（食品科學專業(yè)論文）丹參酚酸類化合物的分離及其抗氧化活性研究.pdf

摘要 摘要 丹參作為我國傳統(tǒng)的中藥材之一，具有“祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩的功效。 其中丹參水溶性酚酸類成分在丹參的作用中占重要地位，具有很強的清除自由基和抗氧 化作用，并表現(xiàn)出以較強抗氧化作用為特點的多方面藥理作用，臨床上廣泛用于治療心 血管疾病。本研究在高效液相色譜指紋圖譜指導下，利用液相色譜等現(xiàn)代植物化學分離 技術(shù)篩選出合適的提取分離方案對丹酚酸類化合物進行工業(yè)化提取分離，并對分離得到 的化合物采用五種體外抗氧化體系研究其抗氧化活性及其量效關(guān)系。 實驗采用萃取與正相硅膠、反相樹脂c g l 6 1 、s e p h a d e xl h 2 0 等多種工業(yè)色譜相結(jié) 合的方法確定出了提取分離丹酚酸類化合物的分離方案，并分離得到三個化合物，經(jīng)紅 外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等波譜技術(shù)分析鑒定，確定三個化合物分別是迷迭香酸、丹酚 酸b 、丹酚酸a 。 實驗采用f e n t o n 、鄰苯三酚自氧化、d p p h 、還原、卵黃脂蛋白過氧化等五種體系 利用比色法研究了三種化合物的抗氧化活性，并考查了濃度與抗氧化活性之間的劑量關(guān) 系。結(jié)果表明三種化合物有很強的o h 、0 2 。、d p p h 清除作用、還原能力和抗脂質(zhì)過氧 化作用，五種抗氧化活性隨濃度的增加而增強，且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。除鄰苯三酚自 氧化體系外，在其它四種體系中，三種化合物的抗氧化能力都強于對照蘆丁和v c ，供 試的三種丹酚酸類化合物中丹酚酸a 的抗氧化能力最強，迷迭香酸次之，然后是丹酚酸 b 。丹酚酸b 、迷迭香酸、丹酚酸a 清除o h 的量效關(guān)系及i c 5 0 分別為y 丹酚酸b = 2 2 5 3 3 x 2 4 7 2 1 ，= o 9 9 1 9 ，i c 5 0 = 0 3 3 7 1 9 l ；y 述選香酸= 4 9 6 3 7 x - 3 6 5 4 5 ，d = o 9 8 1 3 ，i c 5 0 = 0 1 7 4 2 9 l ； yn m m h = 5 8 3 5 x - 2 9 4 1 1 ，r 2 = o 9 9 4 4 ，i c 5 0 = 0 1 3 6 3 l ；清除0 2 。的量效關(guān)系及i c 5 0 分別為 yn m m b = 1 2 0 3 4 x + 0 3 9 1 9 ，= o 9 7 0 8 ，i c 5 0 = 4 1 2 2 3 9 l ；y 迷選香酸= 1 2 4 0 3 x + 1 6 5 1 4 ，= 0 9 8 6 9 ， i c 5 0 = 3 8 9 8 4 9 l ；y 丹m r a = i1 8 6 5 x + 1 0 4 3 2 ，= 0 9 8 7 8 ，i c 5 0 = 3 3 3 4 2 9 l ；清除d p p h 的量 效關(guān)系及i c 5 0 分別為yn m m b = 3 5 1 3 8 x + 1 5 6 7 ，r 2 = o 9 9 9 0 ，i c 5 0 = 0 0 1 3 8 9 l ；y 透選香酸= 3 6 9 9 6 x + 4 0 8 6 ，d = o 9 9 0 6 ，i c s o = o 0 1 2 4 9 l ；yn h a = 4 2 5 5 x + 3 1 8 ，= 0 9 9 9 5 ，i c 5 0 = 0 0 11 0 9 l ： 抑制脂質(zhì)過氧化的量效關(guān)系及i c 5 0 分別為y 丹酚酸b = 2 1 8 9 5 x 6 6 7 2 ，r 2 = o 9 8 3 3 ， i c 5 0 = 0 2 5 8 8 9 l ；y 迷選香馥= 2 7 9 0 4 x - 7 3 5 8 ，d = o 9 8 7 3 ，i c 5 0 - - 0 2 0 5 6 9 l ：y n m m a = 2 1 0 3 x + 2 7 1 2 8 ， r 2 = 0 9 8 5 6 ，i c 5 0 = 0 1 0 8 8 9 l ；與還原能力量效關(guān)系分別為：y 丹酚酸b = 7 4 1 x + 0 0 6 9 9 ， ，= 0 9 9 2 ；y 迷選香酸= 1 0 3 5 5 x + 0 0 7 4 6 ，d = o 9 9 9 7 ；y 丹酚酸a = l1 6 5 x + 0 0 8 2 1 ，一= 0 9 9 1 8 。 摘要 三種化合物的抗脂質(zhì)過氧化作用、還原能力均與清除自由基能力具有正相關(guān)性。自 由基清除能力越強，還原力越強，抗脂質(zhì)過氧化能力越強。 關(guān)鍵詞：丹酚酸，分離，高效液相色譜，自由基，抗氧化活性 a b s t r a c t a b s t r a c t r a d i xs a l v i am i t i h o r r i z aw a so n eo ft h et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ，a n dh a v ee f f e c t s o np r o m o t i n gb l o o df l o w ，r e g u l a t i n gm e n s t r u a t i o n ，a n dr e l i e v i n gp a i n ，c l e a t i n gh o ta n d c a l m i n gt h en e r v e s ag r e a t d e a lo fp h a r m a c o l o g yr e s e a r c h e sd i s c o v e r e dt h a tt h e w a t e r - s o l u b l ec o m p o s i t i o np l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei ne f f e c t so fr a d i xs a l v i a em i l t i o r r h i r a e ， t h e yh a ds t r o n gs c a v e n g i n ga c t i v i t i e so fr a d i c a l 、a n t i o x i d a t i o na c t i v i t i e sa n dr e l a t e dv a r i o u s b i o a c t i v i t i e s ，a n dt h e yh a v eb e e n 謝d e l yu s e di nc u r i n gt h ed i s e a s eo fc a r d i o v a s c u l a rs y s t e m c l i n i c a l l y u n d e rt h eg u i d e n c eo fh p l cf i n g e r p r i n t i n g ，w es e l e c t e dam e t h o df o rs e p a r a t i n g s a l v i a n o l i ca c i dc o m p o u n d sb yc o l o rs p e c t r u mm o d e r ns e p a r a t i o nt e c h n i q u e sa n d i n v e s t i g a t e dt h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs i n g l ec o m p o u n da n dt h er e l a t i o nb e t w e e nt h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o nb yf i v ev i t r o - a n t i ox i d a t i v em e t h o d s t h r o u g ht h em e t h o dw h i c hc o m b i n e de x t r a c t i o na n ds i l i c a 、c g 161 、s e p h a d e xl h 一2 0 p r e p a r a t i v ec h r o m a t o g r a p h y ，w ee s t a b l i s h e d am e t h o df o rs e p a r a t i n gs a l v i a n o l i ca c i d c o m p o u n d s ，a n dg o tt h r e es a l v i a n o l i ca c i dc o m p o u n d s ，t h e ya l er o s m a r i n i ca c i d 、s a l v i a n o l i c a c i db 、s a l v i a n o l i ca c i dab yi d e n t i f i n gt h e i rs t r u c t r u e sa c c o r d i n gt oi r 、m s 、n m rs p e c t r u m a n ds oo n w ec h o s e dt h es y s t e m so ff e n t o n ，p y r o g a l l o la n t i o x i d a t i o n ，d p p h ，r e d u c i n gp o w e ra n d y o l kl i p i dp e r o x i d a t i o n t oe v a l u a t et h ea n t i o x i d a t i o na c t i v i t yo ft h r e es a l v i a n o l i ca c i d c o m p o u n d sa n dt h er e l a t i o nb e t w e e nt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o no f s a l v i a n o l i c a c i dc o m p o u n d sb ys p e c t r o s c o p y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es c a v e n g i n ga c t i v i t i e so ft h r e e s a l v i a n o l i ca c i dc o m p o u n d st oh y d r o x y lr a d i c a l 、s u p e r o x i d ea n i o na n dd p p h ，r e d u c i n g p o w e ra n dt h ei n h i b i t o r ye f f e c to nl i p i dp e r o x i d a t i o nw e r ev e r ys t r o n g ，a n dt h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t i e sd e p e n d e do ns a l v i a n o l i ca c i dc o m p o u n d sc o n t e n t ，i nar e m a r k a b l ec o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n tm a n n e r a p a r tf r o mp y r o g a l l o la n t i o x i d a t i o n ，t h e i rw e r em u c hs t r o n g e rt h a nt h e s a m ec o n c e n t r a t i o nv ca n dr u t i ni no t h e rf o u ra n t i o x i d a t i v ea s s e s ，t h eo r d e ro fa n t i o x i d a t i v e a c t i v i t yi ss u c c e s s i v e l y ：s a l v i a n o l i ca c i da r o s m a r i n i ca c i d s a l v i a n o l i ca c i db t h er e l a t i o n b e t w e e nt h es c a v e n g i n ga c t i v i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o na n dc o n c e n t r a t i o ns c a v e n g i n g5 0 o f o ho f s a l v i a n o l i ca c i db 、r o s m a r i n i ca c i d 、s a l v i a n o l i ca c i da w a sy s a ja = 2 2 5 3 3 x - 2 4 7 2 1 ， i i i a b s t r a c t r z = o 9 9 1 9 ，i c s o = 0 3 3 7 1 9 l ；y r a = 4 9 6 3 7 x - 3 6 5 4 5 ，r - 0 9 8 1 3 ，i c s o = o 1 7 4 2 9 l ；y s a la _ 5 8 3 5 x 2 9 4 11 ，= 0 9 9 4 4 ，i c 5 0 = o 13 6 3 9 lr e s p e c t i v e l y ；t h er e l a t i o nb e t w e e nt h es c a v e n g i n g a c t i v i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o na n dt h ec o n c e n t r a t i o ns c a v e n g i n g5 0 o f0 2 w a sy s a ib = 1 2 0 3 4 x + 0 3 9 1 9 ，d = o 9 7 0 8 ，i c 5 0 = 4 1 2 2 3 9 l ；y r o s a = 1 2 4 0 3 x + 1 6 5 1 4 ，一= o 9 8 6 9 ，i c 5 0 = 3 8 9 8 4 l ；y s a l a - 1 1 8 6 5 x + 1 0 4 3 2 ，2 0 9 8 7 8 ，i c 5 0 - - 3 3 3 4 2 9 lr e s p e c t i v e l y ；t h er e l a t i o nb e t w e e nt h e s c a v e n g i n ga c t i v i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o na n dt h ec o n c e n t r a t i o ns c a v e n g i n g5 0 o fd p p h w a s y s a la = 3 5 1 3 8 x + 1 5 6 7 ，d = o 9 9 9 0 ，i c 5 0 = 0 0 1 3 8 9 l ；y r a = 3 6 9 9 6 x + 4 0 8 6 ，d = o 9 9 0 6 ，i c 5 0 = 0 0 1 2 4 9 l ；y s aa = 4 2 5 5 x + 3 1 8 ，d = o 9 9 9 5 ，i c 5 0 = 0 0 1 1 0 9 lr e s p e c t i v e l y ；t h er e l a t i o nb e t w e e n t h ei n h i b i t o r ye f f e c ta n dc o n c e n t r a t i o na n dt h ec o n c e n t r a t i o n i n h i b i t i n g 5 0 o fl i p i d p e r o x i d a t i o nw a sy s a lb = 2 18 9 5 x - 6 6 7 2 ，d = o 9 8 3 3 ，i c 5 0 = 0 2 5 8 8 9 l ；y r a = 2 7 9 0 4 x - 7 3 5 8 ， 一= 0 9 8 7 3 ，i c 5 0 = 0 2 0 5 6 9 l ；y s a ia = 2 10 3 x + 2 7 12 8 ，d = o 9 8 5 6 ，i c 5 0 = o 10 8 8 9 lr e s p e c t i v e l y ； t h er e l a t i o nb e t w e e nt h er e d u c i n gp o w e ra n dc o n c e n t r a t i o nw a sy s a ia = 7 41x + 0 0 6 9 9 ， r z = 0 9 9 2 ；y r o s a = 1 0 3 5 5 x + 0 0 7 4 6 ，d - - o 9 9 9 7 ；y s a l a - 1 1 6 5 x + 0 0 8 2 1 ，d - - o 9 9 1 8r e s p e c t i v e l y t h ei n h i b i t o r ye f f e c to ny o l kl i p i dp e r o x i d a t i o na n dr e d u c i n gp o w e ro ft h r e es a l v i a n o l i c a c i dc o m p o u n d sa r er e l a t e dt ot h es c a v e n g i n gr a d i c a la c t i v i t i e s ，t h eb e t t e rs c a v e n g i n gr a d i c a l s w a sa n dt h eb e t t e rr e d u c i n gp o w e ra n dt h ei n h i b i t o r ye f f e c to nl i p i dp e r o x i d a t i o nw a s k e yw o r d s ：s a i v i a n o ii ca c i d 。is o i a t i o n ，h p l c r a d i c a i ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s i v 關(guān)于碩士學位論文使用授權(quán)的說明 論文題目： 墨叁酚酸耋絲金塑數(shù)盆直區(qū)墓菹氫絲適絲硒究 本學位論文作者完全了解大連工業(yè)大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī) 定，大連工業(yè)大學有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和 磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有 關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學 位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。 保密的學位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 是否保密( 否) ，保密期至 年月日為止。 杪苫年弓戶月匕日 第一章文獻綜述 第一章文獻綜述 我國是世界上植物資源最豐富的國家之一，近3 萬種高等植物，僅藥用植物就約有 1 1 1 4 0 余種，為開發(fā)新藥，保健食品、化妝品研發(fā)等提供了豐富的物質(zhì)基礎。從藥用植 物中尋找新的天然藥物，篩選生理活性物質(zhì)作為合成藥物的先導化合物或目標化合物， 是植物化學的主要研究內(nèi)容之一。 1 1 丹參 丹參系唇形科鼠尾草屬植物丹參( s a v am i l t i o r r h i z ab g e ) 的干燥根及根莖，又名赤 參，主產(chǎn)于山西、河北、河南、四川、江蘇、安徽等地。始載于神農(nóng)本草經(jīng)，列為 上品，稱其“主心腹邪氣，破散除瘕，止煩滿 ，日華子本草對其論述更為全面： “養(yǎng)神定志，通利關(guān)脈，治冷熱勞，骨節(jié)疼痛，四肢下逐，排膿止痛，生肌長肉，止血 崩帶下，調(diào)婦人經(jīng)脈不勻，血邪心煩，惡瘡疥癬，腫毒，丹毒【l 】，中華人民共和國藥 典歸納丹參的功能與主治為：“祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩”“用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng) 閉痛經(jīng)，瘕積聚，胸腹刺痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛”【2 】。丹參在臨 床上廣泛用于治療心血管疾病，具有擴張冠狀動脈、防止心肌缺血等作用。丹參的有效 成分主要為脂溶性和水溶性兩大類，脂溶性成分以二萜醌類居多，具有特征的橙黃色和 橙紅色，主要有丹參酮、隱丹參酮等。水溶性成分以酚酸類居多，多含有苯丙烷( c 6 - - c 3 ) 結(jié)構(gòu)，以及該類酸縮合形成的多酚芳酸，主要有丹參素、丹酚酸、原兒茶醛、迷迭 香酸等【i 】。醫(yī)藥學家對丹參的水溶性酚酸類成分進行了深入的研究，證明其在丹參的作 用中占重要地位，更容易被人體吸收，具有很強的抗氧化作用，并表現(xiàn)出以較強抗氧化 作用為特點的多方面藥理作用，具有改善微循環(huán)、抗血栓、促進組織恢復等多種活性， 是治療心血管疾病的主要成分，是主要藥效物質(zhì)基礎。目前已有多種以丹酚酸為主要成 分的藥物制劑應用于臨床，如復方丹參注射液、丹參注射液、復方丹參滴丸等。 1 1 1 丹參水溶性化學成分 從三十年代起人們對丹參的化學成分即開始進行研究，研究大致可分二個階段，三 十年代初至四十年代，主要由日本學者中尾萬三和瀧浦潔等人對丹參的脂溶性成分進行 第一章文獻綜述 研究；六十年代末至今，丹參成分的研究工作有了迅速發(fā)展，目前已闡明結(jié)構(gòu)的成分近 5 0 種，二萜類占了一半以上，大多為我國學者在七十年代以后所發(fā)現(xiàn)【3 j 。對丹參水溶性 成分的研究較晚，但進展迅速，始于2 0 世紀8 0 年代，通過對丹參水溶性成分不斷的深入 研究，先后分離得到了一系列水溶性化合物，現(xiàn)結(jié)構(gòu)明確的丹酚酸有2 0 余種，主要有丹 參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 等1 4 1 。 最早發(fā)現(xiàn)的水溶性成分d ( + ) 1 3 ( 3 ，4 一二羥基苯基) 乳酸即丹參素，是各種丹酚酸的基 本化學結(jié)構(gòu)，如丹酚酸a ( s a l v i a n o l i ca c i da ) 由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成； 丹酚酸b ( s a l v i a n o l i ca c i db ) 由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成；丹酚酸 c ( s a l v i a n o l i ca c i dc ) 由二分子丹參素縮合而成：迷迭香酸( r o s m a r i n i ca c i d ) 由一分子丹 參素和一分子咖啡酸縮合而成【4 】，部分主要成分的分子結(jié)構(gòu)式如下： c h 2 c h c o o h h o h 丹參素 o h 迷迭香酸 丹酚酸a c h c hc o o h 咖啡酸 丹酚酸c 丹酚酸b 圖1 - 1 丹酚酸類成分結(jié)構(gòu)式 f i g i - 1s t r u c t u r e so fs a l v i a n o l i ca c i dc o m p o u n d s 2 o h o h 第一章文獻綜述 1 1 2 丹參水溶性成分提取與分離方法 近年來在丹參有效成分的提取方面研究較多，但目前對丹參有效成分的提取還普遍 存在提取率不高，分離純化困難，有效成分純度低等問題。丹參中有脂溶性和水溶性兩 種主要有效成分，其提取工藝也分為脂溶性和水溶性兩種。丹參中的水溶性酚酸類成分， 呈弱酸性，溶于水、醇、丙酮、乙酸乙酯等溶劑中，從文獻報道看丹參水溶性成分主要 用水、乙醇提取，其提取方法主要有傳統(tǒng)方法和c 0 2 超臨界流體萃取等。 傳統(tǒng)方法：有水煎提取法、超聲提取法、滲漉法等。劉重芳，朱艷【5 】等對多種提取 工藝( 水煎法、乙醇回流法、動態(tài)溫浸法、超聲波法、滲漉法等) 進行比較，以丹參素 和原兒茶醛指標成分的提取總量考察，采用水煎法好。郭增軍【6 】等通過正交試驗研究表 明，用水作提取溶媒較不同濃度乙醇更有利于原兒茶醛的溶出，浸泡有利于原兒茶醛的 溶出，超聲3 0 m i n 提取原兒茶醛不完全，認為丹參水溶性成分提取工藝為：用水浸泡過 夜再回流提取。周俠【7 j 等采用水煎法提取丹參素，認為采用1 2 倍水、煎煮2 次、每次1 5 h 是傳統(tǒng)水煎法的較佳條件。鄭萍【8 】等比較了水煎回流、超聲提取與乙醇滲漉法對丹參素 的提取效果的影響，結(jié)果顯示采用水煎回流法丹參素的提取率高于其他方法，且水煎回 流法中，隨著提取時間的增加，丹參素的含量有增加的趨勢。 c 0 2 超臨界流體萃?。涸摲ㄅc傳統(tǒng)方法相比，可以在近常溫的條件下提取分離，避 免高溫對有效成分造成損失。李霞等以9 5 0 m l l 乙醇為夾帶劑，在2 0 m p a ，4 5 條件下， 萃取丹參藥材l h 后，再在3 0 m p a ，6 5 。c 條件下，以l o o m l l 的乙醇為夾帶劑萃取2 h ，并將 超臨界萃取法與回流提取法、超聲提取法進行了比較，結(jié)果證明超臨界萃取法萃取的成 分最多，萃取效率也高于其它兩種方法。 丹參的粗提取液成分復雜，除了含有丹參水溶性有效成分，還有淀粉、多糖、蛋白 質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，為提高有效成分的含量，提取后需進行除雜分離。其除雜主要采用水 提醇沉法，萃取法，大孔樹脂吸附法等。 水提醇沉法：醇沉可除去多糖、鞣質(zhì)以及其它雜質(zhì)。郭瑩陽3 等對水醇提取工藝進行 了優(yōu)化。該法是丹參水溶性成分傳統(tǒng)的提取分離方法，目前制作丹參注射液和口服液多 采用此工藝。但此工藝有很多不足，由于乙醇濃度過高，使成分損失很大，含量不穩(wěn)定。 大孔樹脂吸附法：此法成本低，效率高，可以避免醇沉法的缺點。王志平【1 0 1 等以丹 參水提取液中丹參素和原兒茶醛含量為指標，篩選出了大孔吸附樹脂富集有效成分的最 佳工藝，該法提高了有效成分含量，可以替代傳統(tǒng)的水醇工藝。以樹脂提取總丹酚酸和 丹酚酸b 方法已經(jīng)申請了專利。 第一章文獻綜述 萃取法：目前對丹酚酸分離多采用乙酸乙酯萃取法，但該種方法溶劑消耗大，并存 在溶劑殘留。李靜【l l 】等通過實驗，選擇出酚酸類物質(zhì)最佳提取分離方法，即丹參粉末水 浸過夜后，煮沸o 5 h ( 提取原兒茶醛煮沸2 o h ) ，調(diào)p h 至2 ，乙酸乙酯萃取，所得酚類化臺 物提取率最高。 1 1 3 丹參水溶性單體成分的分離 丹參水溶性成分的分離研究始于2 0 世紀8 0 年代，現(xiàn)將水溶性酚酸類化合物的分離 研究總結(jié)如下： 1 9 8 0 年陳政雄等用乙醚萃取丹參注射液，乙醚層濃縮析出原兒茶醛；水層用飽和食 鹽水鹽析，過濾鹽析物，濾液放置得到的白色沉淀，在水中重結(jié)晶得丹參素；鹽析物酸 化，用乙酸乙酯萃取，溶劑減壓濃縮后進行纖維粉柱層析，用0 0 0 1 n 的硫酸沖洗，洗脫 部分再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮后進行制備性薄層層析，得到丹酚酸b 和丹酚 酸c 【1 2 1 ，這是我國學者首次分得丹參素、丹酚酸b 、丹酚酸c 。此外，香港和日本學者也 采用不同方法分離得到了丹酚酸b 及其鎂或鉀鹽【1 1 1 。黎蓮娘等將9 5 乙醇提取后的丹參 藥渣用熱水回流，水提液過濾用乙醚萃取，萃取液蒸干再進行硅膠柱層析，用氯仿甲 醇甲酸( 8 5 ：1 5 ：1 ) 洗脫，將柱從底部向頂部分割為1 6 段，分別用熱乙醇洗脫，洗脫液 用薄層制備，第一段得到原兒茶酸和原兒茶醛，第七至九段經(jīng)葡聚糖凝膠純化得迷迭香 酸，第十至十三段制備薄層析得丹酚酸a 和c ，十三至十四段葡聚糖凝膠柱純化得丹酚 酸b 【1 3 1 ；如果直接將濃縮的水提液調(diào)乙醇含量至7 0 ，過濾濃縮與硅膠相拌，在索氏提 取器中用二氯甲烷、乙酸乙酯和水依次提取，收集水提部分酸化后萃取，取乙酸乙酯萃 取層用葡聚糖凝膠和制備薄層層析處理得丹酚酸d 、e 和異阿魏酸、紫草酸甲酯【1 4 1 ；如 果水提液濃縮7 0 醇沉后，過濾濃縮，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯 部分用硅膠進行干柱層析，氯仿甲醇甲酸( 8 4 ：1 5 ：1 ) 洗脫后切割為5 份，各份用甲醇洗 脫，合并相同組分，得1 - 3 份及4 5 份兩部分，各部分分別經(jīng)s e p h a d e xl h 2 0 柱層析用 甲醇洗脫，多次薄層制備，用不同配比的氯仿甲醇甲酸展開，得到咖啡酸、迷迭香酸、 迷迭香酸甲酯、丹酚酸a 、丹酚酸c ，正丁醇部分經(jīng)多次薄層制備后得到丹酚酸b 【l5 1 。周 長新等采用國產(chǎn)大孔吸附樹脂，結(jié)合s e p h a d e xl h 2 0 柱，以水醇系統(tǒng)為洗脫劑，從丹參 根和丹參注射劑中分離得到迷迭香酸、原紫草酸、紫草酸、紫草酸乙鎂鹽、紫草酸乙氨 鉀鹽、丹酚酸戊鎂鹽、丹酚酸a 、丹酚酸c 和丹酚酸丁鉀鹽【1 6 】。 通過對丹參水溶性成分不斷深入的研究，我國學者已先后分離得到一系列丹酚酸類 4 第一章文獻綜述 化合物，但所采用的分離方法，如萃取鹽析、薄層制備、割柱等只適合在實驗室條件下 極少量制備化合物，很難實現(xiàn)工業(yè)化，難以滿足成分活性研究、藥物開發(fā)和質(zhì)量控制的 需要，因此有學者對能大量制備酚酸類單體成分的方法進行了研究。 王風美等通過比較不同大孔吸附樹脂對丹酚酸b 的吸附與洗脫性能，篩選出了最佳 樹脂并確定了高純度丹酚酸b 的制備工藝，純度達9 1 8 【1 7 】；倪力軍開發(fā)了一種從丹參 中提取丹酚酸b 的新工藝，采用水提殼聚糖絮凝過濾濃縮醇沉萃取硅膠柱層析工藝， 得到含量9 6 的丹酚酸b 【l8 】；唐昌炯等對丹參素的原有提取工藝水煮醇沉法進行改進， 將丹參在提取前進行酸堿處理，收率明顯提高可達2 6 【1 9 1 ；周俠等對傳統(tǒng)的水煎醇沉法 進行改進，先用堿處理將丹參素變?yōu)殁c鹽再醇沉，大大地提高了丹參素的提取率，提取 率0 2 6 4 ，含量5 3 2 t 2 們。 但從文獻報道看，只對能大量制備丹酚酸b 和丹參素的分離純化工藝有研究，而對其 它酚酸類成分則研究較少，這主要可能是因為在對水溶性成分提取時易帶有蛋白質(zhì)、多 糖、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，對后續(xù)分離造成困難，丹酚酸類化合物不穩(wěn)定，提取分離時損失較大， 且丹酚酸類成分復雜，成分間的極性和結(jié)構(gòu)相似難以分開，這使得到高純度單體化合物 的制備十分困難，因此對能大量制備酚酸類單體成分的方法還有待進一步的研究。 1 1 4 丹參水溶性成分的藥理作用 丹參水溶性成分在丹參的作用中占重要地位，具有改善微循環(huán)、抗血栓、促進組織 恢復等多種活性，對心、腦、肝、腎、胃等多個器官具有保護作用。 丹酚酸對心腦血管的保護作用：可表現(xiàn)在保護心腦缺血再灌注損傷、防止動脈粥樣 硬化、對腦缺血的保護作用等。丹酚酸對小鼠腦缺血和缺血再灌注損傷有保護作用，可 以減少腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含型2 。采用l a n g e n d o 躪體大鼠心肌缺血再灌注 模型，研究丹酚酸a 對心肌缺血再灌注性損傷的保護作用，結(jié)果證明丹酚酸a 對離體大 鼠心肌缺血再灌注性損傷具有一定的保護作用【2 2 】。丹酚酸對動脈粥樣硬化具有防治作 用，能有效抑制c u 2 + 誘導的人低密度脂蛋白氧化，其作用機制可能與清除自由基、螯合 c u 2 + 有關(guān)【2 3 2 4 1 。 丹酚酸對肝的保護作用：可表現(xiàn)在抗肝脂質(zhì)過氧化損傷、減輕肝細胞的形態(tài)損傷、 抑制肝硬化等。從丹參中分離出的7 種酚酸類化合物對小鼠肝臟的微粒體、肝實質(zhì)細胞 及紅細胞的過氧化損傷都具有保護作用，其中丹酚酸a 的作用最強【2 5 】。體外用0 1 2 四 氯化碳灌流大鼠肝臟6 0 m i n ，可使肝細胞變性，排列紊亂，肝索萎縮，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊， 第一章文獻綜述 流出液中a l t 明顯增加，灌流液中加入0 1 5 丹參后進行灌流，肝臟損傷程度明顯減輕， a l t 無明顯增加【z 6 】。 丹酚酸對腎的保護作用：丹酚酸b 鎂鹽對腎功能具有改善作用，提高尿中前列腺素 e 2 的排泄量，并證明對花生四烯酸代謝過程中的環(huán)加氧酶活性有抑制作用，采用腎臟毒 性物質(zhì)制備腎功能損傷模型，證明丹參對多種物質(zhì)引起的腎功能損傷均有保護作用，丹 參可以改善衰竭的腎臟功能，使腎臟濾過率和腎血流量增加【2 7 2 8 1 。 此外丹酚酸還有預防白內(nèi)障、抑制血下板聚集、抑制愛滋病病毒、抗腫瘤、抗衰老 等生理活性。 1 1 5 丹參水溶性成分藥理作用與抗氧化活性的關(guān)系 丹參水溶性成分具有很強的抗氧化活性，可以清除超氧陰離子和羥基自由基，抑 制脂質(zhì)過氧化【2 9 】，其抗氧化活性與表現(xiàn)出的多方面藥理作用有密切關(guān)系。 丹酚酸a 具有改善小鼠腦缺血再灌注導致的學習記憶功能障礙的作用，體外實驗表 明，丹酚酸a 可抑制大鼠腦組織勻漿脂質(zhì)過氧化反應和o h 的生成，提示丹酚酸a 改善腦 功能與清除自由基密切相關(guān)p o 】。丹參的6 種水溶性成分能不同程度地抑制黃嘌呤黃嘌 呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的0 2 。，7 種水溶成分對h 2 0 2 所致的小鼠紅細胞溶血和丙二醛( m d a ) 形成有顯著抑制作用，在離體大鼠心臟，丹酚酸a 能顯著降低缺氧4 5 m i n 后再給氧3 0 r a i n 時心肌m d a 含量，推測丹酚酸a 對心肌缺血再給氧損傷的保護作用可能與其氧自由基 清除活性有關(guān)【3 i 】。丹參水溶性成分能抑锘l j f e 2 + _ 半胱氨酸引起的大鼠心、腦、肝等組織中 線粒體和微粒體的脂質(zhì)過氧化和f e 2 + - v c 體系和t r i t o nx 1 0 0 7 i 起的大鼠心、腦、肝、 腎線粒體腫脹，推測其保護作用與抗氧化作用有關(guān)。丹參注射液對h 2 0 2 f e 2 + 體系中的羥 自由基的清除率為6 5 ，對黃嘌呤黃嘌呤氧化酶體系中超氧陰離子的清除率為1 0 0 ， 提示清除具有細胞毒性的氧自由基可能是丹參的重要藥理機制之一【3 2 1 。丹酚酸a 可使被 超氧陰離子抑制的大鼠左心室乳頭肌細胞膜鉀離子通道活性得到恢復并被激活，提示丹 酚酸a 抗缺血再罐注心律失常與清除自由基有關(guān)【3 3 】。丹參素對以f e 2 + v c 為氧自由基產(chǎn)生 體系造成的鼠心肌線粒體曠a t p 酶損傷有保護作用，可防止i - i + a t p 水解活性的下降【3 4 1 ， 另外，丹參素對f e 2 + v c 體系損傷大鼠心肌線粒體具有抑制作用，可以保護線粒體p o 、 呼吸控制率( r c r ) 及細胞色素氧化酶活性，表明丹參素可清除o h1 3 習。從丹參中提取的 三種水溶性成分丹酚酸a ，丹酚酸b 和丹羅酚酸，對由v c - n a d p h 或由f e 2 + 半胱氨酸誘 發(fā)的大鼠腦、肝、腎微粒體的脂質(zhì)過氧化都有很強的抑制效應，機制之一是這些成分能 6 第一章文獻綜述 有效地清除超氧陰離子 3 6 1 。丹酚酸a 對大鼠半乳糖性白內(nèi)障的形成具有抑制作用，減緩 白內(nèi)障形成，給藥組動物晶狀體內(nèi)h 2 0 2 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量減少，蛋白巰基和 總巰基增加，體外實驗證明，丹酚酸a 對醛糖還原酶有一定抑制作用，表明丹酚酸a 通 過抗氧化而抑制白內(nèi)障的形成【3 7 l 。 1 1 6 丹參水溶性成分體外抗氧化活性 已有學者采用過多種體系對丹酚酸類化合物的體外抗氧化活性進行研究，現(xiàn)將研究 內(nèi)容總結(jié)如下： 丹酚酸a 、b 和丹羅酚酸對由v c n a d p h 和f e 2 + 半胱氨酸系統(tǒng)誘發(fā)的大鼠腦、肝、 腎微粒體的脂質(zhì)過氧化有很強的抑制效應，其作用強弱依次為丹酚酸a ，丹酚酸b ，丹 羅酚酸，強于維生素e ，對黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶體系0 2 的產(chǎn)生有與s o d 同等的效應 3 6 1 。 總丹酚酸可抑帶1 f e 2 + 半胱氨酸誘導的肝微粒體脂質(zhì)過氧化，清除黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶 體系產(chǎn)生的0 2 。- 和f e 2 + h 2 0 2 體系產(chǎn)生的o h ，且在同等劑量下均強于維生素e 【3 引。用單掃 示波極譜法研究丹參對活性氧自由基的清除作用，結(jié)果顯示，丹參樣品對0 2 和o h 均有 清除作用【3 9 1 。利用電子順磁共振和自旋捕集技術(shù)，研究丹參注射液的氧自由基清除作用， 結(jié)果表明，丹參注射液對n 2 0 2 f e 2 + 體系中的o h 清除率為6 5 ，對黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶 體系中0 2 - 的清除率為1 0 0 i 3 2 1 。丹參的6 種水溶性成分( 丹酚酸a 、b 、c 、迷迭香酸、 咖啡酸、丹參素) 能不同程度地抑制黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的0 2 。，丹參7 種水 溶成分對h 2 0 2 所致的小鼠紅細胞溶血和丙二醛( m d a ) 形成有顯著抑制作用，其中丹酚 酸a 、b 、c 和迷迭香酸的活性較強，在1 1 0 0 i - t m o l 顯示良好的量效關(guān)系【3 。運用自由基 反應模型觀察丹酚酸對二苯代苦味酰肼自由基( d p p h ) 和o h 的淬滅效應，結(jié)果表明丹 酚酸可有效清除d p p h 和對o h 攻擊的d n a 損傷有保護作用，且清除能力和保護作用受 丹酚酸組成和丹酚酸b 含量的影響【刪。丹酚酸a 、丹酚酸b 和迷迭香酸能清除v c f e 2 + e d t a 系統(tǒng)產(chǎn)生的o h ，清除作用是甘露醇的1 0 - - 1 0 0 倍。丹酚酸a 能清除由抗癌藥阿霉 素與u 2 0 2 反應所生成的o h 【4 。研究丹酚酸對e d t a h 2 0 2 f e 2 + 和v c h 2 0 2 f e 2 + 系統(tǒng)中 水楊酸的羥基化作用，結(jié)果顯示，在后一體系中，這類化合物劑量依賴性地抑制羥化作 用，其作用強度和抗脂質(zhì)過氧化基本一致，而在前一體系中，作用較復雜，大多數(shù)丹酚 酸劑量依賴性地抑制水楊酸羥化作用，但丹酚酸a 作用例外，和v c 作用相似，丹酚酸a 在低劑量時促進水楊酸羥基化作用，而在高劑量時則抑制，這類化合物能與鐵離子結(jié)合 或絡合，但其絡合常數(shù)較e d t a - 鐵絡合常數(shù)低二個數(shù)量級以上，因而認為丹酚酸類化 7 第一章文獻綜述 合物可能具有羥自由基捕捉作用【4 2 】。 1 2 天然植物的抗氧化作用 1 2 1 自由基 自由基( f r e er a d i c a l s ) 是任何包含一個未成對電子的原子或原子團。未成對電子，指 那些在原子或分子軌道中未與其它電子配對而獨占一個軌道的電子【4 3 】，生物體內(nèi)的自由 基主要有超氧陰離子自由基( 0 2 。) 、羥基自由基( o h ) 、烷過氧基自由基( i 的o ) 和一氧化氮自由基( n o ) 等。 0 2 。是基態(tài)氧接受一個電子形成的第一個氧自由基，可以通過一系列反應產(chǎn)生其它 自由基。人體內(nèi)可以通過多種途徑產(chǎn)生0 2 ，一些重要生物分子在有氧存在時可氧化生 成0 2 ，其中血紅蛋白和氧氣反應是體內(nèi)產(chǎn)生0 2 。的重要來源；線粒體和細胞核膜含有電 子傳遞鏈，在傳遞大量電子時，可將電子漏給氧氣，使氧氣發(fā)生一電子還原產(chǎn)生0 2 ， 其中線粒體是需氧生物細胞內(nèi)產(chǎn)生0 2 。最多的地方；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細胞色素p 4 5 0 氧化中間 物時可以釋放0 2 ；此外，體內(nèi)有些酶可以把氧氣直接還原成0 2 ，如黃嘌呤氧化酶等。 o h 是所知的最強的氧化劑，是自由基鏈式反應的主要引發(fā)劑。它比高錳酸鉀和重 鉻酸鉀的氧化性還強，是氧氣的三電子還原產(chǎn)物，帶有一個不成對電子，反應性極強， 對生物體的損害極大，幾乎可以破壞生物細胞中的所有分子。 i 芻h a r m a n g f j 立自由基衰老學說以來，自由基生命科學的研究日益深入，從研究的結(jié) 果表明，氧自由基幾乎和人類大部分常見疾病都有關(guān)系，從死亡率最高的心腦血管疾病， 到人類最恐懼的癌癥，以及近年來對人類造成巨大威脅的艾滋病，無一不和氧自由基有 著密切的關(guān)系。在神經(jīng)系統(tǒng)，早老性癡呆癥、震顫麻痹癥、癲癇等疾病都有氧自由基的 參與；在循環(huán)系統(tǒng)，動脈粥樣硬化、血栓的形成、心肌缺血再灌注損傷中氧自由基起著 重要作用；肝炎、糖尿病與氧自由基密切相關(guān)；致癌、促癌和癌形成的每一步都有氧自 由基的產(chǎn)生和參與；白內(nèi)障的形成和視網(wǎng)膜的損傷是氧自由基和脂質(zhì)過氧化的直接結(jié) 果；在免疫反應的炎癥中，巨噬細胞呼吸爆發(fā)釋放大量氧自由基f 4 3 】。 1 2 2 天然植物的抗氧化成分 在生物體內(nèi)活性氧不斷地通過非酶反應與酶反應產(chǎn)生，但在抗氧化酶及外源性和內(nèi) 源性抗氧化劑的協(xié)同作用下不斷地被清除，在生理情況下活性氧可維持于有利無害的極 8 第一章文獻綜述 低水平【蜘。平衡濃度的活性氧中一部分可履行生理作用，而另一部分可損傷生物分子， 研究表明，每天每個細胞的生物分子可以受至t j l 0 4 1 0 5 次活性氧的攻擊而發(fā)生損傷，不 過損傷分子可以得到修復、置換、降解代謝和重新合成，因此不會發(fā)生活性氧對機體的 損害1 4 5 j 。但在衰老、應激及某些病理情況下活性氧產(chǎn)生增多或清除能力減弱，從而發(fā)生 活性氧對機體的損傷，引起疾病的發(fā)生，體內(nèi)已無力維持自由基的平衡，因此需要補充 外源氧自由基清除劑和抗氧化劑幫助體內(nèi)氧自由基的平衡【4 3 1 。目前使用較多的是合成抗 氧化劑，如b h t 、b h a ，但動物實驗研究表明，它們對生物體有潛在的毒副作用m 】，天 然抗氧化劑安全、無副作用，因此尋找天然抗氧化劑成為當務之急。我國植物資源豐富， 僅藥用植物就有1 1 1 4 0 余種，因此對天然、高效、低毒的中草藥抗氧化劑成分的研究倍 受關(guān)注。天然植物中的抗氧化成分主要有多酚類物質(zhì)、多糖、皂苷等。 1 - 多酚類物質(zhì) 多酚類化合物的抗氧化作用是向脂質(zhì)過氧化自由基( l o o ) 提供一個電子而使之 成為較穩(wěn)定的過氧化脂質(zhì)( l o o h ) ，而自身則成為酚氧自由基或其同系物。多酚類物 質(zhì)就其化學結(jié)構(gòu)的不同，可分為單聚體和多聚體兩大類。其分類如圖： 圖1 - 2 多酚類物質(zhì)的基本分類 f i g 1 - 2c l a s s i f i c a t i o no fp o l y p h e n o lc o n s t i t u e n t s 9 子單寧 酸單寧 第一章文獻綜述 酚酸類化合物是指同一苯環(huán)上有若干個酚性羥基的一類化合物，可分為三類，一