梓醇抑制NADPH氧化酶保護2型糖尿病早期血管內皮功能[權威資料]

梓醇抑制 NADPH 氧化酶保護 2 型糖尿病早期血管內皮功能 本文檔格式為 WORD,感謝你的閱讀。 ）。另以 10 只健康 Wistar 大鼠作為正常組。正常組、模型組分別給予相當量的生理鹽水。 6 周后全自動生化分析儀檢測血糖、血脂； ELISA 檢測血清 8-異前列腺素 F2 （ 8-iso-PGF2 ）含量；硝酸還原法檢測血清一氧化氮（ NO）水平；羥胺法檢測血清超氧化物歧化酶（ SOD）含量；觀察離體胸主動脈環(huán)內皮依賴性血管舒張反應；熒光法檢測主動脈組織活性氧（ ROS）的水平； HE 染色觀察主動脈病理形態(tài)學改變；RT-PCR， western-blot 分別檢測主動脈組織 Nox4， p22phox mRNA 及蛋白表達。結果顯示梓醇中、高劑量組血管內皮損傷明顯減輕，主動脈 ROS 水平降低，血清 NO 水平升高， 8-iso-PGF2 含量減少， SOD 含量升高；主動脈組織 Nox4， p22phox mRNA 及蛋白表達均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（ P0.05）。因此梓醇對 T2DM 血管內皮具有保護作用，其機制可能與其下調 Nox4， p22phox 表達，抑制氧化應激反應有關。 關鍵詞 2 型糖 尿??；內皮功能；氧化應激； NADPH 氧化酶 收稿日期 2014-04-03 基金項目 國家自然科學基金項目（ 81300688）；山東省自然科學基金項目（ ZR2009CQ013）；山東省中醫(yī)藥管理局項目（ 2013-237） 通信作者 劉江月，講師，研究方向為糖尿病血管并發(fā)癥的防治， E-mail： 近年來我國 T2DM 患病率呈明顯上升趨勢，糖尿病對人類健康的主要危害不是糖尿病本身，而是各種慢性并發(fā)癥。動脈粥樣硬化（ AS） 是糖尿病致死致殘的主要并發(fā)癥之一，血管內皮細胞損傷和功能障礙是 AS 形成的始動環(huán)節(jié)。氧化應激是糖尿病血管內皮功能障礙的重要原因之一 1。梓醇是從地黃中提取的環(huán)烯醚萜類化合物，是地黃的有效活性成分之一 2。研究表明梓醇具有降血糖、抗腫瘤、保護神經(jīng)等 3-5多種藥理作用。近年來多項研究發(fā)現(xiàn) 6-8，梓醇能夠通過清除自由基調控凋亡相關蛋白發(fā)揮保護心血管系統(tǒng)的功能。目前，關于梓醇是否能夠保護糖尿病早期血管內皮功能國內外尚未見報道。本研究通過高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠模型，從氧化應激角度，以 NADPH 氧化酶為靶點，探討梓醇對糖尿病早期血管內皮功能的保護作用及其可能機制。 1 材料 1.1 動物 雄性 Wistar 大鼠， SPF 級，體重（ 216.8 15.3 ） g，購自青島市實驗動物和動物實驗中心，許可證號 SCXK（魯） 20130010。 1.2 飼料 標準飼料：青島市實驗動物和動物實驗中心提供普通大鼠飼料。 高糖高脂飼料：普通大鼠飼料83.25%， 1.5%膽固醇、 0.25%膽酸鈉、 10%豬油、 5%蔗糖，由濰坊醫(yī)學院實驗動物中心配制。 1.3 藥品與儀器 梓醇對照品購自南京森貝伽生物科技有限公司，鏈脲佐菌素（ STZ，美國 Sigma 公司）購自上海前塵生物科技有限公司；大鼠 NO， 8-iso-PGF2 ， SOD 檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，活體組織氧化應激活性氧（ ROS）初級熒光測定試劑盒（ genmed）， Nox4，p22phox 多隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司， Nox4，p22phox 引物購自上海生工生物工程有限公司，轉膜儀（美國Biorad 公司），凝膠成像分析儀（美國 Biorad 公司）， BL-420E 生物機能實驗系統(tǒng)、 JH-2 型張力換能器均 購自成都泰盟科技有限公司。 2 方法 2.1 糖尿病模型造模方法及分組 60 只雄性 Wistar 大鼠適應性飼養(yǎng) 1 周后，高糖高脂飲食 1 月后腹腔注射 STZ（ 30 mg kg 灌胃。 10 只健康 Wistar 大鼠作為正常組，標準飼料喂養(yǎng)，正常組和模型組給予相當量的生理鹽水灌胃，喂養(yǎng) 6周。觀察各組大鼠一般狀況，攝食量及體重變化。 2.2 血糖、血脂及血清 8-iso-PGF2 ， SOD， NO 的檢測 各組大鼠于最后一次灌胃后，禁食 12 h，不禁水。 10%水合氯醛 300 mL kg， 10 min）， 全自動生化分析儀檢測血糖、血脂；硝酸鹽還原酶法測定血清 NO 含量， ELISA 試劑盒檢測血清 8-iso-PGF2 含量，羥胺法檢測 SOD 活性。 2.3 主動脈內皮功能檢測 大鼠處死后立刻取出主動脈，置于 Krebs 液中，剝離周圍組織后剪成主動脈環(huán)，一端固定于水浴槽中，另一端連接張力換能器，通過 BL-420e 生物機能實驗系統(tǒng)觀察記錄血管張力變化，苯腎上腺素（ PE）（ 110 2.4 主動脈 ROS 測定 取小段胸主動脈，研磨組織后，按照 genmed 活體組織氧化應激活性氧（ ROS）初級熒光測定試劑盒操作說明 書檢測主動脈 ROS 含量。 2.5 主動脈 HE 染色 取小段胸主動脈， 10%福爾馬林固定，石蠟包埋后 5 mm 切片， HE 染色，光鏡下觀察。 2.6 RT-PCR 法檢測主動脈 Nox4， p22phox mRNA 表達 取主動脈組織， Trizol 提取總 RNA，按逆轉錄試劑盒操作步驟進行 RT 反應，所得 cDNA 在 PCR 儀上進行擴增。 2 L 的cDNA 為模板， -actin 為內參， PCR 反應參數(shù)：預變性95 2 min ， 94 變性 30 s， 56 退火 30 s 和 72 延伸 30 s，共 32 個循環(huán)， 72 延伸 7 min。 Nox4 上游引物5 -TAGCTGCCCACTTGGTGAACG-3 ，下游引物 5 -TGTAACCATGAGGAACAATACCACC-3 ，擴增長度為 245 bp； p22phox 上游引物 5 -CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3 ，下游引物 5 -TCACACGACCTCATCTGTCAC-3 ，擴增長度為 455 bp。 2.7 Western-blot 法檢測主動脈 Nox4， p22phox 蛋白表達 取主動脈組織，提取總蛋白， SDS-PAGE 電泳，轉膜后加一抗（ 1500 ） 4 過夜， TBST 漂洗 3 次，加入二抗孵育 1 h， ECL 顯影，暗室曝光，圖像分析。 2.8 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以 s 表示，組間采用單因素方差分析，兩兩比較用 SNK-q 檢驗， P0.05 為差異有顯著性。 3 結果 3.1 各組大鼠一般狀況 實驗過程中，模型組大鼠死亡2 只，梓醇低劑量組死亡 1 只，正常組和梓醇中、高劑量組均無死亡。隨著實驗進程正常組和梓醇高劑量組大鼠一般狀況好，毛發(fā)油亮，反應敏捷，攝水攝食正常，體重穩(wěn)步增長 ；而模型組和梓醇低劑量組大鼠卻每況愈下，毛色暗淡，反應遲鈍，甚至部分動物尾部皮膚出現(xiàn)潰爛，攝水攝食量較正常組明顯增多，但體重卻增長緩慢，梓醇中劑量組大鼠一般狀況較正常組和梓醇高劑量組大鼠差，但與模型組相比，上述癥狀明顯改善。 3.2 血糖、血脂及血清 8-iso-PGF2 ， SOD， NO 各組大鼠血糖、血脂比較見表 1。 6 周后模型組及梓醇低劑量組大鼠血糖、血脂水平較正常組均明顯升高，與模型組比較梓醇高劑量組血糖、血脂均顯著降低（ P0.01），梓醇中劑量組血糖、血脂也顯著降低（ P0.05），梓醇中、 高劑量組血糖、血脂水平有顯著差異（ P0.05）。各組大鼠血清 8-iso-PGF2 ， SOD， NO 變化見表 2。 6 周后模型組及梓醇低劑量組大鼠血清 8-iso-PGF2 水平較正常組明顯升高而 NO 水平及SOD 活性顯著降低（ P0.01），與模型組比較梓醇高、中劑量組血清 8-iso-PGF2 水平顯著降低而 NO 水平及 SOD 活性明顯升高（ P0.05），且 2 組間血清 8-iso-PGF2 ， NO 水平及SOD 活性均有顯著差異（ P0.05）。 3.3 主動脈內皮功能檢測 各組大鼠胸主動脈內皮依賴性血管舒張反應 見圖 1。模型組、梓醇低劑量組大鼠胸主動脈對 ACh 的舒張反應均顯著低于正常組（ P0.01），梓醇高、中劑量組大鼠胸主動脈對 ACh 的舒張反應較模型組明顯增強，且 2 組間有顯著差異（ P0.05）。各組大鼠胸主動脈血管收縮反應見圖 2。各組大鼠胸主動脈血管對 PE 呈濃度依賴性收縮，模型組、梓醇低劑量組收縮反應均顯著高正常組（ P0.01），梓醇中、高劑量組較模型組明顯減弱，且 2 組間有顯著差異（ P0.05）。 3.4 主動脈 ROS 測定 各組大鼠主動脈 ROS 含量見圖3。模型組、梓醇低劑量組大鼠主動脈 ROS 含量 較對照組大鼠明顯降低（ P0.01），與模型相比，梓醇中、高劑量組大鼠主動脈 ROS 含量均顯著升高（ P0.05），且兩組間有顯著差異（ P0.05）。 3.5 主動脈 HE 染色 各組大鼠主動脈壁病理形態(tài)改變見圖 4。 HE 染色后光鏡下觀察，正常組大鼠主動脈內膜光滑，內皮細胞完整，平滑肌層排列整齊，模型組、梓醇低劑量組，主動脈內膜連續(xù)性破壞明顯破壞，內皮細胞體積增大。梓醇中、高劑量組主動脈壁各層細胞排列規(guī)則，病變明顯減輕。 3.6 RT-PCR 法檢測主動脈 Nox4， p22phox mRNA 表達 主動脈 Nox4， p22phox mRNA 表達見圖 5。與正常組比較， 模型組、梓醇低、中劑量組大鼠主動脈 Nox4， p22phox mRNA 表達均明顯升高（ P0.05）；與模型組比較，梓醇中、高劑量組大鼠主動脈 Nox4， p22phox mRNA 表達均顯著降低（ P0.05），且 2 組間有顯著差異（ P0.05）。 3.7 Western-blot 法檢測主動脈 Nox4， p22phox 蛋白表達 主動脈 Nox4， p22phox 蛋白表達見圖 6。與正常組比較，模型組、梓醇低劑量組主動脈 Nox4， p22phox 蛋白表達明顯減少（ P0.01）；與模型組比較，梓醇中、高劑量組大鼠主動脈 Nox4， p22phox 蛋白表達均顯著增加，且 2 組間有顯著差異（ P0.01）。 4 討論 血管收縮和舒張功能失調是血管內皮損傷和功能障礙的主要表現(xiàn)，是 T2DM 大血管病變的始動環(huán)節(jié)。高糖、高脂及氧化應激等因素均是導致 T2DM 血管內皮損傷的高危因素。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量 STZ 腹腔注射成功建立了T2DM 大鼠模型， 6 周后 T2DM 大鼠血糖、血脂明顯升高出現(xiàn)糖脂代謝紊亂，血清 SOD 活性明顯降低， 8-iso-PGF2 含量明顯升高，主動脈 ROS 含量明顯增加，出現(xiàn)明顯的氧化應激反應。胸主動脈血管內皮舒縮功能障礙， HE 染色發(fā)現(xiàn)胸主動脈內皮損傷明顯。證實了糖脂代謝紊亂及氧化應激對 T2DM 血管內皮損傷的影響。梓醇是地黃的主要活性成分之一，具有降低血糖、保護神經(jīng)等多種藥理學作用。但梓醇對 T2DM 早期血管內皮功能是否具有保護作用國內外未見報道。本研究建立T2DM 大鼠模型的同時給予梓醇干預治療，研究發(fā)現(xiàn)， T2DM 大鼠胸主動脈內皮損傷明顯減輕，血管舒縮功能明顯改善，血清 NO 水平明顯升高，表明梓醇對 2 型糖尿病早期血管內皮功能具有明顯的 保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠顯著降低 T2DM大鼠血糖，明顯改善血脂代謝紊亂，提示梓醇可能通過降低血糖、調節(jié)血脂，保護 T2DM 早期血管內皮功能。 T2DM糖脂代謝紊亂均可引起氧化應激，導致 ROS 過度產(chǎn)生， ROS 不能被及時清除而大量蓄積，造成各組織細胞損傷 11。 ROS 是衡量機體氧化應激水平的主要指標， SOD 則是反映機體抗氧化能力的常用指標， 8-iso-PGF2 主要來源于磷脂中的花生四烯酸，近年來已成為評價體內氧化應激水平的金標準 12。有研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠減輕糖尿病大鼠氧化應激水平 13。本研究也 發(fā)現(xiàn)梓醇干預后 T2DM 大鼠血清 8-iso-PGF2 水平及主動脈 ROS 含量顯著降低，而血清 SOD 活性明顯升高，說明梓醇可能通過降低糖尿病大鼠體內氧化應激水平保護 T2DM 早期血管內皮功能。 目前認為 NADPH 氧化酶是血管內皮細胞生成 ROS 的主要來源 14，內皮細胞能夠通過 NADPH 氧化酶產(chǎn)生的 ROS 來減少 NO 的生成，導致血管內皮功能紊亂 15。 NADPH 氧化酶包含 gp91phox， p22phox， p47phox， p67phox， rac 等 5 個亞組分 16，有研究報道，糖尿病患者幾個 NADPH 氧化酶亞基（ p22phox， p47phox， p67phox）表達是升高的 17。 Nox 家族是 gp91phox 的同工酶有 Nox1， Nox2， Nox3， Nox4， Nox5 等成員，其中 Nox4 定位于血管內皮細胞和平滑肌細胞。血管生理學認為， Nox 家族是血管 ROS 的主要來源 18。本研究發(fā)現(xiàn) T2DM 大鼠主動脈 p22phox 和 Nox4 mRNA 及蛋白表達顯著升高，梓醇干預后 p22phox 和 Nox4 mRNA 及蛋白表達明顯下調，這可能是梓醇能夠下調 T2DM 大鼠主動脈 ROS 水平的機制。 綜上所述， 本研究首次報道了梓醇對 T2DM 早期血管內皮功能具有保護作用，其機制可能與梓醇改善糖尿病糖脂代謝紊亂，提高機體抗氧化能力，通過下調 p22phox 和 Nox4 mRNA 及蛋白表達減輕糖尿病大血管氧化應激損傷有關。 參考文獻 1 Fox C S， Coady S， Soriie P D， et al. 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Catalpol protect diabetic vascular endothelial function by inhibiting NADPH oxidase LIU Jiang-yue （ Department of Pathophysiology of Weifang Medical College， Weifang 261053， China） Abstract The aim of the present study was to evaluate the protective effect of catalpol on vascular endothelial function in STZ-induced type 2 diabetes mellitus （ T2DM） rats. 40 high-fat diet with STZ-induced diabetes rats were randomly divided into model group， catalpol low-dose， middle-dose and high-dose group （ 10， 50， 100 mg kg）， 10 normal Wistar rats were used as the normal group. The normal and model groups were given an equivalent amount of saline. All reagents were administered by oral gavage for 6 weeks. After 6 weeks， blood glucose and lipids were detected by an automatic biochemical analyzer. The endothelium-dependent vasodilation response of thoracic aortar was detected. The pathological changes of the thoracic aorta were observed by HE staining. Serum nitric oxide （ NO）， 8-iso prostaglandin F2 （ 8-iso-PGF2 ） and superoxide dismutase （ SOD） were detected by ELISA. Reactive oxygen species （ ROS） level of thoracic aorta was detected by fluorescence method. The expression of Nox4 and p22phox mRNA and protein in aortic tissue were detected by RT-PCR and Western-blot respectively. After catalpol treatment， endothelial damage