（分析化學(xué)專業(yè)論文）微流控毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的研究.pdf

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取 得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中 不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得逝姿盤鱟 或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研 究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 學(xué)位敝儲虢視簽錮期：w 年月7 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解逝姿盤堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán) 保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借 閱。本人授權(quán)迸婆盤堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn) 行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書) 學(xué)位論文作者簽名： 腳 簽字隰少份月( 日 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向： 工作單位： 通訊地址： 三三著三：壘塑月了日 簽字日期：抄廠年g 月、日 電話： 郵編： 浙江大學(xué)碩十學(xué)位論文 摘要 在芯片上進(jìn)行蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電泳分離可以顯著地提高分析速度和分離效 率，并對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā)展具有重要意義。本工作采用 激光誘導(dǎo)熒光檢測的方法，對蛋白質(zhì)在微流控玻璃芯片及短毛細(xì)管上的微流控毛 細(xì)管電泳分離系統(tǒng)進(jìn)行研究，并成功實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的快速分離。 第一章介紹了微流控芯片毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展，對芯片毛細(xì)管 電泳分離蛋白質(zhì)的各種分離模式進(jìn)行了綜述，并介紹了不同分離模式下抑制通道 內(nèi)壁對蛋白質(zhì)大分子吸附的各種方法。 第二章，在課題組與上海光譜公司合作研制的生化分析儀上進(jìn)行了蛋白質(zhì)分 離的研究。分離了c y 5 標(biāo)記的0 【一胰凝乳蛋白酶原a 及其雜質(zhì)蛋白，并對抑制蛋 白質(zhì)吸附的玻璃芯片涂層進(jìn)行了研究。該分離系統(tǒng)以激光誘導(dǎo)熒光( l i f ) 系統(tǒng) 作為檢測器，并以夾流進(jìn)樣的進(jìn)樣模式及優(yōu)化的分離條件，于2 2 5s 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了樣 品的分離。 第三章介紹了一種基于短毛細(xì)管的毛細(xì)管凝膠電泳蛋白質(zhì)分離系統(tǒng)。系統(tǒng)采 用激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)和缺口型試樣管陣列試樣引入技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了自動化、高 速的的毛細(xì)管凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)樣品的快速分離，具有 操作自動化、分離速度快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。 關(guān)鍵詞：微流控芯片；毛細(xì)管電泳；蛋白質(zhì)分離；激光誘導(dǎo)熒光檢測 a bs t r a c t i nt h i sw o r k ，g l a s sc h i p b a s e da n ds h o r tc a p i l l a r y b a s e dm i c r o f l u i d i cc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m sw i t hl a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a sd e v e l o p e d t h e a b i l i t yt os e p a r a t ef l u o r e s c e i nd y e sl a b e l e dp r o t e i nw a ss h o w n i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h ed e v e l o p m e n t so ft h ec h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s f o rp r o t e i ns e p a r a t i o ni nr e c e n ty e a r sa r es u m m a r i z e d v a r i o u sc h i p b a s e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m s f o r p r o t e i ns e p a r a t i o n b a s e do nd i f f e r e n t c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o nm o d e sa r ei n t r o d u c e d f u r t h e r m o r e ，t h ea p p r o a c h e st o s u p p r e s st h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fm i c r o c h a n n e lo nc h i p sa r e d i s c u s s e d i nt h es e c o n d c h a p t e r , t h ep r o t e i ns e p a r a t i o n o n c h i p b a s e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s w a sp e r f o r m e d u s i n g al a b m a d e b i o a n a l y z e r c y 5 l a b e l e d a - c h y m o t r y p s i n o g e na a n do t h e rp r o t e i n sa r es e p a r a t e d v a r i o u sm e t h o d st os u p p r e s s t h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fm i c r o c h a n n e lo ng l a s sc h i p sw a ss t u d i e d t h el i fd e t e c t i o na n dt h ep i n c h e di n j e c t i o nm o d ea r ee m p l o y e df o rs a m p l ed e t e c t i o n a n di n t r o d u c t i o nr e s p e c t i v e l y u n d e rt h em o d i f i e dc o n d i t i o n s ，s a m p l ec o u l db e s e p a r a t e di n2 2 5 s i nt h et h i r dc h a p t e r , af a s tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e mf o rp r o t e i ns e p a r a t i o n w a sd e v e l o p e db a s e do nas h o r tc a p i l l a r y t h el i fd e t e c t i o na n ds l o t t e d v i a la r r a y s a m p l ei n t r o d u c t i o ns y s t e mw a su s e d t h ep r o t e i ns a m p l ew a ss e p a r a t e du s i n gt h i s s y s t e mw h i c hh a st h ea d v a n t a g e so fa u t o m a t e do p e r a t i o n ，f a s ts e p a r a t i o na n dg o o d r e p e a t a b i l i t y k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；p r o t e i n s e p a r a t i o n ； l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n 2 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 前言 第一章緒論 2 0 世紀(jì)9 0 年代初m a n z 和w i d m e r 首次提出了以微機(jī)電加工技術(shù) ( m i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 和分析化學(xué)為基礎(chǔ)的微全分析系統(tǒng) ( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，p t a s ) 的概念【l j 。19 9 2 年m a n z 等 2 1 首次 報(bào)道了基于微流控芯片的高效高速毛細(xì)管電泳分離系統(tǒng)，展示了其巨大的發(fā)展?jié)?力。微流控芯片毛細(xì)管電泳技術(shù)將常規(guī)的毛細(xì)管電泳操作在芯片上進(jìn)行，利用玻 璃、石英或各種聚合物材料加工微米級微通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，對樣 品進(jìn)行進(jìn)樣、分離和檢測。 近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，在蛋白質(zhì)、d n a 等生物大分子的分離分析中表現(xiàn) 出了顯著的優(yōu)越性。當(dāng)前，隨著蛋白組研究的深入和發(fā)展，如何實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速 高效的分離成為需要解決的重要問題。在芯片上進(jìn)行蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電泳分離可 以顯著地提高分析速度和分離效率，因此，這一研究方向引起了廣泛關(guān)注，已有 較多論文發(fā)表。微流控芯片毛細(xì)管電泳系統(tǒng)應(yīng)在蛋白質(zhì)的分離分析方面所具有的 突出優(yōu)越性，使其在臨床檢驗(yàn)及現(xiàn)場監(jiān)測等方面的應(yīng)用具有良好的發(fā)展前景，同 時(shí)，其對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā)展也具有重要意義。 微流控芯片毛細(xì)管電泳應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離分析存在的重要問題是芯片通道 內(nèi)壁對蛋白質(zhì)大分子的吸附作用。蛋白質(zhì)與芯片通道內(nèi)壁之間的微小吸附效應(yīng)就 會降低蛋白質(zhì)的分離效率，引起峰形變寬拖尾，影響分離的重現(xiàn)性。目前已經(jīng)有 很多研究者正致力于這一問題的解決中。 以下將對采用微流控芯片毛細(xì)管電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的分離模式、特點(diǎn)及其 蛋白吸附問題進(jìn)行介紹。 1 2 微流控芯片毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分離模式 微流控芯片毛細(xì)管電泳與常規(guī)毛細(xì)管電泳的分離原理相同，因此在分離生物 大分子樣品方面具有優(yōu)勢。此外，與常規(guī)毛細(xì)管系統(tǒng)相比，芯片毛細(xì)管電泳系統(tǒng) 3 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 還具備以下優(yōu)點(diǎn)：分離時(shí)間短、分離效率高、系統(tǒng)體積小且易實(shí)現(xiàn)不同操作單元 的集成【3 羽。芯片毛細(xì)管電泳上述優(yōu)點(diǎn)使其成為蛋白質(zhì)分離分析中的重要手段之 一o r o d r i g u e z 等【7 】曾分別在常規(guī)毛細(xì)管、短毛細(xì)管和玻璃芯片上，以區(qū)帶電泳的 分離模式，對人免疫球蛋白g ( i g g ) 和熒光素異硫氰酸酯( f i t c ) 的反應(yīng)混合 物進(jìn)行分離，以比較三種系統(tǒng)的分離性能。使用有效分離長度為3 5c m 的長毛細(xì) 管和有效分離長度為6c m 的短毛細(xì)管時(shí)，其分離時(shí)間分別為3 3 5s 和8 4s ，理論塔 板數(shù)分別為2 7 7 5 0 和4 1 8 1 6 。當(dāng)使用有效分離長度僅為2 8c m 的玻璃芯片時(shí)，分離 時(shí)間縮短至1 6sn 理論塔板數(shù)達(dá)至u 4 9 0 0 0 。使用玻璃芯片進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳在 分離速度和柱效上明顯優(yōu)于常規(guī)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。 目前，文獻(xiàn)報(bào)道的芯片毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分離系統(tǒng)，主要采用區(qū)帶電泳、凝 膠電泳、等電聚焦、膠束電動色譜及二維電泳模式等分離模式。 1 2 1 芯片毛細(xì)管區(qū)帶電泳 毛細(xì)管區(qū)帶電泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是芯片毛細(xì)管電泳蛋 白質(zhì)分離中最基本的一種分離模式。它是基于不同的蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移 速率不同而實(shí)現(xiàn)分離的，是一種簡單，快速的分離方法，采用區(qū)帶電泳的分離模 式已成功分離多種蛋白質(zhì)樣品。 c o l y e r 等【8 】采用毛細(xì)管電泳芯片，以區(qū)帶電泳模式對人血清蛋白樣品進(jìn)行了 分離，可分辨出四個(gè)蛋白質(zhì)區(qū)帶( 即i g g 、轉(zhuǎn)鐵蛋白、a 1 一胰蛋白酶抗體和白蛋 白區(qū)帶，分別用以模擬血清蛋白樣品中的np 、伍l 和白蛋白區(qū)帶) 。其中蛋白質(zhì) 的熒光標(biāo)記在分離之后進(jìn)行，由于熒光染料t n s ( 2 - t o l u i d i n o n a p h t h a l e n e 6 s u l f o n a t e ) 標(biāo)記血清蛋白的靈敏度較低，所以沒能實(shí)現(xiàn)實(shí)際人血清蛋白樣品的五 區(qū)帶分離。芯片構(gòu)型設(shè)計(jì)如圖1 所示，通道深度為1 4p m ，細(xì)通道寬6 6p m ，粗 通道寬2 4 0l a m ，分離通道長度約為4 9 “m 。 4 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖1蛋白質(zhì)分離芯片通道構(gòu)型示意圖 x i a o 等f 9 1 采用區(qū)帶電泳模式，以5 0m m 的磷酸鹽緩沖液( p h2 1 5 ) 作為工 作緩沖液，在通道寬度為3 0l a m 、深度為1 0p , m 的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 芯 片中，于3 5s 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞色素c 和溶菌酶的快速分離，分離電壓4 0 0 0v ，分 離長度3 5c m 。芯片結(jié)構(gòu)如圖2 所示。 圖2 芯片通道構(gòu)犁示意圖 d o d g e 等【l o 】設(shè)計(jì)了集成多個(gè)微閥和微泵的p d m s 芯片( 如圖3 ) ，通過微閥 5 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 微泵實(shí)現(xiàn)了對液流的有效控制。首先采用區(qū)帶電泳的分離模式分離牛血清白蛋白 和肌紅蛋白，然后通過閥的作用將分離后的蛋白質(zhì)組分分別引入微混合器中酶 解，最后對產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。該工作顯示芯片技術(shù)可用于質(zhì)譜分析前復(fù)雜蛋白 樣品的預(yù)處理。 v a l v e lw a s t e s e p a r a t i o n 圖3 集成有微泵微閥的蛋白質(zhì)分離和酶解芯片通道構(gòu)型示意圖 莊貴生等1 1 1 】在石英芯片上以p h1o 3 ，7 5m m 的硼酸鹽緩沖液作為芯片電泳 緩沖體系，分離了免疫球蛋白、僅1 抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和鐵傳遞蛋白， 并對經(jīng)臨床確診的妊娠高血壓癥、風(fēng)濕性心臟病、多發(fā)性骨髓瘤患者的尿液樣品 進(jìn)行電泳分析，在2m i n 內(nèi)得到了與美國h e l e n a 電泳系統(tǒng)一致的分析結(jié)果，其 對四種標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合樣品的電泳分離圖譜如圖4 所示。 6 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖4四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合樣本電泳圖譜 ( 1 ) 免疫球蛋白( 2 ) 鐵傳遞蛋白( 3 ) a 1 抗胰蛋白酶( 4 ) 牛血清白蛋白 對于芯片毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離蛋白質(zhì)研究，通道表面對大分子蛋白質(zhì)的吸附 是所要解決的一個(gè)重要問題。在毛細(xì)管區(qū)帶電泳的分離模式下，一般采用通道內(nèi) 壁永久改性和緩沖液中加入添加劑進(jìn)行動態(tài)修飾兩種方法來抑制蛋白質(zhì)的吸附。 w u 等【1 2 】采用多層8 8 水解聚丙烯醇( p v a ) 修飾p d m s 芯片，以區(qū)帶電泳的 模式有效分離了兩種堿性蛋白質(zhì)溶菌酶和核糖核酸酶( 圖5 ) ，以及兩種典型的酸 性蛋白質(zhì)牛血清白蛋白和p 乳球蛋白。該涂層在p h3 1 1 范圍內(nèi)均可抑制電滲流 的產(chǎn)生和蛋白的吸附作用，并且效果穩(wěn)定，連續(xù)運(yùn)行7 0 次后分離效果仍然很好。 該研究組【1 3 ，1 4 】隨后又采用自組裝方法在p d m s 芯片通道表面加工環(huán)氧修飾的聚 合物涂層，來抑制蛋白質(zhì)的吸附作用，成功分離溶菌酶和核糖核酸酶a 。 7 浙江大學(xué)碩上學(xué)位論文 0 s1 0 52 0筠筠4 0 s ) 圖5 溶菌酶( 1 ) 和核糖核酸酶( 2 ) 在不同處理的p d m s 芯片上的電泳圖 ( a ) 末處理芯片；( b ) 0 2 等離子處理芯片；( c ) 0 2 等離子處理、1 0 0 水解聚乙烯醇修飾芯片； x i a o 等【9 1 對p d m s 芯片通道內(nèi)表面進(jìn)行聚丙烯酰胺表面處理，減少了通道 表面對蛋白的吸附，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞色素c 和溶菌酶的快速分離，分離譜圖如圖6 所示。 c h i e m 等在運(yùn)行緩沖液中加入了無機(jī)電解質(zhì)n a c l 和中性表面活性劑吐溫 2 0 來抑制蛋白的吸附，利用芯片毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)行了單克隆抗體的分離分析， 圖7 為電泳分離譜圖。 8 孫勰勰舸弱筋孔囂舷黝笱 歲一窶蕃袋西-onli 圖6 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺處理過的p d m s 芯片上的電泳分離圖 02 04 ( 6 08 0 t i m e ( s 圖7f i t c 標(biāo)記的人免疫球蛋白和牛血清白蛋白的電泳分離圖 9 ，0v夤基霜粵口墨 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 2 芯片毛細(xì)管凝膠電泳 在蛋白組學(xué)和蛋白分離的研究中，凝膠電泳是廣泛使用的分離技術(shù)。它是以 凝膠等聚合物作為分離介質(zhì)，利用其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并依據(jù)被測組分的分子體積不同而 進(jìn)行分離的一種分離模式。在芯片上采用毛細(xì)管凝膠電泳( c a p i l l a r yg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 模式分離蛋白質(zhì)，蛋白譜峰尖銳，柱效提高，更有利于實(shí) 現(xiàn)分離操作的高速度和高效率。y a o 等f 1 6 】采用s d s 凝膠電泳分離模式，對比了 芯片上的s d s 毛細(xì)管凝膠電泳與常規(guī)毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的性能， 前者的分離效率和分離時(shí)間明顯優(yōu)于后者。 與常規(guī)毛細(xì)管凝膠電泳相同，芯片毛細(xì)管凝膠電泳常用的篩分介質(zhì)也分為凝 膠和非膠聚合物溶液兩種。交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠是廣泛使用的一種凝膠篩分介 質(zhì)，h e r r 等【1 7 】首次將傳統(tǒng)的s d s 聚丙烯酰胺凝膠電泳( s d s p a g e ) 分離蛋白質(zhì)的 方法移植到芯片上，使用光聚合的方法在芯片通道內(nèi)制備濃度為6 的交聯(lián)聚丙 烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)( 如圖8 所示) ，在3 0s 的時(shí)間內(nèi)對分子量在6 5 3 9k d a 之間的五種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，分離距離僅為4m i l l ，分離理論塔板數(shù)達(dá)到4 4 1 x 1 0 5 。 限，舅 b 一 l 象 ， 一；卜 f e 夸 嘲 4 ； 8 ，o ，2 弘? 嗡l 。一奄 ：； s w i i3 21 獺，j 窶糍嗍嘞一： t r i m w f $ 掬坼 圖8 光聚合于芯片通道內(nèi)制備交聯(lián)聚丙烯酰胺篩分介質(zhì)的方法示意圖 ( a ) 芯片通道；( b ) 通道內(nèi)充滿丙烯酰胺單體；( c ) 不聚合部分用掩膜遮蓋，紫外光源照射 使單體聚合；( d ) 無掩模處形成聚丙烯酰胺；( e ) 蛋白質(zhì)遷移分離 l o ! 蘭! ! ! ：竺! 湊警一 、7 土一￥ 圖9 具有試樣預(yù)濃集和s d s - p a g e 分離功能的蛋白質(zhì)分析芯片 a g i r r e g a b i r i a 等 1 9 1 在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 芯片上使用s u 一8 光膠制 作微通道，采用濃度為1 2 的聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)分離蛋白，分離場強(qiáng) 3 4 3v m 。隨后，該研究組刪又在該芯片上集成金屬電極，采用相同的分離模式 成功分離了分子量分別為2 0k d a 和9 7 k d a 的胰蛋白酶抑制劑和磷酸化酶兩種蛋 白質(zhì)。芯片示意圖和分離蛋白譜圖見圖1 0 。 l 8 l c er ，u 口m ( a ) 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 ( b ) 圖l o ( a ) 集成金屬電極的p m m a 微流控芯片 ( b ) 胰蛋白酶抑制劑( 1 ) 和磷酸化酶( 2 ) 兩種蛋白質(zhì)的分離譜圖 然而，交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠存在制備復(fù)雜，不易使用，使用壽命短等問題。 與其相比，線性聚丙烯酰胺( p l a ) 、聚乙烯醇( p e g ) 、聚氧化乙烯( p e o ) 、 甲基纖維素( m c ) 、葡聚糖( d e x t r a n ) 等非膠篩分介質(zhì)具有制備簡單，使用方 便，可以先聚合后注入通道而無需在通道內(nèi)進(jìn)行聚合反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，適合在復(fù)雜的 通道體系中使用。因此，在芯片毛細(xì)管凝膠電泳中非膠篩分介質(zhì)得到了廣泛的應(yīng) 用。 y a o 等【1 6 】采用s d s1 4 2 0 0 凝膠緩沖液( b e c k m a nc o u l t e r 公司產(chǎn)品) 比較了 使用毛細(xì)管的s d s 凝膠電泳和使用芯片的s d s 凝膠電泳效果。使用芯片大大縮 短了分離時(shí)間，通過對分離電壓等條件進(jìn)行優(yōu)化( 見圖1 1 ) ，在4 5c m 的分離長 度中于3 5s 內(nèi)分離了分子量在9 1 1 6k d a 之間的六種蛋白質(zhì)。 1 2 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 坌 蘭 2 呈 。 罌 8 簍 寶 芷 圖1 l不同分離電壓下芯片凝膠電泳分離六種蛋白質(zhì)的圖譜 ( 1 ) 鈣調(diào)蛋白( 2 ) 0 t 乳白蛋白( 3 ) 胃蛋白酶原( 4 ) 卵清蛋白( 5 ) 牛血清白蛋白 ( 6 ) 1 3 - 半乳糖營酶 g i o r d a n o 等 2 1 l 將n a n o o r a n g e 染料加入樣品和緩沖液中進(jìn)行蛋白質(zhì)的動態(tài)標(biāo) 記，研究了利于動態(tài)標(biāo)記蛋白質(zhì)的緩沖液體系，包括篩分凝膠、離子強(qiáng)度和s d s 濃度的選擇。該系統(tǒng)最終選擇5 的p e o ( 1 0 0k d a ) 作為篩分介質(zhì)，對牛血清白 蛋白的檢出限為5 0 0n g m l ，并完成了對實(shí)際人血清樣品的分離分析。 在芯片毛細(xì)管凝膠電泳中，通道內(nèi)壁對蛋白質(zhì)的吸附仍是所要解決的重要問 題。b o u s s e 等【2 2 】將蛋白質(zhì)的分離、染色、脫色以及檢測過程整合在一起，開發(fā) 了一個(gè)微型分析系統(tǒng)( 芯片結(jié)構(gòu)如圖1 2 ) 。使用聚二甲基丙烯酰胺( p d m a ) 物 理涂覆玻璃芯片微通道內(nèi)壁，將電滲流降低到o 5 x 1 0 母m 2 v 。s 一，以s d s 凝膠電泳 的分離模式在4 0s 內(nèi)分離了b i o r a d 公司蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，分離效率達(dá)到l o7 塔板 數(shù)米。圖1 3 為分離結(jié)果記錄圖。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖1 2 集分離、染色、脫色以及檢測過程于一體的芯片結(jié)構(gòu)示意圖 圖1 3b i o r a d 公司蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳分離圖譜 n a g a t a 等【2 3 】在p m m a 芯片中使用了聚乙二醇( p e g ) 涂層，篩分介質(zhì)為5 的線性聚丙烯酰胺，在分離長度為3m m 的通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶抑制劑、牛血 清白蛋白和1 3 - 半乳糖苷酶三種蛋白質(zhì)的高速分離，分離時(shí)間僅為8 s 。 1 4 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 3 芯片等電聚焦分離 芯片等電聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 分離蛋白質(zhì)的原理與常 規(guī)毛細(xì)管等電聚焦基本相同，都是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( p i ) 不同而進(jìn)行分離。 h o f m a n n 等【2 4 j 首次將毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)移植于玻璃芯片，應(yīng)用于蛋白質(zhì) 分析。l i 等【2 5 】在p d m s 芯片和聚碳酸酯( p c ) 芯片上進(jìn)行毛細(xì)管等電聚焦分離， 分離通道寬1 0 0p m ，深4 0p m ，長1 2c n l ，陽極電解液和陰極電解液分別采用 1 0m m 磷酸( p h2 8 ) 和0 5 氨水( p h1 0 5 ) ，蛋白質(zhì)樣品( 2 5n g l a lb s a 和 1 0n g p l 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白( e g f p ) ) 和2 的p h a r m a l y t e3 1 0 溶液充滿通 道，在5 0 0v c m 的分離場強(qiáng)下，分離b s a 和e g f p 。分離效果如圖1 4 所示。 a 瑚 瑚 o 姍瑚螄蜘螄瑚陽鼬 e g f p 瑚姍3 鯽鋤4 弼湘腳啦圈 p 毗 圖1 4p d m s 芯片( a ) 和p c 芯片( b ) 上的e g f p 和b s a 等電聚焦分離 d a s 等【2 6 1 采用高聚物芯片，在等電聚焦電泳模式下優(yōu)化了分離長度及電壓條 1 5 跚鯽枷瑚鼢渤鯽粕搬0 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 件，最終采用長1 9c m 的通道，在1 5m i n 內(nèi)分離了綠熒光蛋白和r 藻紅蛋白， 分離電壓為5 0 0 v 。 c u i 等2 7 】在p d m s 芯片上采用等電聚焦分離模式成功分離了重組綠熒光蛋 白、異藻青蛋白和藻紅蛋白。該作者還報(bào)道，通過改變樣品和分離介質(zhì)中添加劑 甲基纖維素的濃度，可以改變完成蛋白質(zhì)分離所需要的通道距離，結(jié)果如圖1 5 所示。 ； c c l 一，一a 一一一夏 l l 一3 0受 乏o 伯國 圖1 5 不同介質(zhì)對p d m s 芯片等電聚焦分離蛋白質(zhì)的影響 ( a ) 樣品和電極液中都不含m c ( b ) 樣品中含0 4 m c ，電極液中含0 2 m c ( c ) 樣品中含0 4 m c ，電極液中含2 5 m c t s a i 等【2 8 】通過采用六甲基二硅氧烷等離子聚合膜修飾玻璃芯片通道的方法 抑制蛋白吸附，在等電聚焦的分離模式下分離了藻青蛋白( p i4 6 5 ) ，血紅蛋白 ( p i7 0 ) 和細(xì)胞色素c ( p i9 6 ) 三種蛋白混合物，分離在3m i n 內(nèi)完成，分離效 率為1 9 6 0 0 塔板數(shù)米。 h u a n g 等2 9 】在進(jìn)行芯片等電聚焦蛋白分離操作時(shí)，采用在兩性電解質(zhì)溶液中 加入羥甲基纖維素作為添加劑的方法來抑制蛋白的吸附。 1 6 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 4 芯片膠束電動毛細(xì)管電泳 膠束電動毛細(xì)管電泳( m i c e l l a re l c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 是毛細(xì)管電泳與膠束增溶色譜相結(jié)合的分離技術(shù)，其原理是在裝有膠束溶液的通 道內(nèi)，溶質(zhì)組分在電場力的作用下根據(jù)其在膠束相和水相之間的分配不同而產(chǎn)生 分離。目前，最常使用的形成膠束的表面活性劑為s d s 。 j i n 等【3 0 】在玻璃芯片上進(jìn)行動態(tài)標(biāo)記，采用膠束電動色譜的分離模式，成功 實(shí)現(xiàn)了分子量在1 4 4 - - 2 0 0k d a 之間的八種蛋白質(zhì)的分離。芯片通道寬1 2 0l x m ， 深3 0 “i i l ，以b i o r a d 公司的c e s d s 緩沖液作為分離介質(zhì)；分離電壓4 0 0v ， 進(jìn)樣時(shí)間5 0s ，分離電壓4 2 0 0 v ，分離時(shí)間2 4 0s 。圖1 6 為8 種蛋白的分離譜圖。 圖1 6 激光誘導(dǎo)熒光檢測芯片膠束電泳分離8 種蛋白質(zhì) ( 1 ) 溶解酵素( 1 4 4k o a ) ；( 2 ) 胰島素抑制劑( 2 1 5k o a ) ：( 3 ) 碳脫水酶( 3 1 ok d a ) ；( 4 ) 卵清蛋白( 4 5 0k d a ) ；( 5 ) 血清白蛋1 芻( 6 6 2k d a ) ；( 6 ) 磷酸化酶b ( 9 7 0k d a ) ；( 7 ) a 一半 乳糖苷酶( 11 6k d a ) ；( 8 ) 肌球蛋白( 2 0 0k d a ) 。 d o u 等采用b r i j 3 5 修飾p d m s 芯片通道，在膠束電動色譜的分離模式下 實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白的有效分離( 圖1 7 ) 。該芯片涂層在p h6 1 2 1 7 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 范圍內(nèi)能顯著降低蛋白質(zhì)大分子的吸附，并減少檢測蛋白質(zhì)所需的沖洗時(shí)間，從 而提高分離效率。 2 2 4 0 釉l 1 2 臼 m i g r a t i o nt i m e s l l v t i 圖1 7b r i j 3 5 修飾p d m s 芯片通道中連續(xù)進(jìn)樣電泳圖 ( 1 ) 葡萄糖氧化酶( 2 ) 肌紅蛋白 h u a n g 等【3 2 1 在p d m s 芯片中采用0 1 的十二烷基麥芽糖( d d m ) 和0 0 3 的s d s 作為混合膠柬，對通道進(jìn)行動態(tài)修飾，可有效抑制蛋白吸附，控制電滲 流，使蛋白質(zhì)在非變性條件下得到有效分離。 1 2 5 芯片二維電泳分離 芯片毛細(xì)管電泳應(yīng)用的成功促進(jìn)了高速高效的芯片二維電泳技術(shù)的發(fā)展。對 于多組分復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品，采用傳統(tǒng)的一維分離方法顯然無法滿足要求，需要采 用而未分離技術(shù)來提高分離效率，增加峰容量。與傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)相比，在 芯片上進(jìn)行二維電泳分離，可以通過設(shè)計(jì)芯片通道結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)通道的直接交叉或連 通，而無需制作復(fù)雜的二維毛細(xì)管電泳接口，從而避免了接口處死體積致使譜帶 擴(kuò)展的影響。 在芯片二維電泳分離蛋白質(zhì)的研究中，第一維分離模式多采用基于蛋白等電 1 8 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 點(diǎn)聚焦分離的等電聚焦模式。c h e n 等【3 3 】制作了二維毛細(xì)管電泳p d m s 芯片，利 用第一維的等電聚焦和第二維的凝膠電泳對熒光標(biāo)記的牛血清白蛋白和碳酸酐 酶以及德科薩斯紅標(biāo)記的卵清蛋白進(jìn)行分離分析。 l i 等【3 4 】設(shè)計(jì)的等電聚焦和凝膠電泳聯(lián)用的二維分離高聚物芯片( 如圖1 8 所 示) ，蛋白質(zhì)樣品在完成一維等電聚焦分離后，可在多個(gè)并行的通道內(nèi)完成凝膠 電泳分離。整個(gè)分離過程在1 0m i n 內(nèi)完成，峰容量達(dá)到1 7 0 0 。 圖1 8 芯片二維分離結(jié)構(gòu)及五種模型蛋白分離熒光圖像 h e r r 等【3 5 】研制了采用十字通道構(gòu)型的等電聚焦一自由區(qū)帶電泳二維芯片電泳 分離系統(tǒng)( 如圖1 9 所示) ，芯片通道寬2 0 0g m ，深2 0g m ，待測樣品在橫向通 道中進(jìn)行等電聚焦分離，分離后的樣品區(qū)帶在電場驅(qū)動下進(jìn)入縱向區(qū)帶電泳通道 中進(jìn)行第二維分離。系統(tǒng)采用熒光顯微鏡成像的方法對分離性能進(jìn)行評價(jià)，5m i n 內(nèi)分離的峰容量達(dá)到1 3 0 0 。 1 9 浙江大學(xué)碩十學(xué)位論文 a 罄1 一馬一 一 j -一 ri 粵! d 1 i 材l e o f ：2 涎e c l o fa r e a 圖1 9 芯片二維分離結(jié)構(gòu)示意圖 w a n g 等t 3 6 1 黼p d m s 芯片中制作微閥來防止一維等電聚焦和二維凝膠電 泳二者的分離緩沖液相混合( 圖2 0 ) ，在2 0 - m i n 內(nèi)有效分離了四種標(biāo)準(zhǔn)蛋白。 p e a k t 啪s f e r r e g l o n 3 嗍 ( a ) d e a dv o l u m e 弋。 j j l 卜 j g ： ，、 。 - 一吝 。 圖2 0p d m s 芯片通道和四個(gè)分離步驟示意圖 ! ! ! 竺! ! 竺! 也有報(bào)道在p m m a 芯片上，將s d s 凝膠電泳和膠束電動毛細(xì)管電泳相結(jié)合 的蛋白質(zhì)二維電泳分離0 7 l ( 如圖2 1 所示) ，該系統(tǒng)在1 2r a i n 內(nèi)完成1 0 種蛋白 質(zhì)的分離，峰容量約為1 0 0 0 。 a o 卜0 = l 豫乏 器髻警車； b 工 圖2 l ( a ) 芯片二維分離結(jié)構(gòu)示意圖 f b ) - - 維分離交界處熒光圖像 膠柬電動毛細(xì)管電泳或毛細(xì)管電色譜也多做為第一維分離模式與區(qū)帶電泳 相結(jié)合，用于蛋白質(zhì)酶解物的分離分析。2 0 0 0 年，r a m s c y 課題組刪首次在玻璃 芯片上建立了膠束電動毛細(xì)管電泳( 第一維) 與區(qū)帶電泳( 第二維) 結(jié)合的二維 分離系統(tǒng)，應(yīng)用于細(xì)胞色素c 、核糖核酸酶、廿乳白蛋白等的胰酶降解產(chǎn)物分離。 后來，該課題組 3 9 1 對其進(jìn)行改進(jìn)，加長第一維電泳通道長度，并采用細(xì)直徑轉(zhuǎn)角 通道來降低擴(kuò)散( 圖2 2 ) ，在約1 5 m i n 內(nèi)分離牛血清白蛋白酶解物，峰容量達(dá)到 4 2 0 0 。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 a 6 3 0 l l m b 圖2 2 ( a ) 二維電泳芯片結(jié)構(gòu)示意圖 ( b ) 1 3 直徑轉(zhuǎn)角通道示意圖 | 1 2 5 p “ 2 0 0 1 年，r a m s e y 課題組【4 0 】還研制了開管電色譜和區(qū)帶電泳相結(jié)合的芯片二 維電泳系統(tǒng)( 圖2 3 ) ，其電色譜分離部分采用長2 5c m 的十八烷基三甲氧基硅烷 涂層的環(huán)狀通道，取代電泳部分則采用長1 2c m 的直形通道，在1 3r a i n 內(nèi)實(shí)現(xiàn) 了p 一酪蛋白胰蛋白酶解產(chǎn)物的分離。 5c m 圖2 3 二維分離芯片結(jié)構(gòu)示意圖 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 相對一維分離芯片，二維芯片分離系統(tǒng)具有很高的分離效率和峰容量，預(yù)計(jì) 會在復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分離上發(fā)揮更大的作用。 1 2 6 其他模式 除上述分離模式外，芯片自由流電泳以及芯片電色譜也是芯片電泳分離蛋白 質(zhì)的重要方法。 芯片自由流電泳是指在芯片中通過外加電場使樣品隨緩沖液連續(xù)流動并同 時(shí)在順電場方向進(jìn)行電遷移，從而按照電泳淌度不同實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離模式。 r a y m o n d 等【4 1 】采用芯片自由流電泳模式分離了人血清蛋白，緩激肽和核糖核酸酶 a ( 圖2 4 ) ，其分離長度為3 1c m ，流出時(shí)間為6 2s 。 e 匕a l 列 b ；。i l l 二u 氓：歹 b 久一心 1 ) i s t u n c ea c r o s s s c l 甜r ；l l i o n 摶擘i l r a m ) 圖2 4自由流電泳模式下不同場強(qiáng)的蛋白分離圖 ( a ) f i t c ；( b ) 人血清蛋白：( c ) 緩激肽；( d ) 和核糖核酸酶a k o b a y a s h i 4 2 1 采用自由流電泳的分離模式在一個(gè)體積為5 6 5m m x 3 5 m m x 3 0 “m 的微分離室( 6 0p l ) 中實(shí)現(xiàn)了持續(xù)的蛋白分離，并用羥丙基甲基纖維 素涂覆來抑制蛋白吸附，在2 5m i n l 為有效分離了細(xì)胞色素c 和肌紅蛋白。 一譬lll毒，11囂一萎銣u釬翟岱茹一 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 最近，k a h l h e y e r 等【4 3 1 制作了一種自由流等電聚焦分離蛋白質(zhì)的玻璃芯片， 成功的將人血清白蛋白( p i4 4 ) 與等電聚焦標(biāo)記物( p h3 年f 1 9 ) 分離。分離效果 見圖2 5 。 1 0 剛 2 p 二 ， ，一 i ， ， - ， ； ” ， _ ，(a p j i ” ，“ - - _ ， 3 h s a p 1 4 4 i9 洌豳黧震 燃溺黝緩緩緩緩緩蠓 - a 】 e = 2 0 v m m + 州g r a d i e n t 圖2 5自由流電泳分離圖 芯片毛細(xì)管電色譜分離模式是采用m e m s 技術(shù)在芯片上制備分離性能良好 的電色譜柱，將高效液相色譜的高選擇性和毛細(xì)管電泳的高效性結(jié)合，根據(jù)組分 在固定相和流動相之間分配系數(shù)不同以及電泳速率差異對各組分進(jìn)行分離的方 法。近來，有關(guān)芯片毛細(xì)管電色譜分離蛋白質(zhì)的報(bào)道較少，而較多的應(yīng)用于蛋白 質(zhì)的酶解物的分離分析【4 4 4 5 1 。h e 等【4 6 1 采用c 1 8 修飾的c o m o s s ( c o l l o c a t e d m o n o l i t hs u p p o r ts t r u c t u r e s ) 整體柱分離了卵白蛋白的胰蛋白酶消解產(chǎn)物。該s l e n t z 等【4 7 , 4 8 $ 1 j 作了c o m o s s 整體柱p d m s 芯片( 如圖2 6 所示) ，并通過在c o m o s s 表 面涂敷c 1 8 - a m p s 等5 種試劑，實(shí)現(xiàn)了牛血清白蛋白消解產(chǎn)物的選擇性分離。 fslitjr一ee)，；亨 扎和8”舶爭 k耋譬 浙江大學(xué)碩十學(xué)位論文 1 3 總結(jié) 裊 v 吞 黧窿 q 竹 圖2 6p d m s 芯片c o m o s s 整體柱分離通道結(jié)構(gòu)示意圖 微流控芯片毛細(xì)管電泳是一種快速、高效的分離分析技術(shù)，必將成為實(shí)現(xiàn)蛋 白質(zhì)靈敏、快速、準(zhǔn)確的有效分離的重要方法。微流控芯片毛細(xì)管電泳系統(tǒng)應(yīng)用 于蛋白質(zhì)的分離分析具有突出的優(yōu)越性，特別是在臨床檢驗(yàn)及現(xiàn)場監(jiān)測等方面的 應(yīng)用具有良好的發(fā)展前景。另外，其對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā) 展也具有重要意義。 目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研 究，利用質(zhì)譜分辨率高、靈敏度高、檢測速度快等特點(diǎn)進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的分離 分析通量，以適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分離分析。相信隨著研究的不斷深入及相 關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控芯片毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分離技術(shù)將同趨成熟，逐步實(shí) 現(xiàn)分析樣品的多元化、分析儀器的便攜化、集成化，從而實(shí)現(xiàn)真正意義上的小型 化實(shí)驗(yàn)室。微流控芯片毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分離技術(shù)必將在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮至關(guān)重要 的作用，并擁有廣闊的發(fā)展前景。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 參考文獻(xiàn) 1 】m a n za ，g r a b e rn ，w i d e m e rhm s e n s a c t u a t o r sb ，1 9 9 0 ，b 1 ：2 4 4 【2 】2 m a n z a ，h a r r i s o ndj ，v e r p o o r t eem j ，f e t t i n g e rjc ，p a u l u sa ，l u d ih ， w i d e m e rh m j c h r o m a t o g r a ，19 9 2 ，5 9 3 ：2 5 3 3 】v i l k n e rt ，j a n a s e kd ，m a n za ，a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：3 3 7 3 【4 】r e y e sdr ，i o s s i f i d i sd ，a u r o u xpa ，m a n za ，a n a l c h e m ，2 0 0 2 ，7 4 ：2 6 2 3 【5 】d o l n i kv l i usr ，j o v a n o v i c hs ，e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 0 ，2 1 ：41 6 】b e l d e rd ，l u d w i gm ，e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 3 ，2 4 ：2 4 2 2 【7 】r o d r i g u e zi ，z h a n gyl e ehk ，l isfyj c h r o m a t o g r a ，1 9 9 7 ，7 8 1 ：2 8 7 【8 】c o l y e rcl ，m a n g r usd ，h a r r i s o ndj j c h r o m a t o g r a ，19 9 7 ，7 81 ：2 71 【9 】x i a odq ，l etv ，w i r t hmj a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：2 0 5 5 【10 d o d g ea ，b r u n e te ，c h e ns ，g o u l p e a uj ，l a b a sv 1 1 1 1j ，t a b e t i n gp a n a l y s t ，2 0 0 6 ，1 3 1 ：11 2 2 【1l 】莊貴生，劉菁，賈春平，金慶輝，王惠民，楊夢蘇，趙建龍化學(xué)學(xué)報(bào)， 2 0 0 6 ，6 4 ：2 2 9 【1 2 】w udp ，l u oyz h o uxm ，d a izp ，l i nb c e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 5 ，2 6 ：2 1 1 【1 3 】w udp ，z h a obx ，d a izp ，q i njh ，l i nbc l a bc h i p ，2 0 0 6 ，6 ：9 4 2 【1 4 w udp ，q i njh ，l i nb c l a bc h i p ，2 0 0 7 ，7 ：1 4 9 0 15 】c h i e mn ，h a r r i s o ndj a n a l c h e m ，19 嘰6 9 ：3 7 3 16 】y a os ，a n e xds ，c a l d w e uwb ，a r n o l ddw ：s m i t hkb p r o c n a t l a c a d s c i u s a ，19 9 9 ，9 6 ：5 37 2 【17 】h e r rae ，s i n g hak a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：4 7 2 7 【18 h a t c hav ，h e r rae ，t h r o c k m o r t o ndj ，b r e n n a njs ，s i n g hak a n a l c h e m ，2 0 0 6 ，7 8 ：4 9 7 6 【19 】a g i r r e g a b i r i am ，b l a n c of ，b e r g a n z oj ，f u l l a o n d oa ，z u b i a g aa m ，m a y o r a k ，r u a n o l 6 p e zjm e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 6 ，2 7 ：3 6 2 7 2 0 】a r r o y omt ，f e m f i n d e zlj ，a g i r r e g a b i r i am ，i b 百m e z ln ，a u r r e k o e t x e aj ， b l a n c of j j m i c r o m e c h m i c r o e n g ，2 0 0 7 ，17 ：12 8 9 2 1 】g i o r d a n obc ，j i nlj ，c o u c haj ，f e r r a n c ejp ，l a n d e r sjpa n a l c h e m 2 6 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 0 0 4