶體變形，擠壓玻璃毛細(xì)管，從針尖射出少量液休( 圖1 8 ) 。 壓電技術(shù)精度與噴頭的口徑大小和表面張力密切相關(guān)，一般壓電噴管噴射體 積在皮升范圍內(nèi)，每秒可達(dá)1 0 0 0 - - 5 0 0 0 滴。此技術(shù)缺點(diǎn)在于其管口容易堵塞， 容易有氣泡存在使得噴射不連續(xù)。 注射螺旋管技術(shù)( s y r i n g es o l e n o i dt e c h n o l o g y ) 3 6 , 3 7 】 注射螺旋管技術(shù)通過高分辨率注射器泵和微螺旋線管閥門有機(jī)結(jié)合來精確 控制噴射液滴，能提供納升級(jí)的定量分配。高分辨的注射泵連接高速微螺旋閥和 廈門大學(xué)工學(xué)碩士學(xué)位論文 儲(chǔ)液槽。注射器連接微螺旋閥，推動(dòng)注射器使樣品朝上移動(dòng)到針尖，注射器給系 統(tǒng)加壓打開微螺旋閥，使液滴注射到基片表面( 圖1 9 ) 。 圖1 8 壓電晶體圍繞著玻璃毛細(xì)管 的壓電分配器，圖片復(fù)制自文獻(xiàn)p 4 】 圖1 9 由高分辨注射泵連接一個(gè)高速螺 旋閥組成的注射螺旋管噴墨分配器圖片 復(fù)制自文獻(xiàn) 3 4 】 氣泡噴射法( b u b b l ej e 0 c a n o n 公司提出的氣泡噴射法在探針樣品的引入和噴射方式不剛3 “。該法 先在噴頭內(nèi)加入樣品，再通過加熱器產(chǎn)生固定大小的氣