（發(fā)酵工程專業(yè)論文）自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化.pdf

白養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 摘要 硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體改善 廢水脫氮以及富營養(yǎng)化湖泊治理中均有很好的 應(yīng)用前景 目前 硝化細(xì)菌制劑已應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中 但國內(nèi)外的此類產(chǎn)品種類較 少 且存在應(yīng)用效果不佳 價格過高等問題 急需開發(fā)應(yīng)用效果更好 價格低廉的 硝化細(xì)菌制劑 而在廢水脫氮和治理富營養(yǎng)化水體領(lǐng)域 尚沒有將硝化細(xì)菌制劑實 際應(yīng)用的實例 本課題從污水處理廠的活性污泥 湖泊底泥 土壤等環(huán)境中分離篩選出2 個有 較好氨氧化能力的氨氧化細(xì)菌混合體a t 6 a t 7 1 個有較好亞硝酸氧化能力的亞 硝酸氧化細(xì)菌混合體y 3 2 它們都未能得到純培養(yǎng) 通過1 6 s r r n a 序列分析結(jié)合 細(xì)菌電鏡形態(tài)鑒定出a t 6 a t 7 含有n i t r o s o m o n a s 屬的氨氧化細(xì)菌 y 3 2 含有 n i t r o b a c t e r 屬的亞硝酸氧化細(xì)菌 由于a t 6 和a t 7 的硝化能力相當(dāng) 故選擇a t 7 和y 3 2 進(jìn)行后續(xù)的研究 考察了它們連續(xù)傳代的穩(wěn)定性以及對葡萄糖和蛋白胨的耐受能力 結(jié)果發(fā)現(xiàn) a t 7 和y 3 2 的連續(xù)傳代過程中硝化速率基本穩(wěn)定 對葡萄糖和蛋白胨的耐受性均比 文獻(xiàn)報道的純種硝化細(xì)菌更好 有一定的應(yīng)用可能性 隨后 在玻璃水缸中 將a t 7 和y 3 2 以1 o 1 0 5 c f u m l 的投菌量應(yīng)用到模擬養(yǎng) 殖水和富營養(yǎng)化湖泊水體中 結(jié)果表明 y 3 2 在兩種水體中均有很好去除亞硝酸 鹽的能力 在含1 0 m g l 的n 0 2 n 的模擬養(yǎng)殖水中 投菌8 天內(nèi) n 0 2 n 的去除率 達(dá)7 8 8 在富營養(yǎng)化湖水中 投菌組水體亞硝態(tài)氮濃度較對照低0 4 1 m g l a t 7 在兩種水體中應(yīng)用效果不佳 可能原因是該菌不適應(yīng)低濃度的氨氮 關(guān)鍵詞 氨氧化細(xì)菌 亞硝酸氧化細(xì)菌 分離 純化 應(yīng)用 f 扛中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆碩1 j 學(xué)位論義 a b s t r a c t n i t r i f y i n g b a c t e r i ai su s e di na q u a c u l t u r e w a s t e w a t e rn i t r o g e nr e m o v a la n d e u t r o p h i c a t i o n l a k e sr e s t o r a t i o n sh a v eg o o da p p l i c a t i o np r o s p e c t s a tp r e s e n t t h e n i t r i f y i n gb a c t e r i aa g e n t sh a v eb e e na p p l i e dt oa q u a c u l t u r e b u tt h et y p e so fs u c hp r o d u c t s a r el e s sa n dm a n yo ft h e mh a sp o o ra p p l i c a t i o np e r f o r m a n c e s h i g hp r i c e sa n ds oo n i ti s u r g e n tn e e dt od e v e l o pa n da p p l ys o m eb e t t e ra n dc h e a p e rn i t r i f y i n gb a c t e r i aa g e n t s i n t h ea r e a so ft h ew a s t e r w a t e rn i t r o g e nr e m o v a la n de u t r o p h i c a t i o nl a k e sr e s t o r a t i o n i l i t r i f y i n gb a c t e r i aa g e n t sa r es t i l lh a sn o tp r a c t i c a la p p l i c a t i o n t h i sr e s e a r c hf r o ms e w a g et r e a t m e n tp l a n ta c t i v a t e ds l u d g e s l a k es e d i m e n t s s o i l e t c n i c h e ss e p a r a t et w oc o m p o u n d e rw h i c hc o n t a i na m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i an a m e d a t 6 a t 7 o n ec o m p o u n d e rw h i c hc o n t a i nn i t r a t e o x i d i z i n gb a c t e r i an a m e dy 3 2 b u tt h e t h r e ec o m p o u n d e r sc o u l d n t p u r i f i e d t h r o u g h16 s r r n as e q u e n c ea n a l y s i sa n dt h e m o r p h o l o g yo fb a c t e r i ai d e n t i f i e db ye l e c t r o nm i c r o s c o p y a t 6 a t 7w e r ei d e n t i f i e d b e l o n gt ot h eg e n u sn i t r o s o m o n a so fa m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i a y 3 2w a sb e l o n gt o t h eg e n u sn i t r o b a c t e ro fn i t r i t e o x i d i z i n gb a c t e r i a a t 6a n da t 7w e r en o td i f f e r e n c ei n n i t r i f i c a t i o nc a p a c i t y s oc h o s e a n dy 3 2t od ot h ef o l l o w u ps t u d y t h e yw e r ei n v e s t i g a t e dt h es t a b i l i t yi nc o n t i n u o u st r a n s f e rc u l t u r ea n dt h et o l e r a n c e t og l u c o s ea n dp e p t o n e t h er e s u l t sw e r et h a ta t 7a n dy 3 2h a dg o o ds t a b i l i t yi n c o n t i n u o u st r a n s f e rc u l t u r ea n dt h e yh a db e t t e rt o l e r a n c et o g l u c o s ea n dp e p t o n et h a n p u r i f i e dn i t r i f y i n gb a c t e r i a t h e yh a dac e r t a i np o s s i b i l i t yi na p p l i c a t i o n s u b s e q u e n t l y p u ta t 7a n dy 3 2i n t ot h es i m u l a t e da q u a c u l t u r ew a t e ra n de u t r o p h i c l a k ew a t e ra tt h eb a c t e r i ac o n c e n t r a t i o n1 0 x10 5 c f u m li n g l a s s t a n k si nt h e l a b o r a t o r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t y 3 2i nt h et w ok i n d so fw a t e rb o d i e sh a db o t hg o o d a b i l i t yt or e m o v en i t r i t e i ns i m u l a t e da q u a c u l t u r ew a t e rc o n t a i n i n g10 m g lo fn 0 2 n n 0 2 一nr e m o v a lr a t ew a s7 8 8p e r c e n ta f t e r8d a y su s et h eb a c t e r i a i nt h ee u t r o p h i cl a k e w a t e r t h en i t r i t ec o n c e n t r a t i o nw a s0 4 8 m g li nt h ew a t e ru s eb a c t e r i a t h en i t r i t e c o n c e n t r a t i o nw a so 8 9 m e 扎i nc o n t r o l a t 7i nt h et w ok i n d so fw a t e rb o d i e sh a d n tg o o d p e r f o r m a n c e s t h er e a s o nm a yb et h a ta t 7w a sn o ts u i t a b l e i nl o wc o n c e n t r a t i o n a m m o n i a k e y w o r d s a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i a n i t r i t e o x i d i z i n gb a c t e r i a i s o l a t i o n p u r i 矽i n g a p p l i c a t i o n l i 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書 學(xué)位論文 危 如需保密 解密時間年月日 是否保密 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研 究成果 盡我所知 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外 論文中不包含其他 人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果 也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu) 的學(xué)位或證書而使用過的材料 指導(dǎo)教師對此進(jìn)行了審定 與我一同工作的同志 對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明 并表示了謝意 研究生簽名 關(guān)丑 時間 加口 年名月 力日 學(xué)位論文使用授權(quán)書 本人完全了解華中農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于保存 使用學(xué)位論文的規(guī)定 即學(xué)生必須按 照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本 學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印刷版 和電子版 并提供目錄檢索和閱覽服務(wù) 可以采用影印 縮印或掃描等復(fù)制手段 保存 匯編學(xué)位論文 本人同意華中農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表 傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容 并授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所和北京萬方數(shù) 據(jù)股份有限公司將本人學(xué)位論文收錄到 中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 并進(jìn)行信 息服務(wù) 包括但不限于匯編 復(fù)制 發(fā)行 信息網(wǎng)絡(luò)傳播等 同時本人保留在 其他媒體發(fā)表論文的權(quán)力 注 保密學(xué)位論文 即涉及技術(shù)秘密 商業(yè)秘密或申請專利等潛在需要提交保 密的論文 在解密后適用于本授權(quán)書 學(xué)位論文作者簽名 笑乞了導(dǎo)師簽名 j 墨參呼 簽名日期 少叻7 年6 月 2 日簽名日期 2 o 0 7 年 占月 2 日 l 注 請將本表直接裝訂在學(xué)位論文的扉頁和目錄之間 自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 1 日i j 舌 硝化細(xì)菌 n i t r i f y i n gb a c t e r i a 是一類廣泛存在于自然界 在地球氮素循環(huán)中 起到重要作用的微生物 1 8 9 1 年由著名微生物學(xué)家w i n o g r a d s k y 首次從土壤中分離 純化得到營無機(jī)化能自養(yǎng)生活的硝化細(xì)菌 并隨后證明硝化作用由氨氧化細(xì)菌 a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i a a o b 和亞硝酸氧化細(xì)菌 n i t r i t e o x i d i z i n gb a c t e r i a n o b 這兩個不同生理類群的細(xì)菌共同完成 a o b 將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽 n o b 進(jìn)一步將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽 兩者共同完成將氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的過程 整個 過程被稱之為硝化過程 c h 維諾格拉德斯基 1 9 6 2 從此 關(guān)于硝化細(xì)菌的研究 就不斷開展起來 1 1 硝化細(xì)菌 通常人們所說的硝化細(xì)菌都是指自養(yǎng)硝化細(xì)菌 因為最早被分離的能起硝化作 用的細(xì)菌均是化能自養(yǎng)細(xì)菌 而實際上有些異養(yǎng)微生物也能起硝化作用 包括霉菌 放線菌和細(xì)菌的很多種 朱兆良和文啟孝 1 9 9 0 異養(yǎng)硝化微生物在很長一段時間 內(nèi)不被重視 因為異養(yǎng)硝化微生物的硝化能力普遍較弱 硝化速率只有自養(yǎng)硝化細(xì) 菌的1 1 0 3 一 1 1 0 6 一般認(rèn)為自然界中的硝化作用主要是由自養(yǎng)硝化細(xì)菌完成的 1 1 1 自養(yǎng)硝化細(xì)菌 自養(yǎng)硝化細(xì)菌是一類可以以c 0 2 為唯一碳源 通過氧化n h 4 到n 0 2 或氧化 n 0 2 到n 0 3 的過程獲取能量的化能自養(yǎng)細(xì)菌 其主要生理特征 鄭士民和顏望明 1 9 8 3 r e 布坎南 n e 吉本斯 1 9 8 4 女i 下 1 硝化細(xì)菌的大多數(shù)種類都是專性化能自養(yǎng)菌 除維氏硝化桿菌 n i t r o b a c t e r w i n o g r a d s k y 中的某些菌株能同化乙酸鹽 進(jìn)行兼性自養(yǎng)生長外 其它種類幾乎都 不能在有機(jī)培養(yǎng)基上生長 也不需要外源生長因子 并且a o b 和n o b 這兩個生理 亞群對底物的要求非常專一 a o b 以氨為底物 n o b 以亞硝酸鹽為底物 2 硝化細(xì)菌的生長速度非常緩慢 平均代時1 0 h 以上 3 硝化細(xì)菌均為專性好氧茵 以0 2 為最終電子受體 4 無芽孢 有復(fù)雜的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 均是g 一細(xì)菌 5 大多數(shù)情況下以二分裂繁殖 但維氏硝化桿菌 n i t r o b a c t e r w i n o g r a d s k y 牛中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆頌i 學(xué)位論文 有一極型細(xì)胞生長并以出芽繁殖 6 對溶氧 溫度 p h 等外界因素的變化反應(yīng)敏感 易受外界環(huán)境影響 1 1 2 異養(yǎng)硝化細(xì)菌 雖然異養(yǎng)硝化細(xì)菌的硝化能力較自養(yǎng)硝化細(xì)菌弱很多 但是異養(yǎng)硝化細(xì)菌具有 生長速度快 能耐受酸性環(huán)境以及可以將有機(jī)氮直接轉(zhuǎn)化為硝酸鹽或氮氣等優(yōu)點 所以近年來有關(guān)異養(yǎng)硝化細(xì)菌的研究正成為生物脫氮領(lǐng)域的一個熱點 溫東輝和唐 孝炎 2 0 0 3 下表l 列出了目前已分離到的異養(yǎng)硝化細(xì)菌的一些種屬 k u e n e na n dr o b e r t s o n 1 9 9 4 1 2 硝化細(xì)菌的分類 到目前為止 已知的無機(jī)化能自養(yǎng)硝化細(xì)菌均不能將氨直接氧化成硝酸鹽 將 氨氧化成硝酸鹽 需要由a o b 和n o b 共同完成 傳統(tǒng)分類學(xué)將a o b 和n o b 全 部歸入硝化桿菌科 n i t r o b a c t e r a c e a e 而a o b 和n o b 是硝化桿菌科內(nèi)的兩個生 理亞群 r e 布坎南 n e 吉本斯 19 8 4 近年來 隨著分子生物學(xué)發(fā)展 通過對已分離純化的硝化細(xì)菌的1 6 sr r n a 的 序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn) a o b 和n o b 不屬于同一類 他們分屬于變形菌門 p r o t e o b a c t e r i a 的0 l d 6 的四個亞門 分子進(jìn)化還暗示硝化細(xì)菌的不同種 由不同生理特征的祖先進(jìn)化而來 t e s k ee ta 1 1 9 9 4 1 氨氧化細(xì)菌的分類 氨氧化細(xì)菌分為亞硝化單胞菌屬 n i t r o s o m o n a s 亞硝化螺旋菌屬 n i r r o s o s p i r a 亞硝化弧菌屬 n i t r o s o v i b r i o 亞硝化葉菌屬 n i t r o s o l o b u s 以 及亞硝化球菌屬 n i t r o s o c o c c u s 共5 個屬 每個屬代表性菌株的形態(tài)特征見下表 2 所示 k o o p s p o m m e r e n i n g r 6 s e r 2 0 0 5 2 亞硝酸氧化細(xì)菌的分類 亞硝酸氧化細(xì)菌分為硝化桿菌屬 n i t r o b a c t e r 硝化球菌屬 n i 折o c o c c u s 硝化刺菌屬 n i t r o s p i n a 以及硝化螺菌屬 n i t r o s p i r a 共4 個屬 每個屬代表性菌 株的形態(tài)特征見下表3 所示 s p i e c ka n db o c k 2 0 0 5 2 自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 1 3 硝化細(xì)菌的分布 硝化細(xì)菌廣泛的分布在自然界的各種生境中 特別是在有機(jī)質(zhì)含量比較低 有 無機(jī)氮存在的環(huán)境中更加常見 硝化細(xì)菌常見于以下生境 河流 淡水湖泊 咸水 湖泊 海洋 微咸水 污水處理廠的活性污泥 巖石表面和表層土壤等 d eb o e re ta 1 1 9 9 1 h a n s p e t e rk o o p s 2 0 0 1 有些種的硝化細(xì)菌只能存活在含一定量鹽的環(huán)境 中 有些硝化細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)能在低氧甚至缺氧的環(huán)境中存在 v o y t e ke ta 1 1 9 9 9 特 別的是 在水體環(huán)境中 氨氧化細(xì)菌通常聚集成團(tuán)或者形成生物膜 s t c h re t a 1 1 9 9 5 表1 已分離到部分異養(yǎng)硝化細(xì)菌 t a b l1t h es p e c i e so fh e t e r o t r o p h i cn i t r i f y i n gb a c t e r i a 華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆碩 6 位論文 宰該菌可以同時反硝化至n 2 0 或n 2 表2 氨氧化細(xì)菌的種屬及形態(tài)特征 t a b l e2d i f f e r e n t i a t i o no ft h eg e n e r ao ft h el i t h o a u t o t r o p h i ca m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i a 表3 亞硝酸氧化細(xì)菌的種屬及形態(tài)特征 t a b l e3d i f f e r e n t i a t i o no ft h eg e n e r ao ft h ef i t h o a u t o t r o p h i cn i t r i t e o x i d i z i n gb a c t e r i a 4 白養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 1 4 硝化細(xì)菌的分離 由于硝化細(xì)菌特別慢的生長速度 實驗室測定的最短代時 亞硝化單胞菌為7 1 1 硝化桿菌為l o h f i e n c k ee ta 1 2 0 0 5 而且在長時間的培養(yǎng)過程中又容易染菌 所以使硝化細(xì)菌的分離變得非常困難 這也是制約硝化細(xì)菌研究和應(yīng)用的主要問 題 通常情況下 分離純種硝化細(xì)菌需要耗時數(shù)月至一年以上 硝化細(xì)菌的分離方法主要有以下幾種 1 硅膠平板分離法 先通過純無機(jī)培養(yǎng)基富集硝化細(xì)菌 然后將富集液稀 釋涂布硅膠平板 這種方法的流程較簡單 重點在于富集 難點在于硅膠平板的制 作 由于異養(yǎng)雜菌的生長速度遠(yuǎn)快于硝化細(xì)菌 所以富集培養(yǎng)中往往含有大量異養(yǎng) 雜菌 進(jìn)一步的分離較困難 早期分離硝化細(xì)菌的研究者用這種方式較多 m e i k l e j o h n 1 9 5 0 后期研究者為了提高分離效率 在第一步富集結(jié)束后 再加一 步稀釋培養(yǎng) m p n 然后選擇最高稀釋倍數(shù)的陽性管進(jìn)行涂布硅膠平板 s o r i a n oa n d w a l k e r 19 6 8 a b e l i o v i c h 19 8 7 2 稀釋分離法 同樣是先富集 然后再用細(xì)菌計數(shù)板 或熒光直接計數(shù) 計數(shù)后稀釋到0 5 e f u m l 接種培養(yǎng) 這種方法被廣泛使用 b e l s e ra n ds c h m i d t 1 9 7 8 v o l s c he ta 1 1 9 9 0 另外 也有人用梯度離心的方法分離純化硝化細(xì)菌 e h r i e he ta 1 19 9 5 1 5 硝化細(xì)菌的計數(shù) 傳統(tǒng)的硝化細(xì)菌計數(shù)方法為m p n g r i e s s 即m p n m o s t p r o b a b l e n u m b e r 稀 釋培養(yǎng)結(jié)合g r i e s s s 試劑檢測硝化反應(yīng) 這種方法被廣泛應(yīng)用 是硝化細(xì)菌計數(shù)最 常用的方法 但這種方法耗時很長 而且計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性受培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)時 間長短的影響 b e l s e ra n ds c h m i d t 1 9 7 8 邱珊蓮和周易勇 2 0 0 8 沒有統(tǒng)一的標(biāo) 準(zhǔn)方法 f a f l u o r e s c e n ta n t i b o d y 法是一種利用血清學(xué)原理設(shè)計的計數(shù)方法 它的優(yōu) 點在于可以特異性的對樣品中特定種屬的硝化細(xì)菌進(jìn)行檢測 而且耗時短 不足之 處在于 1 在應(yīng)用該方法之前需要有多種純培養(yǎng)的硝化細(xì)菌作抗原 以便得到抗 體 2 檢測不同種類的硝化細(xì)菌需要不同的抗體 只有少數(shù)實驗室有能力做到 其廣泛應(yīng)用受限 k o o p se ta 1 2 0 0 6 3 存在假陽性和假陰性的結(jié)果 s z w e f i n s k ie t 5 華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆碩 學(xué)位論義 a 1 1 9 8 5 假陽性的出現(xiàn)是由于非特異性抗體與雜質(zhì)顆粒的結(jié)合導(dǎo)致的 假陰性的 出現(xiàn)是由于抗體大分子很難滲透到細(xì)菌聚合體或生物膜的內(nèi)部而導(dǎo)致的 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展 利用分子技術(shù)進(jìn)行硝化細(xì)菌的計數(shù)逐漸成為熱點 應(yīng) 用的較廣泛的有d d g e d e n a t u r i n gg r a d i e mg e le l e c t r o p h o r e s i s f i s h f l u o r e s c e n c e i ns i t uh y b r i d i z a t i o n 以及m p n p c r 技術(shù) 這些方法的共同點是基于細(xì)菌1 6 sr r n a 序列的不同從而區(qū)分不同種屬的硝化細(xì)菌并計數(shù) d g g e 是利用p c r 擴(kuò)增細(xì)菌的1 6 sr d n a 隨后用變形梯度凝膠對不同種細(xì)菌 的1 6 sr d n a 條帶進(jìn)行分離 它的優(yōu)點在于能快速檢測樣品中硝化細(xì)菌的種群和多 樣性 不足在于不能完全定量 是一種半定量檢測手段 而且檢測的準(zhǔn)確性受p c r 的偏好性影響 另外 其擴(kuò)增條帶的長度最大只有5 0 0 b p 左右 這樣限制了引物的 選擇范圍 f i s h 技術(shù)是利用帶熒光的特異性寡聚核苷酸探針結(jié)合目標(biāo)細(xì)菌的特定 區(qū)域的d n a 序列 從而能在熒光顯微鏡下直觀的看到樣品中特定種類硝化細(xì)菌的 數(shù)量及分布 優(yōu)點在于其直觀和定量計數(shù) 不足之處在于不能應(yīng)用到含較多不透明 顆粒的樣品和有較高自發(fā)熒光的樣品 k o o p se ta 1 2 0 0 6 m p n p c r 技術(shù)是利用 m p n 的方式稀釋樣品總d n a 然后針對硝化細(xì)菌特異性d n a 序列進(jìn)行p c r 擴(kuò)增 利用擴(kuò)增結(jié)果查m p n 表計數(shù)硝化細(xì)菌 其優(yōu)點是快速定量檢測 不足之處在于檢 測結(jié)果受p c r 的偏好性影響 應(yīng)用不成熟 目前只限于用在n o b 的檢測 f 6 r a ye ta 1 1 9 9 9 馬成e ta 1 2 0 0 8 1 6 硝化作用機(jī)理 1 氨氧化為亞硝酸 將氨氧化為亞硝酸鹽的過程由氨氧化細(xì)菌完成 整個過程分2 步 第一步n h 3 被氧化為n h 2 0 h 羥胺 主要由氨單加氧化酶 a m o 催化完成 第二步n h 2 0 h 被氧化為h n 0 2 主要由羥胺氧化還原酶 h a o 催化完成 反應(yīng)方程式如下所示 n h 3 2 h 2 e 一 0 2 二竺竺n h e o h h 2 0 n h 2 0 h h 2 0 蘭竺 h n 0 2 一 4 e 一 2 h 2 e 一 o 5 0 2 h20 2 總 n h 3 妄 0 2 n 0 2 一 h r n 2 0 z 氨單加氧化酶 a m o 是膜內(nèi)酶 a m o 含c u 對硫脲等金屬螯合劑敏感 6 白養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 a m o 能利用多種基質(zhì) 除氨以外 n e u r o p a e a 還可將甲烷氧化為甲醇 h y m a n w o o d 1 9 8 3 乙烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧丙烷 環(huán)己烷轉(zhuǎn)化為環(huán)己醇 苯轉(zhuǎn)化為苯酚 c o 轉(zhuǎn) 化為c 0 2 酚轉(zhuǎn)化為醌 這些基質(zhì)既可與氨競爭a m o 活性部位 也可與氨競爭還 原劑 因而對氨的生物氧化有抑制作用 乙炔是一種自殺性基質(zhì) 能使a m o 結(jié)構(gòu) 破壞而永久性失活 h y m a na n dw o o d 1 9 8 5 n e u r o p a e a 的羥胺氧化還原酶 h a o 已被分離純化 該酶位于細(xì)胞外周質(zhì)中 h a o 僅含一種分子量為6 3 k d 的亞單位 但結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜 呈睨或 寡聚形式 每個亞單位由8 個共價結(jié)合的血紅素組成 其中7 個為c 型血紅素 第8 個為p 4 6 0 血紅素 它結(jié)合在以橋鍵相聯(lián)的肽上 p 4 6 0 是h a o 的特有組分 被認(rèn)為是該酶的 活性中 d a r c i e r oe ta 1 1 9 9 3 2 亞硝酸氧化為硝酸 將亞硝酸氧化為硝酸的過程由亞硝酸氧化細(xì)菌完成 整個反應(yīng)沒有中間產(chǎn)物 一步完成 最終電子受體為0 2 在硝化桿菌屬的細(xì)菌中催化該反應(yīng)的酶為亞硝酸氧 化還原酶 n o r 其它屬的細(xì)菌催化該反應(yīng)的為亞硝酸氧化系統(tǒng) n i t r i t eo x i d i z i n g s y s t e m n o s 反應(yīng)方程式如下 n 0 2 h 2 0 n 0 3 2 i i 2 e 一 2 w 2 e 一 o 5 0 2 1 4 2 0 總 n 0 2 一 0 5 0 2 n 0 3 一 研究得比較清楚的是n i t r o b a c t e r 的n o r 其基本性質(zhì) f r e i t a ge ta 1 1 9 8 7 如下 它與細(xì)胞膜緊密結(jié)合 分子量為3 6 0 k d 亞單位構(gòu)成形式 毗b 2 薩1 1 5 k d b 6 4 k d 含m o f e s 蛋白 1 7 硝化活性的影響因素 1 溶解氧 d o 硝化細(xì)菌正常代謝需要溶解氧 每m g 氮經(jīng)過整個硝化作用途徑后 由氨轉(zhuǎn)化 為硝酸根 最大需要消耗4 5 7 m g 溶解氧 在活性污泥硝化系統(tǒng)中 大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為溶氧應(yīng)控制在1 5 2 0 m g l 低于 0 5 m g l 則硝化作用趨于停止 一般而言 為了確保硝化作用徹底進(jìn)行 要求硝化 系統(tǒng)中的溶解氧保持在2 m g l 以上 b e c c a r ie ta 1 1 9 9 2 通常情況下 高的溶氧不 7 華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆顧 1 j 學(xué)位論文 會抑制硝化細(xì)菌 而較低的溶氧對硝化細(xì)菌有抑制作用 有很多學(xué)者認(rèn)為氨氧化細(xì)菌是兼性厭氧性類群 而硝酸細(xì)菌則是絕對好氧類群 朱兆良 文啟孝 1 9 9 0 王歆鵬 陳堅等也發(fā)現(xiàn)低的d o o 8 m g l 會對亞硝酸 氧化細(xì)菌生長酶系產(chǎn)生抑制作用 而對氨氧化細(xì)菌的生長酶系則會起到促進(jìn)作用 王 歆鵬等 1 9 9 9 2 溫度 溫度對硝化細(xì)菌的硝化速率有較大影響 一般的硝化細(xì)菌是中溫生長菌 最適 生長溫度為2 5 一3 0 c 不同種屬的菌適宜生長溫度范圍略有差異 r e 布坎南 n e 吉本斯 1 9 8 4 g r t m d i t z 的實驗表明 n i t r o s o m o n a s 的最適生長溫度為3 5 n i t r o b a c t e r 的最 適生長溫度為3 8 c g n m d i t z d a l h a m m a r 2 0 0 1 王歆鵬 陳堅等利用n i t r o s o m o n a s 和n i t r o b a c t e r 考察其在不同溫度下混合發(fā)酵時的生長速率 結(jié)果表明3 0 為最適 生長溫度 王歆鵬等 1 9 9 9 張偉對硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)時考察不同溫度對其硝化速 率的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 8 一 3 0 為最適生長溫度 張偉 2 0 0 2 通常情況下 選擇培養(yǎng)硝化細(xì)菌的溫度為3 0 3 p h p h 值是影響硝化作用的重要因素之一 硝化細(xì)菌喜歡偏堿性的環(huán)境 通常情 況下 a o b 的適宜p h 為7 8 8 0 而n o b 的適宜p h 為7 3 7 5 當(dāng)p h 7 0 時 a o b 的生長緩慢 當(dāng)p h 6 5 時 其生長受到抑制 當(dāng)p h 6 0 時 系統(tǒng)中硝化作 用就會停止 鄭士民和顏望明 1 9 8 3 p h 值和溫度決定了非離子態(tài)氨 n h 3 在總氨氮中的比例 非離子態(tài)氨 n h 3 是a o b 的真正底物 非離子態(tài)氨 n h 3 濃度過低則不能滿足a o b 的需要 濃度 過高則會抑制a o b 的生長 a n t h o n i s e ne ta 1 1 9 7 6 a n t h o n i s e n 認(rèn)為 當(dāng)p h 為9 時 溶液中僅3 0 m g l 的氨氮即可產(chǎn)生抑制 當(dāng)p h 為7 時 則需要2 0 0 0 m g l 的氨 氮才可以達(dá)到同樣的抑制效果 王歆鵬 陳堅等的實驗則表明產(chǎn)生抑制的濃度要遠(yuǎn) 高于3 0 m g l 4 有機(jī)質(zhì) 對于無機(jī)化能自養(yǎng)硝化細(xì)菌而言 有機(jī)質(zhì)對其影響一直是人們爭論的焦點 最 早開展硝化細(xì)菌研究的w i n o g r a d s k y 認(rèn)為有機(jī)質(zhì)對硝化細(xì)菌有直接的毒害作用 他 的系列實驗結(jié)果表明 在純培養(yǎng)情況下 葡萄糖 蛋白胨等對硝化細(xì)菌有毒害作用 8 白養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 c h 維諾格拉德斯基 1 9 6 2 但隨后的研究表明 少量的有機(jī)質(zhì)不僅不會起抑制 作用 反而會促進(jìn)硝化細(xì)菌的生長 s t e i n m i i l l e r b o e k 1 9 7 6 k r t i m m e l h a r m s 1 9 8 2 張偉 2 0 0 2 在有機(jī)質(zhì)濃度比較高的環(huán)境中 硝化細(xì)菌的生長往往受抑制 現(xiàn)在有 學(xué)者認(rèn)為這是異養(yǎng)菌利用有機(jī)質(zhì)生長而消耗溶氧 氨氮以及微量金屬元素從而對硝 化細(xì)菌產(chǎn)生了間接的抑制作用的結(jié)果 n a n a k ie ta 1 1 9 9 0 s t r a u s sa n dl a m b e r t i 2 0 0 2 5 光照 氨氧化細(xì)菌對近紫外波段很敏感 其原因可能與細(xì)胞膜上的氧產(chǎn)生超氧化物游 離基有關(guān) 但對于這一波段的光對氨氧化細(xì)菌產(chǎn)生負(fù)面影響的確切原因尚不清楚 g u e r r e r oa n dj o n e s 1 9 9 9 對于那些受光照影響的氨氧化細(xì)菌 應(yīng)及時的將其轉(zhuǎn) 移到暗處 并提供足夠的供能物質(zhì) 大約需要幾個小時它們可能修復(fù) 因此 通常情況下 硝化細(xì)菌的培養(yǎng)和保藏都是避光的 6 抑制劑 很多化學(xué)物質(zhì)能對硝化細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用 如a t u 烯丙基硫脲 乙炔 重 金屬 金屬螯合劑 尤其是與c u 螯合的 二硫化碳 游離氨 n h 3 2 氯 6 三 氯甲基吡啶 n i t r a p y i n 疊氮化鈉或鉀 氯酸鈉和鉀鹽等 下表4 列出了部分常用 的硝化細(xì)菌抑制劑 h a g o p i a na n dr i l e y 1 9 9 8 表4 常用硝化作用抑制劑 t a b l e4f r e q u e n t l yc k e dn i t r i f i c a t i o ni n h i b i t o r s 上n n l b l t o r1 e s c n d t t o n r r o c e s a l l y l t h i o u r e a2 p r o p e r t y l t h i o n r f a s o d i u ma z i j d cn 捌3 d 姒d i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t c a c e t y l e n ee t h y n e 隅h 1 1 a m m o n i an h l 1 0 l 1 5 0n a gl 一1 a m m o n i a n h 芝0 1 1 0m g1 1 n i t r o u sa c i dh n o 0 2 2 2 8m g1 1 s o d i u mc h l o r a t en a c l o 氣 n i t r i t i o n n i t r i f i o n n i t r i t i o n n i t r i t i o n n i t r i t i o n n i t r a t i o n n i t r a t i o n n i t r a t i o n 1 8 硝化細(xì)菌的應(yīng)用領(lǐng)域 目前 硝化細(xì)菌主要應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和廢水處理這兩大領(lǐng)域 下面將從這兩個 方面介紹現(xiàn)在硝化細(xì)菌在這兩個領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀 9 產(chǎn)中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆壩l 學(xué)位論義 1 8 1 硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用 隨著人們生活水平的日益提高 人們對河蟹 對蝦 鱉以及各種魚類的需求量 也逐漸增大 這也帶動了相關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展 然而 由于使用高密度養(yǎng)殖 大量人工投加餌料 使水體n h 3 n 和n 0 2 n 出現(xiàn)積累 經(jīng)常導(dǎo)致養(yǎng)殖動物的大量 死亡 如何快速有效地降低養(yǎng)殖水體中的n h 3 n 和n 0 2 n 避免出現(xiàn)積累 是水 產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)亟待解決的重要課題 硝化細(xì)菌制劑的應(yīng)用正好是解決這一問題的良 方 國內(nèi)外 已經(jīng)有不少將硝化細(xì)菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中的報道 潘良坤等人將硝化 細(xì)菌制劑應(yīng)用到對蝦養(yǎng)殖池 結(jié)果發(fā)現(xiàn)n h 3 n 和n 0 2 n 在幾天內(nèi)都大幅降低 潘良 坤e ta 1 2 0 0 4 梁擁軍等人將硝化細(xì)菌應(yīng)用到澳洲銀鱸工廠化養(yǎng)殖中 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 投菌組明顯較對照組的n h 3 n 和n 0 2 n 低 但硝化作用在投菌4 5 d 之后才顯現(xiàn) 梁 擁軍e ta 1 2 0 0 9 張明將硝化細(xì)菌應(yīng)用到河蟹人工育苗池中 結(jié)果使水體氨氮保 持在0 5 m g l 以下 明顯優(yōu)于對照苗池 且蟹苗成活率和產(chǎn)量均比對照組高 張明 2 0 0 3 h s h a n 和j e o b b a r d 將固定化硝化細(xì)菌應(yīng)用到對蝦養(yǎng)殖水中 結(jié)果表明 在每天投加餌料負(fù)荷達(dá)3 2 m g t a n l 的情況下 總氨氮 t a n 能夠維持在 0 5 m g t a n l 以下 s h a na n do b b a r d 2 0 0 1 但是硝化細(xì)菌的產(chǎn)品目前還比較少 而且產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊 有許多產(chǎn)品實際 上并非純種自養(yǎng)硝化細(xì)菌 其降氨氮和亞硝態(tài)氮的能力十分有限 所以 開發(fā)高效 的純種自養(yǎng)硝化細(xì)菌產(chǎn)品仍然是一個需要努力的方向 1 8 2 硝化細(xì)菌在廢水處理中的應(yīng)用 將硝化細(xì)菌實際應(yīng)用到廢水處理中的報道還很少 大多數(shù)都只是在實驗室水平 的研究 但并未大規(guī)模應(yīng)用 張明采用硝化細(xì)菌強化掛膜的好氧生物濾池集和厭氧濾池反應(yīng)器在僅需水力 提升動力消耗的條件下 就可達(dá)到對不同進(jìn)水c o d 的城市生活污水的有效處理 對c o d 在4 0 0 m g l 左右的常規(guī)濃度城市生活污水 在增加回流后 容積負(fù)荷小于 0 1 5 k g b o d m 3 d 時 出水n h 3 n 即可達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn) 張明 2 0 0 3 葉笑風(fēng)采用e g s b 發(fā)酵 e g s b 內(nèi)同時反硝化 厭氧甲烷化 好氧內(nèi)循環(huán)生物接觸氧化一p e g 包埋固定化 硝化細(xì)菌的聯(lián)合廢水處理新工藝對九江酒廠的米酒廢水進(jìn)行了處理 廢水初始c o d l o 自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 為1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 m g l n h 4 一n 3 5 0 m g l t n 6 0 0 6 5 0 m g l 處理后出水n h 3 n 低于5 m g l c o d 和n h 3 n 的除去率分別達(dá)9 8 和9 9 葉笑風(fēng) 2 0 0 6 o 從目前實驗室水平的研究結(jié)果來看 將硝化細(xì)菌應(yīng)用到廢水處理領(lǐng)域中是可行 的 它可以顯著提高原有污水處理工藝的除氨氮能力 并通過強制掛膜或者包埋等 固定化方法可以有效解決硝化細(xì)菌生長速度慢的缺點 總之 硝化細(xì)菌在廢水處理 領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊 1 9 本課題的研究目的與意義 隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展 人們的飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生了很大變化 蛋白質(zhì)的比重 在人們的飲食分量中逐漸加大 隨之而來的問題是市政廢水以及湖泊 河流中的n 含量也在逐步升高 在廢水處理領(lǐng)域 傳統(tǒng)的廢水處理工藝和方法已經(jīng)很難使污水 處理的出水n h 3 n 和t n 達(dá)標(biāo) 急需生物強化脫氮的應(yīng)用 在富營養(yǎng)化水體治理領(lǐng) 域 將n 從水體移出是一種控制富營養(yǎng)化的重要手段 而n 在水體中的移出是依 靠硝化 反硝化過程完成的 硝化作用的快慢決定了n 移出的快慢 而硝化細(xì)菌在 該領(lǐng)域應(yīng)用尚屬空白 另外 在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)n h 3 n 和n 0 2 n 的積累問題一直是 該行業(yè)的 痼疾 硝化細(xì)菌的應(yīng)用被認(rèn)為是解決這個問題的關(guān)鍵 目前 雖然國內(nèi) 外均已有部分產(chǎn)品問世 但實際應(yīng)用過程中 仍然存在硝化效果不佳 不易長期保 存 成本過高等問題 本課題的目的就是在自然環(huán)境中篩選分離高效的無機(jī)自養(yǎng)硝化細(xì)菌 確定其種 屬及硝化特性 并初步研究其在養(yǎng)殖水體 富營養(yǎng)化水體中的應(yīng)用效果 為后期的 硝化細(xì)菌相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)做準(zhǔn)備 f 仁中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆碩l j 學(xué)位論文 2 材料與方法 2 1 材料 2 1 1 樣品 表5 分離硝化細(xì)菌所用樣品 t a b l e5t h es a m p l e su s e di nt h ee x p e r i m e n t s 1 2 白養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化 2 1 2 菌株 大腸桿菌d h 5 a e s c h e r i c h i ac o l id h 5 a 本實驗室保藏菌株 2 1 3 藥品與酶 二苯胺 磺胺酸 對氨基苯磺酸 0 萘胺 4 羥乙基哌嗪乙磺酸 h e p e s 鉬酸銨 硫酸銨 亞硝酸鈉 碳酸鈣 過硫酸鉀 進(jìn)口分析純 碘化汞 碘化鉀 氫氧化鈉 酒石酸鉀鈉 硫酸鋅 4 氨基苯磺酰胺 磺胺 n 1 萘基 乙二胺 二鹽酸鹽 吖啶橙 蘇丹黑 異丙基 p d 一硫代半乳糖苷 i p t g 5 一溴 4 氯 3 吲哚一p d 一 半乳糖苷 x g a l 氨芐青霉素 a m p i c i l l i n 硫酸鏈霉素 s t r e p t o m y c i ns u l f a t e 瓊脂糖 進(jìn)口分析純 以上藥品除特殊說明外均為化學(xué)分析純 t a q 酶 d n t p t v e c t o r 試劑盒 t a k a r a 公司 細(xì)菌基因組d n a 提取試劑盒 t i a n g e n p c r 產(chǎn)物純化試劑盒 愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司 b 型質(zhì)粒小量快速 提取試劑盒 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司 引物合成由英駿 i n t r o g e n 公司完成 2 1 4 試劑 2 1 4 1 亞硝酸鹽 n 0 2 n 定性檢測試劑 g r i e s s 試劑 溶液i 稱取磺胺酸o 5 9 溶于1 5 0 m l 醋酸溶液 3 0 中 保存于棕色瓶中 溶液i i 稱取0 萘胺0 5 9 加入5 0 m l 蒸餾水中 煮沸后 緩緩加入3 0 醋酸 溶液1 5 0 m l 保存于棕色瓶中 2 1 4 2 硝酸鹽 n 0 3 n 定性檢測試劑 二苯胺 硫酸試劑 稱取二苯胺1 9 溶于2 0 m l 蒸餾水中 然后徐徐加入濃硫酸l o o m l 保存于棕 色瓶中 2 1 4 3 總氮 t n 氨氮 亞硝態(tài)氦 n 0 2 n 硝態(tài)氮 n 0 3 n 定量檢測試劑 1 堿性過硫酸鉀溶液 稱取4 0 9 過硫酸鉀 k 2 s 2 0 8 另稱取1 5 9 氫氧化鈉 n a o h 溶于無氨水中 稀釋至1 0 0 0 m l 溶液存放在聚乙烯瓶內(nèi) 最長可儲存一周 2 納氏試劑 h g l 2 k i n a o h f 二中農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 0 9 屆碩l j 學(xué)位論文 稱取1 6 9 氫氧化鈉 溶于5 0 m l 水中 冷至室溫 稱取7 9 碘化鉀和1 0 9 碘化 汞 溶于水中 然后將次溶液在攪拌下 緩慢地加入到氫氧化鈉溶液中 并稀釋至 1 0 0 m l 儲于棕色瓶內(nèi) 用橡皮塞塞緊 于暗處存放 有效期可達(dá)一年 3 酒石酸鉀鈉溶液 稱取5 0 9 酒石酸鉀鈉 溶于1 0 0 m l 水中 加熱煮沸 以驅(qū)除氨 充分冷卻后 稀釋至1 0 0 m l 4 n 0 2 n 顯色試劑 5 0 0 m l 燒杯內(nèi)置入2 5 0 m l 水和5 0 m l 濃磷酸 18 m o l l 加入2 0 0 94 一氨基苯 磺酰胺 再將1 0 0 9n 一 1 萘基 乙二胺二鹽酸鹽溶于上述溶液中 轉(zhuǎn)移至5 0 0 m l 容量瓶中 用水稀釋至標(biāo)線 搖勻 此溶液儲于棕色試劑瓶中 保存在2 54 c 至 少可穩(wěn)定一個月 5 i m o l h c l 溶液 6 o 8 氨基磺酸溶液 稱取0 8 9 氨基磺酸 溶用1 0 0 m l 蒸餾水中即可 于 4 冰箱避光保存 2 1 4 4 轉(zhuǎn)化實驗所需試劑 1 異丙基一6 d 一硫代半乳糖苷 i p t g 溶液 2 4 m g m l 稱取1 2 9 l p t g 置于5 0 m l 離心管中 加入4 0 m l 滅菌水 充分混合溶解后 定 容至5 0 m l 用0 2 2 im 過濾膜過濾除菌 小分分裝 1 m l 份 后 一2 0 保存 2 5 溴一4 一氯一3 吲哚 1 3 一d 一半乳糖苷 x g a l 溶液 2 0 m g m l 稱取l g x g a l 置于5 0 m l 離心管中 加入4 0 m l d m f 二甲基甲酰胺 充分混 合溶解后 定容至5 0 m l 小份分裝 1 m l 份 后 2 0 避光保存 3 氨芐青霉素 a m p i c i l l i n 溶液 10 0 m g m l 稱取5 9a m p i c i l l i n 于5 0 m l 離心管中 加入4 0 m l 滅菌水 充分混合溶解后 定容至5 0 m l 用o 2 2 l am 過濾膜過濾除菌