（分析化學專業(yè)論文）微流控毛細管電泳分離蛋白質的研究.pdf

浙江大學碩士學位論文 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取 得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中 不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得逝姿盤鱟 或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研 究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 學位敝儲虢視簽錮期：w 年月7 日 學位論文版權使用授權書 本學位論文作者完全了解逝姿盤堂有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權 保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借 閱。本人授權迸婆盤堂可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進 行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。 ( 保密的學位論文在解密后適用本授權書) 學位論文作者簽名： 腳 簽字隰少份月( 日 學位論文作者畢業(yè)后去向： 工作單位： 通訊地址： 三三著三：壘塑月了日 簽字日期：抄廠年g 月、日 電話： 郵編： 浙江大學碩十學位論文 摘要 在芯片上進行蛋白質的毛細管電泳分離可以顯著地提高分析速度和分離效 率，并對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā)展具有重要意義。本工作采用 激光誘導熒光檢測的方法，對蛋白質在微流控玻璃芯片及短毛細管上的微流控毛 細管電泳分離系統(tǒng)進行研究，并成功實現(xiàn)了蛋白質的快速分離。 第一章介紹了微流控芯片毛細管電泳分離蛋白質的研究進展，對芯片毛細管 電泳分離蛋白質的各種分離模式進行了綜述，并介紹了不同分離模式下抑制通道 內壁對蛋白質大分子吸附的各種方法。 第二章，在課題組與上海光譜公司合作研制的生化分析儀上進行了蛋白質分 離的研究。分離了c y 5 標記的0 【一胰凝乳蛋白酶原a 及其雜質蛋白，并對抑制蛋 白質吸附的玻璃芯片涂層進行了研究。該分離系統(tǒng)以激光誘導熒光( l i f ) 系統(tǒng) 作為檢測器，并以夾流進樣的進樣模式及優(yōu)化的分離條件，于2 2 5s 內實現(xiàn)了樣 品的分離。 第三章介紹了一種基于短毛細管的毛細管凝膠電泳蛋白質分離系統(tǒng)。系統(tǒng)采 用激光誘導熒光檢測系統(tǒng)和缺口型試樣管陣列試樣引入技術，實現(xiàn)了自動化、高 速的的毛細管凝膠電泳分離蛋白質。該系統(tǒng)應用于蛋白質樣品的快速分離，具有 操作自動化、分離速度快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。 關鍵詞：微流控芯片；毛細管電泳；蛋白質分離；激光誘導熒光檢測 a bs t r a c t i nt h i sw o r k ，g l a s sc h i p b a s e da n ds h o r tc a p i l l a r y b a s e dm i c r o f l u i d i cc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m sw i t hl a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a sd e v e l o p e d t h e a b i l i t yt os e p a r a t ef l u o r e s c e i nd y e sl a b e l e dp r o t e i nw a ss h o w n i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h ed e v e l o p m e n t so ft h ec h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s f o rp r o t e i ns e p a r a t i o ni nr e c e n ty e a r sa r es u m m a r i z e d v a r i o u sc h i p b a s e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m s f o r p r o t e i ns e p a r a t i o n b a s e do nd i f f e r e n t c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o nm o d e sa r ei n t r o d u c e d f u r t h e r m o r e ，t h ea p p r o a c h e st o s u p p r e s st h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fm i c r o c h a n n e lo nc h i p sa r e d i s c u s s e d i nt h es e c o n d c h a p t e r , t h ep r o t e i ns e p a r a t i o n o n c h i p b a s e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s w a sp e r f o r m e d u s i n g al a b m a d e b i o a n a l y z e r c y 5 l a b e l e d a - c h y m o t r y p s i n o g e na a n do t h e rp r o t e i n sa r es e p a r a t e d v a r i o u sm e t h o d st os u p p r e s s t h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fm i c r o c h a n n e lo ng l a s sc h i p sw a ss t u d i e d t h el i fd e t e c t i o na n dt h ep i n c h e di n j e c t i o nm o d ea r ee m p l o y e df o rs a m p l ed e t e c t i o n a n di n t r o d u c t i o nr e s p e c t i v e l y u n d e rt h em o d i f i e dc o n d i t i o n s ，s a m p l ec o u l db e s e p a r a t e di n2 2 5 s i nt h et h i r dc h a p t e r , af a s tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e mf o rp r o t e i ns e p a r a t i o n w a sd e v e l o p e db a s e do nas h o r tc a p i l l a r y t h el i fd e t e c t i o na n ds l o t t e d v i a la r r a y s a m p l ei n t r o d u c t i o ns y s t e mw a su s e d t h ep r o t e i ns a m p l ew a ss e p a r a t e du s i n gt h i s s y s t e mw h i c hh a st h ea d v a n t a g e so fa u t o m a t e do p e r a t i o n ，f a s ts e p a r a t i o na n dg o o d r e p e a t a b i l i t y k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；p r o t e i n s e p a r a t i o n ； l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n 2 浙江大學碩士學位論文 1 1 前言 第一章緒論 2 0 世紀9 0 年代初m a n z 和w i d m e r 首次提出了以微機電加工技術 ( m i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 和分析化學為基礎的微全分析系統(tǒng) ( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，p t a s ) 的概念【l j 。19 9 2 年m a n z 等 2 1 首次 報道了基于微流控芯片的高效高速毛細管電泳分離系統(tǒng)，展示了其巨大的發(fā)展?jié)?力。微流控芯片毛細管電泳技術將常規(guī)的毛細管電泳操作在芯片上進行，利用玻 璃、石英或各種聚合物材料加工微米級微通道，以高壓直流電場為驅動力，對樣 品進行進樣、分離和檢測。 近年來該技術發(fā)展迅速，在蛋白質、d n a 等生物大分子的分離分析中表現(xiàn) 出了顯著的優(yōu)越性。當前，隨著蛋白組研究的深入和發(fā)展，如何實現(xiàn)蛋白質快速 高效的分離成為需要解決的重要問題。在芯片上進行蛋白質的毛細管電泳分離可 以顯著地提高分析速度和分離效率，因此，這一研究方向引起了廣泛關注，已有 較多論文發(fā)表。微流控芯片毛細管電泳系統(tǒng)應在蛋白質的分離分析方面所具有的 突出優(yōu)越性，使其在臨床檢驗及現(xiàn)場監(jiān)測等方面的應用具有良好的發(fā)展前景，同 時，其對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā)展也具有重要意義。 微流控芯片毛細管電泳應用于蛋白質分離分析存在的重要問題是芯片通道 內壁對蛋白質大分子的吸附作用。蛋白質與芯片通道內壁之間的微小吸附效應就 會降低蛋白質的分離效率，引起峰形變寬拖尾，影響分離的重現(xiàn)性。目前已經有 很多研究者正致力于這一問題的解決中。 以下將對采用微流控芯片毛細管電泳進行蛋白質分離的分離模式、特點及其 蛋白吸附問題進行介紹。 1 2 微流控芯片毛細管電泳蛋白質分離模式 微流控芯片毛細管電泳與常規(guī)毛細管電泳的分離原理相同，因此在分離生物 大分子樣品方面具有優(yōu)勢。此外，與常規(guī)毛細管系統(tǒng)相比，芯片毛細管電泳系統(tǒng) 3 浙江大學碩士學位論文 還具備以下優(yōu)點：分離時間短、分離效率高、系統(tǒng)體積小且易實現(xiàn)不同操作單元 的集成【3 羽。芯片毛細管電泳上述優(yōu)點使其成為蛋白質分離分析中的重要手段之 一o r o d r i g u e z 等【7 】曾分別在常規(guī)毛細管、短毛細管和玻璃芯片上，以區(qū)帶電泳的 分離模式，對人免疫球蛋白g ( i g g ) 和熒光素異硫氰酸酯( f i t c ) 的反應混合 物進行分離，以比較三種系統(tǒng)的分離性能。使用有效分離長度為3 5c m 的長毛細 管和有效分離長度為6c m 的短毛細管時，其分離時間分別為3 3 5s 和8 4s ，理論塔 板數(shù)分別為2 7 7 5 0 和4 1 8 1 6 。當使用有效分離長度僅為2 8c m 的玻璃芯片時，分離 時間縮短至1 6sn 理論塔板數(shù)達至u 4 9 0 0 0 。使用玻璃芯片進行毛細管區(qū)帶電泳在 分離速度和柱效上明顯優(yōu)于常規(guī)毛細管電泳系統(tǒng)。 目前，文獻報道的芯片毛細管電泳蛋白質分離系統(tǒng)，主要采用區(qū)帶電泳、凝 膠電泳、等電聚焦、膠束電動色譜及二維電泳模式等分離模式。 1 2 1 芯片毛細管區(qū)帶電泳 毛細管區(qū)帶電泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是芯片毛細管電泳蛋 白質分離中最基本的一種分離模式。它是基于不同的蛋白質分子在電場中的遷移 速率不同而實現(xiàn)分離的，是一種簡單，快速的分離方法，采用區(qū)帶電泳的分離模 式已成功分離多種蛋白質樣品。 c o l y e r 等【8 】采用毛細管電泳芯片，以區(qū)帶電泳模式對人血清蛋白樣品進行了 分離，可分辨出四個蛋白質區(qū)帶( 即i g g 、轉鐵蛋白、a 1 一胰蛋白酶抗體和白蛋 白區(qū)帶，分別用以模擬血清蛋白樣品中的np 、伍l 和白蛋白區(qū)帶) 。其中蛋白質 的熒光標記在分離之后進行，由于熒光染料t n s ( 2 - t o l u i d i n o n a p h t h a l e n e 6 s u l f o n a t e ) 標記血清蛋白的靈敏度較低，所以沒能實現(xiàn)實際人血清蛋白樣品的五 區(qū)帶分離。芯片構型設計如圖1 所示，通道深度為1 4p m ，細通道寬6 6p m ，粗 通道寬2 4 0l a m ，分離通道長度約為4 9 “m 。 4 浙江大學碩士學位論文 圖1蛋白質分離芯片通道構型示意圖 x i a o 等f 9 1 采用區(qū)帶電泳模式，以5 0m m 的磷酸鹽緩沖液( p h2 1 5 ) 作為工 作緩沖液，在通道寬度為3 0l a m 、深度為1 0p , m 的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 芯 片中，于3 5s 內實現(xiàn)了細胞色素c 和溶菌酶的快速分離，分離電壓4 0 0 0v ，分 離長度3 5c m 。芯片結構如圖2 所示。 圖2 芯片通道構犁示意圖 d o d g e 等【l o 】設計了集成多個微閥和微泵的p d m s 芯片( 如圖3 ) ，通過微閥 5 浙江大學碩士學位論文 微泵實現(xiàn)了對液流的有效控制。首先采用區(qū)帶電泳的分離模式分離牛血清白蛋白 和肌紅蛋白，然后通過閥的作用將分離后的蛋白質組分分別引入微混合器中酶 解，最后對產物進行質譜分析。該工作顯示芯片技術可用于質譜分析前復雜蛋白 樣品的預處理。 v a l v e lw a s t e s e p a r a t i o n 圖3 集成有微泵微閥的蛋白質分離和酶解芯片通道構型示意圖 莊貴生等1 1 1 】在石英芯片上以p h1o 3 ，7 5m m 的硼酸鹽緩沖液作為芯片電泳 緩沖體系，分離了免疫球蛋白、僅1 抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和鐵傳遞蛋白， 并對經臨床確診的妊娠高血壓癥、風濕性心臟病、多發(fā)性骨髓瘤患者的尿液樣品 進行電泳分析，在2m i n 內得到了與美國h e l e n a 電泳系統(tǒng)一致的分析結果，其 對四種標準蛋白混合樣品的電泳分離圖譜如圖4 所示。 6 浙江大學碩士學位論文 圖4四個標準蛋白混合樣本電泳圖譜 ( 1 ) 免疫球蛋白( 2 ) 鐵傳遞蛋白( 3 ) a 1 抗胰蛋白酶( 4 ) 牛血清白蛋白 對于芯片毛細管區(qū)帶電泳分離蛋白質研究，通道表面對大分子蛋白質的吸附 是所要解決的一個重要問題。在毛細管區(qū)帶電泳的分離模式下，一般采用通道內 壁永久改性和緩沖液中加入添加劑進行動態(tài)修飾兩種方法來抑制蛋白質的吸附。 w u 等【1 2 】采用多層8 8 水解聚丙烯醇( p v a ) 修飾p d m s 芯片，以區(qū)帶電泳的 模式有效分離了兩種堿性蛋白質溶菌酶和核糖核酸酶( 圖5 ) ，以及兩種典型的酸 性蛋白質牛血清白蛋白和p 乳球蛋白。該涂層在p h3 1 1 范圍內均可抑制電滲流 的產生和蛋白的吸附作用，并且效果穩(wěn)定，連續(xù)運行7 0 次后分離效果仍然很好。 該研究組【1 3 ，1 4 】隨后又采用自組裝方法在p d m s 芯片通道表面加工環(huán)氧修飾的聚 合物涂層，來抑制蛋白質的吸附作用，成功分離溶菌酶和核糖核酸酶a 。 7 浙江大學碩上學位論文 0 s1 0 52 0筠筠4 0 s ) 圖5 溶菌酶( 1 ) 和核糖核酸酶( 2 ) 在不同處理的p d m s 芯片上的電泳圖 ( a ) 末處理芯片；( b ) 0 2 等離子處理芯片；( c ) 0 2 等離子處理、1 0 0 水解聚乙烯醇修飾芯片； x i a o 等【9 1 對p d m s 芯片通道內表面進行聚丙烯酰胺表面處理，減少了通道 表面對蛋白的吸附，從而實現(xiàn)細胞色素c 和溶菌酶的快速分離，分離譜圖如圖6 所示。 c h i e m 等在運行緩沖液中加入了無機電解質n a c l 和中性表面活性劑吐溫 2 0 來抑制蛋白的吸附，利用芯片毛細管區(qū)帶電泳進行了單克隆抗體的分離分析， 圖7 為電泳分離譜圖。 8 孫勰勰舸弱筋孔囂舷黝笱 歲一窶蕃袋西-onli 圖6 蛋白質在聚丙烯酰胺處理過的p d m s 芯片上的電泳分離圖 02 04 ( 6 08 0 t i m e ( s 圖7f i t c 標記的人免疫球蛋白和牛血清白蛋白的電泳分離圖 9 ，0v夤基霜粵口墨 浙江大學碩士學位論文 1 2 2 芯片毛細管凝膠電泳 在蛋白組學和蛋白分離的研究中，凝膠電泳是廣泛使用的分離技術。它是以 凝膠等聚合物作為分離介質，利用其網絡結構并依據(jù)被測組分的分子體積不同而 進行分離的一種分離模式。在芯片上采用毛細管凝膠電泳( c a p i l l a r yg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 模式分離蛋白質，蛋白譜峰尖銳，柱效提高，更有利于實 現(xiàn)分離操作的高速度和高效率。y a o 等f 1 6 】采用s d s 凝膠電泳分離模式，對比了 芯片上的s d s 毛細管凝膠電泳與常規(guī)毛細管凝膠電泳系統(tǒng)分離蛋白質的性能， 前者的分離效率和分離時間明顯優(yōu)于后者。 與常規(guī)毛細管凝膠電泳相同，芯片毛細管凝膠電泳常用的篩分介質也分為凝 膠和非膠聚合物溶液兩種。交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠是廣泛使用的一種凝膠篩分介 質，h e r r 等【1 7 】首次將傳統(tǒng)的s d s 聚丙烯酰胺凝膠電泳( s d s p a g e ) 分離蛋白質的 方法移植到芯片上，使用光聚合的方法在芯片通道內制備濃度為6 的交聯(lián)聚丙 烯酰胺凝膠作為篩分介質( 如圖8 所示) ，在3 0s 的時間內對分子量在6 5 3 9k d a 之間的五種蛋白質進行分離，分離距離僅為4m i l l ，分離理論塔板數(shù)達到4 4 1 x 1 0 5 。 限，舅 b 一 l 象 ， 一；卜 f e 夸 嘲 4 ； 8 ，o ，2 弘? 嗡l 。一奄 ：； s w i i3 21 獺，j 窶糍嗍嘞一： t r i m w f $ 掬坼 圖8 光聚合于芯片通道內制備交聯(lián)聚丙烯酰胺篩分介質的方法示意圖 ( a ) 芯片通道；( b ) 通道內充滿丙烯酰胺單體；( c ) 不聚合部分用掩膜遮蓋，紫外光源照射 使單體聚合；( d ) 無掩模處形成聚丙烯酰胺；( e ) 蛋白質遷移分離 l o ! 蘭! ! ! ：竺! 湊警一 、7 土一￥ 圖9 具有試樣預濃集和s d s - p a g e 分離功能的蛋白質分析芯片 a g i r r e g a b i r i a 等 1 9 1 在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 芯片上使用s u 一8 光膠制 作微通道，采用濃度為1 2 的聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質分離蛋白，分離場強 3 4 3v m 。隨后，該研究組刪又在該芯片上集成金屬電極，采用相同的分離模式 成功分離了分子量分別為2 0k d a 和9 7 k d a 的胰蛋白酶抑制劑和磷酸化酶兩種蛋 白質。芯片示意圖和分離蛋白譜圖見圖1 0 。 l 8 l c er ，u 口m ( a ) 浙江大學碩士學位論文 ( b ) 圖l o ( a ) 集成金屬電極的p m m a 微流控芯片 ( b ) 胰蛋白酶抑制劑( 1 ) 和磷酸化酶( 2 ) 兩種蛋白質的分離譜圖 然而，交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠存在制備復雜，不易使用，使用壽命短等問題。 與其相比，線性聚丙烯酰胺( p l a ) 、聚乙烯醇( p e g ) 、聚氧化乙烯( p e o ) 、 甲基纖維素( m c ) 、葡聚糖( d e x t r a n ) 等非膠篩分介質具有制備簡單，使用方 便，可以先聚合后注入通道而無需在通道內進行聚合反應等優(yōu)點，適合在復雜的 通道體系中使用。因此，在芯片毛細管凝膠電泳中非膠篩分介質得到了廣泛的應 用。 y a o 等【1 6 】采用s d s1 4 2 0 0 凝膠緩沖液( b e c k m a nc o u l t e r 公司產品) 比較了 使用毛細管的s d s 凝膠電泳和使用芯片的s d s 凝膠電泳效果。使用芯片大大縮 短了分離時間，通過對分離電壓等條件進行優(yōu)化( 見圖1 1 ) ，在4 5c m 的分離長 度中于3 5s 內分離了分子量在9 1 1 6k d a 之間的六種蛋白質。 1 2 浙江大學碩士學位論文 坌 蘭 2 呈 。 罌 8 簍 寶 芷 圖1 l不同分離電壓下芯片凝膠電泳分離六種蛋白質的圖譜 ( 1 ) 鈣調蛋白( 2 ) 0 t 乳白蛋白( 3 ) 胃蛋白酶原( 4 ) 卵清蛋白( 5 ) 牛血清白蛋白 ( 6 ) 1 3 - 半乳糖營酶 g i o r d a n o 等 2 1 l 將n a n o o r a n g e 染料加入樣品和緩沖液中進行蛋白質的動態(tài)標 記，研究了利于動態(tài)標記蛋白質的緩沖液體系，包括篩分凝膠、離子強度和s d s 濃度的選擇。該系統(tǒng)最終選擇5 的p e o ( 1 0 0k d a ) 作為篩分介質，對牛血清白 蛋白的檢出限為5 0 0n g m l ，并完成了對實際人血清樣品的分離分析。 在芯片毛細管凝膠電泳中，通道內壁對蛋白質的吸附仍是所要解決的重要問 題。b o u s s e 等【2 2 】將蛋白質的分離、染色、脫色以及檢測過程整合在一起，開發(fā) 了一個微型分析系統(tǒng)( 芯片結構如圖1 2 ) 。使用聚二甲基丙烯酰胺( p d m a ) 物 理涂覆玻璃芯片微通道內壁，將電滲流降低到o 5 x 1 0 母m 2 v 。s 一，以s d s 凝膠電泳 的分離模式在4 0s 內分離了b i o r a d 公司蛋白標準樣品，分離效率達到l o7 塔板 數(shù)米。圖1 3 為分離結果記錄圖。 浙江大學碩士學位論文 圖1 2 集分離、染色、脫色以及檢測過程于一體的芯片結構示意圖 圖1 3b i o r a d 公司蛋白標準樣品電泳分離圖譜 n a g a t a 等【2 3 】在p m m a 芯片中使用了聚乙二醇( p e g ) 涂層，篩分介質為5 的線性聚丙烯酰胺，在分離長度為3m m 的通道內實現(xiàn)了胰蛋白酶抑制劑、牛血 清白蛋白和1 3 - 半乳糖苷酶三種蛋白質的高速分離，分離時間僅為8 s 。 1 4 浙江大學碩士學位論文 1 2 3 芯片等電聚焦分離 芯片等電聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 分離蛋白質的原理與常 規(guī)毛細管等電聚焦基本相同，都是依據(jù)蛋白質的等電點( p i ) 不同而進行分離。 h o f m a n n 等【2 4 j 首次將毛細管等電聚焦技術移植于玻璃芯片，應用于蛋白質 分析。l i 等【2 5 】在p d m s 芯片和聚碳酸酯( p c ) 芯片上進行毛細管等電聚焦分離， 分離通道寬1 0 0p m ，深4 0p m ，長1 2c n l ，陽極電解液和陰極電解液分別采用 1 0m m 磷酸( p h2 8 ) 和0 5 氨水( p h1 0 5 ) ，蛋白質樣品( 2 5n g l a lb s a 和 1 0n g p l 增強型綠色熒光蛋白( e g f p ) ) 和2 的p h a r m a l y t e3 1 0 溶液充滿通 道，在5 0 0v c m 的分離場強下，分離b s a 和e g f p 。分離效果如圖1 4 所示。 a 瑚 瑚 o 姍瑚螄蜘螄瑚陽鼬 e g f p 瑚姍3 鯽鋤4 弼湘腳啦圈 p 毗 圖1 4p d m s 芯片( a ) 和p c 芯片( b ) 上的e g f p 和b s a 等電聚焦分離 d a s 等【2 6 1 采用高聚物芯片，在等電聚焦電泳模式下優(yōu)化了分離長度及電壓條 1 5 跚鯽枷瑚鼢渤鯽粕搬0 浙江大學碩士學位論文 件，最終采用長1 9c m 的通道，在1 5m i n 內分離了綠熒光蛋白和r 藻紅蛋白， 分離電壓為5 0 0 v 。 c u i 等2 7 】在p d m s 芯片上采用等電聚焦分離模式成功分離了重組綠熒光蛋 白、異藻青蛋白和藻紅蛋白。該作者還報道，通過改變樣品和分離介質中添加劑 甲基纖維素的濃度，可以改變完成蛋白質分離所需要的通道距離，結果如圖1 5 所示。 ； c c l 一，一a 一一一夏 l l 一3 0受 乏o 伯國 圖1 5 不同介質對p d m s 芯片等電聚焦分離蛋白質的影響 ( a ) 樣品和電極液中都不含m c ( b ) 樣品中含0 4 m c ，電極液中含0 2 m c ( c ) 樣品中含0 4 m c ，電極液中含2 5 m c t s a i 等【2 8 】通過采用六甲基二硅氧烷等離子聚合膜修飾玻璃芯片通道的方法 抑制蛋白吸附，在等電聚焦的分離模式下分離了藻青蛋白( p i4 6 5 ) ，血紅蛋白 ( p i7 0 ) 和細胞色素c ( p i9 6 ) 三種蛋白混合物，分離在3m i n 內完成，分離效 率為1 9 6 0 0 塔板數(shù)米。 h u a n g 等2 9 】在進行芯片等電聚焦蛋白分離操作時，采用在兩性電解質溶液中 加入羥甲基纖維素作為添加劑的方法來抑制蛋白的吸附。 1 6 浙江大學碩士學位論文 1 2 4 芯片膠束電動毛細管電泳 膠束電動毛細管電泳( m i c e l l a re l c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 是毛細管電泳與膠束增溶色譜相結合的分離技術，其原理是在裝有膠束溶液的通 道內，溶質組分在電場力的作用下根據(jù)其在膠束相和水相之間的分配不同而產生 分離。目前，最常使用的形成膠束的表面活性劑為s d s 。 j i n 等【3 0 】在玻璃芯片上進行動態(tài)標記，采用膠束電動色譜的分離模式，成功 實現(xiàn)了分子量在1 4 4 - - 2 0 0k d a 之間的八種蛋白質的分離。芯片通道寬1 2 0l x m ， 深3 0 “i i l ，以b i o r a d 公司的c e s d s 緩沖液作為分離介質；分離電壓4 0 0v ， 進樣時間5 0s ，分離電壓4 2 0 0 v ，分離時間2 4 0s 。圖1 6 為8 種蛋白的分離譜圖。 圖1 6 激光誘導熒光檢測芯片膠束電泳分離8 種蛋白質 ( 1 ) 溶解酵素( 1 4 4k o a ) ；( 2 ) 胰島素抑制劑( 2 1 5k o a ) ：( 3 ) 碳脫水酶( 3 1 ok d a ) ；( 4 ) 卵清蛋白( 4 5 0k d a ) ；( 5 ) 血清白蛋1 芻( 6 6 2k d a ) ；( 6 ) 磷酸化酶b ( 9 7 0k d a ) ；( 7 ) a 一半 乳糖苷酶( 11 6k d a ) ；( 8 ) 肌球蛋白( 2 0 0k d a ) 。 d o u 等采用b r i j 3 5 修飾p d m s 芯片通道，在膠束電動色譜的分離模式下 實現(xiàn)了葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白的有效分離( 圖1 7 ) 。該芯片涂層在p h6 1 2 1 7 浙江大學碩士學位論文 范圍內能顯著降低蛋白質大分子的吸附，并減少檢測蛋白質所需的沖洗時間，從 而提高分離效率。 2 2 4 0 釉l 1 2 臼 m i g r a t i o nt i m e s l l v t i 圖1 7b r i j 3 5 修飾p d m s 芯片通道中連續(xù)進樣電泳圖 ( 1 ) 葡萄糖氧化酶( 2 ) 肌紅蛋白 h u a n g 等【3 2 1 在p d m s 芯片中采用0 1 的十二烷基麥芽糖( d d m ) 和0 0 3 的s d s 作為混合膠柬，對通道進行動態(tài)修飾，可有效抑制蛋白吸附，控制電滲 流，使蛋白質在非變性條件下得到有效分離。 1 2 5 芯片二維電泳分離 芯片毛細管電泳應用的成功促進了高速高效的芯片二維電泳技術的發(fā)展。對 于多組分復雜蛋白質樣品，采用傳統(tǒng)的一維分離方法顯然無法滿足要求，需要采 用而未分離技術來提高分離效率，增加峰容量。與傳統(tǒng)毛細管電泳系統(tǒng)相比，在 芯片上進行二維電泳分離，可以通過設計芯片通道結構實現(xiàn)通道的直接交叉或連 通，而無需制作復雜的二維毛細管電泳接口，從而避免了接口處死體積致使譜帶 擴展的影響。 在芯片二維電泳分離蛋白質的研究中，第一維分離模式多采用基于蛋白等電 1 8 浙江大學碩士學位論文 點聚焦分離的等電聚焦模式。c h e n 等【3 3 】制作了二維毛細管電泳p d m s 芯片，利 用第一維的等電聚焦和第二維的凝膠電泳對熒光標記的牛血清白蛋白和碳酸酐 酶以及德科薩斯紅標記的卵清蛋白進行分離分析。 l i 等【3 4 】設計的等電聚焦和凝膠電泳聯(lián)用的二維分離高聚物芯片( 如圖1 8 所 示) ，蛋白質樣品在完成一維等電聚焦分離后，可在多個并行的通道內完成凝膠 電泳分離。整個分離過程在1 0m i n 內完成，峰容量達到1 7 0 0 。 圖1 8 芯片二維分離結構及五種模型蛋白分離熒光圖像 h e r r 等【3 5 】研制了采用十字通道構型的等電聚焦一自由區(qū)帶電泳二維芯片電泳 分離系統(tǒng)( 如圖1 9 所示) ，芯片通道寬2 0 0g m ，深2 0g m ，待測樣品在橫向通 道中進行等電聚焦分離，分離后的樣品區(qū)帶在電場驅動下進入縱向區(qū)帶電泳通道 中進行第二維分離。系統(tǒng)采用熒光顯微鏡成像的方法對分離性能進行評價，5m i n 內分離的峰容量達到1 3 0 0 。 1 9 浙江大學碩十學位論文 a 罄1 一馬一 一 j -一 ri 粵! d 1 i 材l e o f ：2 涎e c l o fa r e a 圖1 9 芯片二維分離結構示意圖 w a n g 等t 3 6 1 黼p d m s 芯片中制作微閥來防止一維等電聚焦和二維凝膠電 泳二者的分離緩沖液相混合( 圖2 0 ) ，在2 0 - m i n 內有效分離了四種標準蛋白。 p e a k t 啪s f e r r e g l o n 3 嗍 ( a ) d e a dv o l u m e 弋。 j j l 卜 j g ： ，、 。 - 一吝 。 圖2 0p d m s 芯片通道和四個分離步驟示意圖 ! ! ! 竺! ! 竺! 也有報道在p m m a 芯片上，將s d s 凝膠電泳和膠束電動毛細管電泳相結合 的蛋白質二維電泳分離0 7 l ( 如圖2 1 所示) ，該系統(tǒng)在1 2r a i n 內完成1 0 種蛋白 質的分離，峰容量約為1 0 0 0 。 a o 卜0 = l 豫乏 器髻警車； b 工 圖2 l ( a ) 芯片二維分離結構示意圖 f b ) - - 維分離交界處熒光圖像 膠柬電動毛細管電泳或毛細管電色譜也多做為第一維分離模式與區(qū)帶電泳 相結合，用于蛋白質酶解物的分離分析。2 0 0 0 年，r a m s c y 課題組刪首次在玻璃 芯片上建立了膠束電動毛細管電泳( 第一維) 與區(qū)帶電泳( 第二維) 結合的二維 分離系統(tǒng)，應用于細胞色素c 、核糖核酸酶、廿乳白蛋白等的胰酶降解產物分離。 后來，該課題組 3 9 1 對其進行改進，加長第一維電泳通道長度，并采用細直徑轉角 通道來降低擴散( 圖2 2 ) ，在約1 5 m i n 內分離牛血清白蛋白酶解物，峰容量達到 4 2 0 0 。 浙江大學碩士學位論文 a 6 3 0 l l m b 圖2 2 ( a ) 二維電泳芯片結構示意圖 ( b ) 1 3 直徑轉角通道示意圖 | 1 2 5 p “ 2 0 0 1 年，r a m s e y 課題組【4 0 】還研制了開管電色譜和區(qū)帶電泳相結合的芯片二 維電泳系統(tǒng)( 圖2 3 ) ，其電色譜分離部分采用長2 5c m 的十八烷基三甲氧基硅烷 涂層的環(huán)狀通道，取代電泳部分則采用長1 2c m 的直形通道，在1 3r a i n 內實現(xiàn) 了p 一酪蛋白胰蛋白酶解產物的分離。 5c m 圖2 3 二維分離芯片結構示意圖 浙江大學碩士學位論文 相對一維分離芯片，二維芯片分離系統(tǒng)具有很高的分離效率和峰容量，預計 會在復雜蛋白質樣品的分離上發(fā)揮更大的作用。 1 2 6 其他模式 除上述分離模式外，芯片自由流電泳以及芯片電色譜也是芯片電泳分離蛋白 質的重要方法。 芯片自由流電泳是指在芯片中通過外加電場使樣品隨緩沖液連續(xù)流動并同 時在順電場方向進行電遷移，從而按照電泳淌度不同實現(xiàn)分離的電泳分離模式。 r a y m o n d 等【4 1 】采用芯片自由流電泳模式分離了人血清蛋白，緩激肽和核糖核酸酶 a ( 圖2 4 ) ，其分離長度為3 1c m ，流出時間為6 2s 。 e 匕a l 列 b ；。i l l 二u 氓：歹 b 久一心 1 ) i s t u n c ea c r o s s s c l 甜r ；l l i o n 摶擘i l r a m ) 圖2 4自由流電泳模式下不同場強的蛋白分離圖 ( a ) f i t c ；( b ) 人血清蛋白：( c ) 緩激肽；( d ) 和核糖核酸酶a k o b a y a s h i 4 2 1 采用自由流電泳的分離模式在一個體積為5 6 5m m x 3 5 m m x 3 0 “m 的微分離室( 6 0p l ) 中實現(xiàn)了持續(xù)的蛋白分離，并用羥丙基甲基纖維 素涂覆來抑制蛋白吸附，在2 5m i n l 為有效分離了細胞色素c 和肌紅蛋白。 一譬lll毒，11囂一萎銣u釬翟岱茹一 浙江大學碩士學位論文 最近，k a h l h e y e r 等【4 3 1 制作了一種自由流等電聚焦分離蛋白質的玻璃芯片， 成功的將人血清白蛋白( p i4 4 ) 與等電聚焦標記物( p h3 年f 1 9 ) 分離。分離效果 見圖2 5 。 1 0 剛 2 p 二 ， ，一 i ， ， - ， ； ” ， _ ，(a p j i ” ，“ - - _ ， 3 h s a p 1 4 4 i9 洌豳黧震 燃溺黝緩緩緩緩緩蠓 - a 】 e = 2 0 v m m + 州g r a d i e n t 圖2 5自由流電泳分離圖 芯片毛細管電色譜分離模式是采用m e m s 技術在芯片上制備分離性能良好 的電色譜柱，將高效液相色譜的高選擇性和毛細管電泳的高效性結合，根據(jù)組分 在固定相和流動相之間分配系數(shù)不同以及電泳速率差異對各組分進行分離的方 法。近來，有關芯片毛細管電色譜分離蛋白質的報道較少，而較多的應用于蛋白 質的酶解物的分離分析【4 4 4 5 1 。h e 等【4 6 1 采用c 1 8 修飾的c o m o s s ( c o l l o c a t e d m o n o l i t hs u p p o r ts t r u c t u r e s ) 整體柱分離了卵白蛋白的胰蛋白酶消解產物。該s l e n t z 等【4 7 , 4 8 $ 1 j 作了c o m o s s 整體柱p d m s 芯片( 如圖2 6 所示) ，并通過在c o m o s s 表 面涂敷c 1 8 - a m p s 等5 種試劑，實現(xiàn)了牛血清白蛋白消解產物的選擇性分離。 fslitjr一ee)，；亨 扎和8”舶爭 k耋譬 浙江大學碩十學位論文 1 3 總結 裊 v 吞 黧窿 q 竹 圖2 6p d m s 芯片c o m o s s 整體柱分離通道結構示意圖 微流控芯片毛細管電泳是一種快速、高效的分離分析技術，必將成為實現(xiàn)蛋 白質靈敏、快速、準確的有效分離的重要方法。微流控芯片毛細管電泳系統(tǒng)應用 于蛋白質的分離分析具有突出的優(yōu)越性，特別是在臨床檢驗及現(xiàn)場監(jiān)測等方面的 應用具有良好的發(fā)展前景。另外，其對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā) 展也具有重要意義。 目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛細管電泳與質譜聯(lián)用技術的研 究，利用質譜分辨率高、靈敏度高、檢測速度快等特點進一步提高蛋白質的分離 分析通量，以適用于復雜蛋白質樣品的分離分析。相信隨著研究的不斷深入及相 關技術的不斷發(fā)展，微流控芯片毛細管電泳蛋白質分離技術將同趨成熟，逐步實 現(xiàn)分析樣品的多元化、分析儀器的便攜化、集成化，從而實現(xiàn)真正意義上的小型 化實驗室。微流控芯片毛細管電泳蛋白質分離技術必將在各個領域發(fā)揮至關重要 的作用，并擁有廣闊的發(fā)展前景。 浙江大學碩士學位論文 參考文獻 1 】m a n za ，g r a b e rn ，w i d e m e rhm s e n s a c t u a t o r sb ，1 9 9 0 ，b 1 ：2 4 4 【2 】2 m a n z a ，h a r r i s o ndj ，v e r p o o r t eem j ，f e t t i n g e rjc ，p a u l u sa ，l u d ih ， w i d e m e rh m j c h r o m a t o g r a ，19 9 2 ，5 9 3 ：2 5 3 3 】v i l k n e rt ，j a n a s e kd ，m a n za ，a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：3 3 7 3 【4 】r e y e sdr ，i o s s i f i d i sd ，a u r o u xpa ，m a n za ，a n a l c h e m ，2 0 0 2 ，7 4 ：2 6 2 3 【5 】d o l n i kv l i usr ，j o v a n o v i c hs ，e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 0 ，2 1 ：41 6 】b e l d e rd ，l u d w i gm ，e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 3 ，2 4 ：2 4 2 2 【7 】r o d r i g u e zi ，z h a n gyl e ehk ，l isfyj c h r o m a t o g r a ，1 9 9 7 ，7 8 1 ：2 8 7 【8 】c o l y e rcl ，m a n g r usd ，h a r r i s o ndj j c h r o m a t o g r a ，19 9 7 ，7 81 ：2 71 【9 】x i a odq ，l etv ，w i r t hmj a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：2 0 5 5 【10 d o d g ea ，b r u n e te ，c h e ns ，g o u l p e a uj ，l a b a sv 1 1 1 1j ，t a b e t i n gp a n a l y s t ，2 0 0 6 ，1 3 1 ：11 2 2 【1l 】莊貴生，劉菁，賈春平，金慶輝，王惠民，楊夢蘇，趙建龍化學學報， 2 0 0 6 ，6 4 ：2 2 9 【1 2 】w udp ，l u oyz h o uxm ，d a izp ，l i nb c e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 5 ，2 6 ：2 1 1 【1 3 】w udp ，z h a obx ，d a izp ，q i njh ，l i nbc l a bc h i p ，2 0 0 6 ，6 ：9 4 2 【1 4 w udp ，q i njh ，l i nb c l a bc h i p ，2 0 0 7 ，7 ：1 4 9 0 15 】c h i e mn ，h a r r i s o ndj a n a l c h e m ，19 嘰6 9 ：3 7 3 16 】y a os ，a n e xds ，c a l d w e uwb ，a r n o l ddw ：s m i t hkb p r o c n a t l a c a d s c i u s a ，19 9 9 ，9 6 ：5 37 2 【17 】h e r rae ，s i n g hak a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：4 7 2 7 【18 h a t c hav ，h e r rae ，t h r o c k m o r t o ndj ，b r e n n a njs ，s i n g hak a n a l c h e m ，2 0 0 6 ，7 8 ：4 9 7 6 【19 】a g i r r e g a b i r i am ，b l a n c of ，b e r g a n z oj ，f u l l a o n d oa ，z u b i a g aa m ，m a y o r a k ，r u a n o l 6 p e zjm e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 6 ，2 7 ：3 6 2 7 2 0 】a r r o y omt ，f e m f i n d e zlj ，a g i r r e g a b i r i am ，i b 百m e z ln ，a u r r e k o e t x e aj ， b l a n c of j j m i c r o m e c h m i c r o e n g ，2 0 0 7 ，17 ：12 8 9 2 1 】g i o r d a n obc ，j i nlj ，c o u c haj ，f e r r a n c ejp ，l a n d e r sjpa n a l c h e m 2 6 浙江大學碩士學位論文 2 0 0 4