（細胞生物學專業(yè)論文）轉基因番茄葉綠體特征及其蛋白質差異研究.pdf

轉基因番茄葉綠體特征及其蛋白質組差異研究 摘要 本實驗以一株轉基因番茄( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u mv a nc e r a s i f a r m ) 為實驗材料，通 過對其細胞學特征、倍性和蛋白質組進行研究，為研究變異機理提供理論基礎。主要取 得以下進展： 1 轉基因植株葉片總葉綠素含量較對照株略微增加，而保衛(wèi)細胞和柵欄組織中的葉 綠體數(shù)目則分別是對照株的1 7 和1 6 倍。 2 經透射電子顯微鏡分析葉綠體的顯微結構，轉基因植株中的葉綠體表現(xiàn)出明顯的 膨脹，且內囊體膜發(fā)育不良，呈現(xiàn)出模糊和不連續(xù)現(xiàn)象。 3 利用流式細胞儀分析d n a 含量，結果表明此轉基因植株為3 倍體植株。 4 通過雙向電泳技術，共得到了3 6 8 個差異蛋白。以對照株的蛋白組圖譜為參考， 轉基因植株有1 2 2 個蛋白上調，2 4 6 個蛋白下調。 5 成功鑒定出1 6 個豐度百分比差異在二倍以上的蛋白點，它們涉及到很多生物學功 能。 關鍵詞：轉基因，櫻桃番茄，透射電鏡，流式細胞技術，雙向電泳 r e s e a r c ho nc h l o r o p l a s tc h a r a c t e r sa n d p r o t e o m i cv a r i a t i o n so f t r a n s g e n i ct o m a t o a b s t r a c t a t r a n s g e n i ct o m a t o ( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u my a ec e r a s i f a r m ) p l a n th a sb e e ns t u d i e da n di t s c y t o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，d n ap l o i d y a n dp r o t e i ne x p r e s sv a r i a n c e sc o m p a r e dw i t ht h e w i l d t y p ep l a n tw e r ec h a r a c t e r i z e d t h e s e r e s u l t sw i l lp r o v i d et h eb a s i so fm u t a t i o n m e c h a n i s m h e r ea r es o m ec o n c l u s i o n sw ea c h i e v e di nt h i sr e s e a r c h ： 1 l e a ft o t a lc h l o r o p h y l lc o n t e n to ft r a n s g e n i cp l a n th a v ei n c r e a s e ds l i g h t l yc o m p a r i n gt h e c o n t r o l ，w h i l et h en u m b e r so fc h l o r o p l a s t si nt h eg u a r dc e l l sa n dp a l i s a d et i s s u ei nt r a n s g e n i c p l a n tw e r e1 7a n d1 6t i m e sm o r et h a nt h a ti nc o n t r 0 1 2 m i c r o s t r u c t u r eo fc h l o r o p l a s tw a sa n a l y z e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t h e s t m c t u r eo fc h l o r o p l a s ti nt r a n s g e n i cp l a n t l e ts h o w e de x p a n s i q n ，a n dt h es h a p eo ft h y l a k o i d s w a sb l u r r ya n di n c o m p a e t 3 f l o wc y t o m e t r yr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n tw a st f i p l o i d 4 u s i n gt h et w o d i m e n s i o n a lg e le l e e t r o p h o r e s i s ，w ef o u n d3 6 8p r o t e i nv a r i a n c e s t h e c o n t r o lg e lw a ss e r v e d 雒t h er e f e r e n c e i nt r a n s g e n i cp l a n t l e t ，12 2p r o t e i ns p o t ss h o w e da d e c r e a s ei nt h e i ri n t e n s i t y ，w h i l eo t h e r2 4 6s p o t sw e r ei n c r e a s e d 5 1 6p r o t e i ns p o t s ( v a l u er a t i o 一2 ) w e r ei d e n t i t i e ds u c c e s s f u l l y t h e s ep r o t e i n si n v o l v e di n m a n yb i o l o g i cf u n c t i o n s k e yw o r d s ：t r a n s g e n e ，l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u m ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，f l o w c y t o m e t r y , t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s 西北大學學位論文知識產權聲明書 本人完全了解西北大學關于收集、保存、使用學位論文的規(guī)定。 學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版。 本人允許論文被查閱和借閱。本人授權西北大學可以將本學位論文的 全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃 描等復制手段保存和匯編本學位論文。同時授權中國科學技術信息研 究所等機構將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫或其它 相關數(shù)據(jù)庫。 保密論文待解密后適用本聲明。 學位論文作暑簽名：二牡指導教師簽名： a 滬了年6 月暑 日 知了 年6 月羅日 西北大學學位論文獨創(chuàng)性聲明 本人聲明：所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研 究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和 致謝的地方外，本論文不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成 果，也不包含為獲得西北大學或其它教育機構的學位或證書而使 用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已 在論文中作了明確的說明并表示 身 意。 靴敝零鬻唆日 炒了年月宕日 西北人學碩士學位論文 1 1 轉基因技術的研究進展 第一章前言 1 1 1 植物轉基因技術 1 1 1 1 植物轉基因技術的發(fā)展 植物生物技術中的轉基因技術突破了物種間的界限，將有用的外源基因轉入其他物 種，使遠緣生物之間可以進行基因的交換，創(chuàng)造新種質或品種。到目前為止，人們已經 設計和提出了很多的轉基因方法，它們各具特色，其中一些主要的、常用的方法如下： 1 ) 根瘤農桿菌轉化系統(tǒng)： 在所有產毒的根瘤土壤桿菌中普遍都存在著t i 質粒，分子量大：b 2 0 0 2 5 0 k b 。在不同 株系的根瘤土壤桿菌中，t i 質粒一般分為四個區(qū)域，即與腫瘤形成有關的t - d n a 區(qū)和v i r 區(qū)，還有兩個與接合轉移和質粒自身復制有關的區(qū)域。在腫瘤形成過程中，t o d n a 可以 被轉移到植物細胞中并插入到染色體基因組。這種方法是目前最常用的方法之一，主要 用來對雙子葉植物進行外源基因的轉化，具有很高的轉化成功率。同時也被用于其它植 物的轉化形式【1 1 。 2 ) 植物病毒載體系統(tǒng)： 植物病毒載體系統(tǒng)的主要原理是將外源基因插入到病毒基因組中，利用病毒對植物 細胞的感染，將外源基因導入到植物細胞。目前，比較常見的植物病毒載體系統(tǒng)有三種： 單鏈r n a 植物病毒載體系統(tǒng)、單鏈d n a 植物病毒載體系統(tǒng)和雙鏈d n a 植物病毒載體 系統(tǒng)。 a 單鏈r n a 植物病毒載體系統(tǒng) 大多數(shù)植物病毒的遺傳物質都是具有感染性的正鏈r n a ，因此選擇以單鏈r n a 植物 病毒作載體轉化植物細胞。b i s a r o 和s i e g e l1 2 ：j ：1 9 8 0 年應用煙草脆裂病毒( t r v ) 進行轉基 因操作，并首先提出了這種病毒載體系統(tǒng)。它的主要步驟是：首先用反轉錄酶和d n a 聚合酶將單鏈的病毒r n a 合成為雙鏈的e d n a 拷貝，然后將其克隆到原核生物的質粒或 粘粒載體上，通過常規(guī)的遺傳操作和分子生物學的方法對載體d n a 進行改造，將外源基 因插人到病毒的c d n a 部分，最后，再通過體外轉錄，將帶有外源基因的病毒d n a 感染 并進入植物受體細胞。 隨著研究的深入，又有很多單鏈r n a 病毒載體被發(fā)現(xiàn)。其中，有一些已得到廣泛應 第一章前言 用，對其的研究也較為充分，例如雀麥花葉病毒( b m 、，) f 3 j 、煙草花葉病毒( t m v ) 訓。 b 單鏈d n a 植物病毒載體系統(tǒng) 雙粒病毒是一類單鏈d n a 植物病毒，其病毒顆粒一般是成對存在的。它的基因組比 較小，其大小約為2 5 3 5 k b ，主要是由單鏈的環(huán)狀d n a 分子組成，但也含有少量的復制 型雙鏈d n a 分子。雙粒病毒成對的兩個顆粒中所包含的基因組可以不同，但只有當兩種 d n a 混合時才具有感染性網(wǎng)。這種二連基因組載體系統(tǒng)的優(yōu)點就在于此，當病毒的復制 基因只在一種基因組上時，那么在另一種基因組上插入外源基因，將不會影響到整個基 因組的復制。這種載體系統(tǒng)也存在著一定的局限性，它的感染部位僅局限在植株的維管 組織，而且大部分靠媒介昆蟲傳毒，不能機械轉移接種；另外，這種病毒都是球形顆粒， 插入外源d n a 的片段不能太大【6 1 。 c 雙鏈d n a 植物病毒載體系統(tǒng) 雙鏈d n a 病毒載體系統(tǒng)的典型代表是花椰菜花葉病毒( c a m v ) 。c a m v 的基因組是 雙鏈環(huán)狀的d n a ，長度大約為8 o k b 。雖然c a m v 本身可以作為承載小片段外源d n a 的 克隆載體，但由于在它的大多數(shù)限制性酶切位點中插入外源d n a 都會導致病毒失去感染 性，而且它不能包裝具有大于原基因組3 0 0 b p 的重組體基因組。因此，近年來人們主要 研究將c a m v 的d n a 整合到t i 質粒d n a 中組成混合的載體系統(tǒng)1 7 1 。 2 ) d n a 直接導入法： 由于土壤農桿菌轉化系統(tǒng)和植物病毒載體系統(tǒng)的操作要求高，而且步驟比較繁瑣， 所以近些年來，d n a 的直接導入法被越來越廣泛的應用。d n a 直接導入法的植物材料 對象大多是原生質體，另外其他的一些植物材料也可以作為細胞受體，包括器官分生組 織、未成熟的胚、愈傷組織、懸浮細胞、花粉、卵細胞等等。 d n a 直接導入法可分為：化學物質誘導法、電穿孔法、脂質體法、微注射法、基因槍法 ( 微彈轟擊法) 和花粉管通道法等等。 a 化學物質誘導法 現(xiàn)在被使用最多的化學物質是聚乙二醇( p e g ) ，它能刺激原生質體，使其較好地 接受外源d n a 的進入。p e g 通過電荷之間的相互作用與d n a 形成緊密復合物，植物細胞 通過內吞作用吸收這些復合物到細胞內。一般低濃度的p e g 不會對原生質體造成傷害。 p e g 法首先用于轉導象t i 質粒那樣比較大的質粒，轉導的原生質體一般來源于煙草等雙 子葉植物。現(xiàn)在用此法來轉導大腸桿菌質粒這樣小的d n a 分子，轉化率可達l o 4 【8 1 。 b 脂質體法 2 西北大學碩士學位論文 脂質體法的基本原理是將包含外源基因的帶負電荷的脂質體與植物原生質體相融 合，從而達到轉基因的目的【9 ，1 0 1 。一般可分為以下四個步驟：原生質體分離和純化；脂 質體的制備；原生質體與脂質體的融合以及轉化體的培養(yǎng)：篩選和鑒定。結合使用p e g 或p v a 等化學試劑可以促進植物原生質體與大腸桿菌或農桿菌的融合【1 1 j 。 c 電穿孔法 植物細胞膜在外界高壓電脈沖下會造成非對稱穿孔，由于這種孔孔徑較小( 8 4 r i m 左右) ，加之可在很短時間內( 2 0 0 n s ) 恢復到0 5 n m ，所以這對細胞本身的生理活動的 影響不大。在每個細胞膜上的穿孔多達上百個，因此外源基因可以由此進入到細胞內。 電穿孔法大致可分兩類：高壓短時程法和低壓長時程法。一般是根據(jù)細胞種類和實驗條 件來具體選擇方法。 d 微注射法 微注射法是使用毛細微管( 一般針尖的直徑為0 5 n m ) ，在顯微鏡下將外源d n a 直接 注射入植物細胞或原生質體的一種方法。這種方法首先在動物細胞的轉基因中使用【1 2 】， 由于植物細胞的細胞壁和原生質體的彈性，此法在植物上的應用時進行了一些改進，即 將細胞用瓊脂糖多聚賴氨酸固定。此外科學家們使用此方法不僅對細胞質，而且還對細 胞核【1 3 】、細胞器【1 4 1 等進行了定點的d n a 注射。 e 基因槍法 基因槍法又被稱為高速微彈法或微彈轟擊法，一般是用鎢或金微粒( 直徑1 - 2 # m ) 包裹外源d n a ，接著用一定的方法加速這種微粒，從而穿透植物細胞壁和細胞膜，使外 源d n a 能進入到植物細胞中?；驑尫ㄊ紫仁莍 掃s e k im 【1 5 】等用于研究擬南芥組織細胞 的瞬時表達系統(tǒng)，后來又有人用于玉米【1 6 1 、水稻【1 7 1 、大豆【1 8 】和小麥i 1 9 】等一些標記基因 的表達，以便為研究外源基因在不同細胞類型中的表達提供參考的數(shù)據(jù)?；驑屴D化效 率的主要影響因索有：微粒的大小、微粒的加速程度、外源d n a 的量、微粒與外源基因 結合程度、受體細胞的生理狀態(tài)等等。 f 花粉管通道法 k o n s t a n t i n o v t 2 0 1 首先應用這種方法將外源d n a 導入植物的技術。在授粉后向子房注 射含有外源目的基因的d n a 溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將 外源d n a 導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā) 育而成為攜帶有外源基因的新個體。花粉管通道法的優(yōu)點是操作方便，而且能馬上得到 種子，在時間上比較節(jié)省，而且不需要專門的儀器和昂貴的藥品：但其缺點是工作量相 3 第一章前言 對巨大【2 。 1 1 1 2 植物轉基因技術的應用、展望 隨著植物轉基因技術的飛速發(fā)展，越來越受到人們的重視和利用。選定帶有特殊作 用的外源基因轉入植物受體細胞內，使得植物獲得某種特性，最終達到增加產量、改良 種系和生產外源蛋白等。為人類認識和利用自然，并為我所用作出了重要貢獻。轉基因 植物的主要有以下幾個應用方面： 1 ) 抗除草劑轉基因植物 將抗除草劑基因轉入農作物，能有效地防治田間雜草。目前從植物和微生物中己克 隆出多種抗除草劑基因，如抗除草劑甘瞵的a r o a 基因【2 2 】和水解溴苯腈的b x n 基因【2 3 1 等。 2 ) 抗病毒轉基因植物 通過導入植物病毒的外殼蛋白基因、病毒復制酶的基因、核糖體失活蛋白基因和干 擾素基因等，使植物獲得或者提高抗病毒能力。已經利用煙草花葉病毒( t m v ) 2 4 】、苜 ?；ㄈ~病毒( a i m v ) 2 5 l 、大豆花葉病毒( s m v ) 1 2 6 】、馬鈴薯x 和y 病毒( p v x 和p r y ) 2 7 , 2 8 】 等進行試驗，使植物獲得了對相應病毒的抗性。抗病毒轉基因煙草已在進行田間試驗， 且增產效果顯著，這對現(xiàn)代醫(yī)學和環(huán)境保護方面都有著重要的意義【2 9 1 。 3 ) 抗蟲轉基因植物 把抗蟲基因轉入農作物，由作物本身合成殺蟲劑，從而獲得抗蟲性。抗蟲基因有很 多的來源。來源于微生物蘇云金芽孢桿菌( b t ) 的基因被廣泛的應用1 3 0 , 3 1 l ，可以產生一 種6 一內毒素，它可進入害蟲腸道后導致孔洞，進而導致害蟲腸道受損，停止進食直至死 亡。來源于植物本身，主要包括蛋白酶抑制劑基因，例如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因( c p t i ) 【3 2 ，3 3 】；淀粉酶抑制劑基因，例如菜豆駱淀粉酶抑制劑基因( a a i p v ) 3 4 】：植物外源凝 集素基因，雪花蓮外源凝集素基因( g n a ) 【3 5 】等。來源于動物的抗蟲基因包括蛋白酶抑 制劑基因，如牛胰腺胰蛋白酶抑制劑( b p t i ) 3 6 1 、脾抑制劑( s i ) 【3 7 1 、o a - 抗胰蛋白酶 ( 一a t ) 1 3 8 】、幾丁質酶基因【3 9 】和神經毒素基因【刪等。 4 ) 抗逆境轉基因植物 向植物導入一些與脅迫抗性有關的基因可以提高植物的脅迫耐受能力。例如在水稻 中過量表達大麥的l e a 蛋白h v a i 時，轉基因水稻種子苗和成熟植物對鹽和干旱的抗性 均得到增強【4 。在煙草中過量表達大腸桿菌g r 基因，其葉片中g r 的含量水平將提高3 倍，對百草枯和s o ：的耐受力得到明顯增強【4 2 1 。將煙草線粒體m n s o d 基因轉移到苜蓿中， 苜蓿獲得了對冰凍和干旱脅迫的耐性增加【4 3 1 。 4 西北大學碩士學位論文 5 ) 醫(yī)藥領域中的轉基因植物 隨著轉基因技術的不斷成熟，利用植物生產細胞因子、抗體、疫苗和酶等藥物蛋白 已經成為可能，出現(xiàn)了大量的植物反應器。利用植物反應器，一般表達的藥物蛋白都具 有很高的應用價值。例如將人的溶菌酶基因用水稻谷蛋白g t - 1 啟動子調控，并連接轉 運肽序列，得到能夠表達溶菌酶的轉基因水稻。用其作為食品的添加劑，能夠減少腹瀉 或上呼吸道感染的機會【刪。 通過轉基因技術可以優(yōu)化植物的農藝性狀，獲得良好的經濟效益。但是，關于植物 轉基因研究中還存有一些潛在的問題，例如：食品安全性問題、一些病蟲的抗性問題、 環(huán)境生態(tài)平衡問題等等。此外，在轉基因技術方面也存在一些問題：外源基因尚未能定 點、定量導入受體細胞基因組中，并獲得穩(wěn)定、高效的表達和遺傳，但卻又不影響受體 生物本身優(yōu)良性狀的表達。隨著生物技術產業(yè)化進程的加快，轉基因技術也將會更加的 完善，產生的作用也將會是越來越重要。 1 1 2 轉基因植株變異及其原因 j 應用轉基因技術改良作物品種時，理想的結果是只將目標性狀導入受體植物， 實現(xiàn)作物的定向改良。外源基因的導入會使植株獲得新的特性，但隨著其插入目標植物 基因組中，也將導致染色體上插入位點處的基因發(fā)生缺失而產生突變體【4 5 1 。 植株變異產生的原因是受多方面的因素所影響的。例如，基因的轉化方法、組織培 養(yǎng)體系的篩選、再生組織的擴繁和繼代等。此外，在很大程度上，變異是由外源基因的 導入而引起的。目前，比較認可的原因被概括如下： 1 ) 外源基因本身特性及其表達 為了增強外源基因的表達，提高其表達的穩(wěn)定性，科學家們先后設計出了一系列的 策略和載體，包括強啟動子、修改植物偏好密碼子1 等等。然而，當外源基因與受體植 物基因存在較高的序列同源性時，則會導致內、外源基因表達同時受到抑制，即產生共 抑制現(xiàn)象【4 7 1 。因此，在轉基因載體構建時，要注意以下幾個方面的問題：避免使用與內 源基因同源的序列，盡量保持與內源基因在序列上的多樣性；避免使用重復序列或基因 組片段，以防被甲基化酶識別：避免使用相同的啟動子，應該從同一方向開始閱讀以免 形成異?；蚍戳xr n a 。 2 ) 外源基因的位置效應 外源基因的表達受到插入位點及其周圍序列的影響，這就是所說的位置效應。現(xiàn)在 普遍認為外源載體轉基因到宿主染色體內，其整合位點是隨機的，外源基因可以插入到 與 第一章前言 植物基因組的任何一條染色體的任何位點上，但是往往對轉錄活躍的區(qū)域具有優(yōu)先插入 的特性【4 8 1 。外源基因在植物基因組中插入情況大致有三種：當外源基因插入到轉錄活躍 區(qū)域中時，外源基因就會順應該區(qū)域的染色質結構，使其可以高水平的轉錄和表達；當 外源基因插入到轉錄不活躍區(qū)域的異染色質區(qū)中時，它只能進行低水平轉錄或發(fā)生基因 沉默；當外源基因插入到內含子中時，它會在轉錄后的剪接過程中將被剪接掉，最終得 不到表達【4 9 1 。 此外，隨著外源基因的插入，使得受體植物的染色質上原有基因序列發(fā)生變化，進 而引起染色質的空間構象發(fā)生相應變化。此時，外源基因的序列也可能將隨之發(fā)生改變， 從而使得其表達在一定程度上偏離原先的模式，或者使外源基因和內源基因的表達都受 到一定影響，甚至都出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。 3 ) 受體細胞的表達調控系統(tǒng) 植物擁有著自己的一套防御及表達調控系統(tǒng)，這個系統(tǒng)對外源基因或物質的進入有 著識別、抵御和修復功能。因此，當外源基因轉入道受體細胞中時，可能被受體植物的 基因組調節(jié)系統(tǒng)所識別，從而被基因表達調控系統(tǒng)修飾或視為異己加以剔除【矧。植物基 因組的防御體系基本包括兩個：在外源基因整合插入前，復制修復系統(tǒng)的各種酶類物質， 將對其進行作用，使之出現(xiàn)斷裂、降解、重排等，進而發(fā)生序列的改變f 5 l 】；在外源基因 整合插入后，其也會在植物的有性傳遞過程中出現(xiàn)重排或丟失【5 2 】。另外，甲基化也是植 物細胞中一種對外源基因常見的沉默原因【5 3 】。 4 ) 環(huán)境因素 環(huán)境對于植物生長和發(fā)育起著至關重要的作用。與動物相比，植物的基因調控和表 達對環(huán)境有高度依賴性，其中，光照、溫度、水份、土壤肥力和外源激素等是主要的環(huán) 境因素。在一定環(huán)境條件下，基因的表達一般是由光控因子、熱休克元件、順式作用元 件和反式作用因子以及其它因子共同協(xié)同作用的結果【5 4 1 。然而，從植物感受環(huán)境信號到 基因表達調控，這中間仍存在著很多不問題，其機制尚不清楚。 1 2 流式細胞技術研究應用進展 1 2 1 流式細胞儀 流式細胞儀是進行流式細胞分析的儀器，集電子、計算機、激光、流體理論于體， 被譽為試驗室的“c t 。 1 2 1 1 流式細胞儀的基本結構 6 西北大學碩士學位論文 流式細胞儀一般由三部分構成：1 ) 傳感系統(tǒng)，包括樣本遞送系統(tǒng)、樣品池、檢測 系統(tǒng)、電子傳感器和激光源等；2 ) 計算機系統(tǒng)；3 ) 電路、光路和水路系統(tǒng)，包括電源、 光學傳導和濾片、鞘液循環(huán)和回收部分等。 1 2 1 2 流式細胞儀的基本工作原理 將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞 的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣， 鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行 排列，依次通過檢測區(qū)域。 流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上， 被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向 光電二極管和9 0 0 方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信 號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色 性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。 y 這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光 電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過a d 轉換器，將連續(xù)的電信號轉換為可被計 算機識別的數(shù)字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示 在計算機屏幕上，液可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查 詢或進一步分析。 。 檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形 式表達，其x 軸為測量強度，y 軸為細胞數(shù)目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率 有5 1 2 或1 0 2 4 通道數(shù)，這視其模數(shù)轉換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)， 既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三 維立體視圖。 細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超 高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些 液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在 高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器， 從而實現(xiàn)細胞的分離。 1 2 2 流式細胞技術 7 第一章前言 流式細胞術( f l o wc y t o m e t r y , f c m ) 是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子 進行定量分析和分選的檢測手段，它可高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測 得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，成為當 代最先進的細胞定量分析技術嘲。 1 2 2 1 樣本制備的基本原則 樣本制備的基本原則：1 ) 使用的各種液體和懸浮細胞樣本需為新鮮制備，盡快完 成樣本制備和檢測；2 ) 針對不同的細胞樣本進行適當洗滌、酶消化或e d t a 處理，以清 除雜質，使粘附的細胞彼此分離而形成單細胞狀態(tài)；3 ) 對新鮮實體瘤組織可選用或聯(lián) 用酶消化法，機械打散法和化學分散法來獲得足夠數(shù)量的單細胞懸液；4 ) 對石蠟包埋 組織應先切成若干4 0 5 0 u m 厚的蠟片，經二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細胞 懸液；5 ) 單細胞懸液的細胞數(shù)不應少于1 0 4 個。 1 2 2 2 植物樣品細胞核懸液的制備 表1 是5 種常用的植物細胞核提取液的化學組成，細胞核染色質在含有鎂離子的溶 液【5 硒8 1 和含有精胺的多胺緩沖液【5 9 】中可以保持穩(wěn)定。在m a r i e 的分離緩沖液中，葡萄糖 的存在可以保持細胞核的完整性，并且防止核的凝聚【鯽。e d t a 可以結合二價陽離子， 被作為核酸酶輔助因子使用。檸檬酸鈉作為一種溫和的鰲合劑在很多緩沖液中被大量使 用，而無機鹽則用來保證溶液達到一定的離子強度。這些緩沖液的p h 值一般都在7 0 8 0 之間，這與常用的d n a 熒光染料相同。兩種非離子去污劑：t r i t o nx 1 0 0 和t w e e n2 0 ， 被用來將細胞核從細胞質中分離出來，去除殘留在核表面的細胞質殘片。伊巰基乙醇被 用來保護染色質蛋白，并消除酚類化合物對d n a 染色的干擾作用。由于伊巰基乙醇對 人體有很大的傷害，現(xiàn)在多用p v p 或偏重亞硫酸鉀代替【6 l 】。 1 2 2 3 應用范圍 流式細胞技術的應用：1 ) 測定細胞內d n a 的變異系數(shù)【6 2 1 ，此方法的準確性很高， 變異系數(shù)最小，一般在2 以下；2 ) 能準確地進行d n a 倍體分析【6 3 l ；3 ) 借助于熒光 染料進行細胞內蛋白質“1 和核酸的定量研究【6 5 】；4 ) 快速進行細胞分選1 6 6 1 和細胞收集6 7 】； 5 ) 醫(yī)學應用及相關研究：疾病診斷【鯽，免疫功能研列6 9 1 ，癌癥病人的多藥耐藥性【7 們 7 h ， 細胞功能及代謝動力學研究【7 2 1 ，血小板分析( 心血管疾病) 7 3 1 等；6 ) 細胞生物學和分 子生物學研究【7 4 1 。 3 西北大學碩上學位論文 表1 常用細胞核提取緩沖液 t a b 1t h em o s tp o p u l a rb u f f e r su s e df o rp r e p a r a t i o no fn u c l e i 緩沖液名稱 g a l b r a i t h b u f f e r c 5 5 1 組成 4 5 r a mm g c l 2 ，3 0 m ms o d i u mc i t r a t e ，2 0 m mm o p s ，0 1 t r i t o nx 1 0 0 5 0 r a mg l u c o s e ，15 m mk c l ，15 r a mn a c l ，5 m mn a 2 e d t a ，5 0 m ms o d i u mc i t r a t e ， m a r i eb u 婦f e 一1 0 5 t w e e n2 0 ，5 0 m mh e p e s ，0 5 b - m e r c a p t o e t h a n n o l 2 0 0 m mt r i s ，4 m mm g c l 2 6 h 2 0 ，o 5 t r i t o nx - 10 0 b u 丘“5 6 】 a r u m u g a n a t h a n 9 5 3 m mm g s 0 4 7 h 2 0 ，4 7 6 7 m mk c i ，4 7 7 m mh e p e s ，6 4 8 m md t r , 0 2 5 b u f f e i l 5 7 1t r i t o nx 一1 0 0 i5 m mt r i s ，2 m mn a 2 e d t a ，o 5 m ms p e r m i n e 4 h c i ，8 0 m mk c l ，2 0 m mn a c i ， l b 0 1b u f f e r t ”j 1 2 - 3 展望 流式細胞儀從細胞技術的提出發(fā)展至今，6 0 至7 0 年代是其飛速發(fā)展時期，激光技 術、噴射技術以及計算機的應用構成了流式細胞儀在原理和結構上形成了特有的、固定 的模式。在隨后的時間里，流式細胞儀開始逐漸的商品化，這期間不斷有新型號的儀 器推出，在多參數(shù)檢測技術上得以不斷地提高和完善。 進入9 0 年代，隨著微電子技術特別是計算機技術的發(fā)展，流式細胞儀的功能也越 來越強大，出現(xiàn)了很多新的設備，例如全反射熒光流式細胞儀【7 5 】，此外在數(shù)據(jù)管理、數(shù) 據(jù)分析方面有了長足進步。然而，在技術原理和設計方面一直沒有突破性的進展。人們 將更多的注意力開始投向流式細胞儀的各種應用，不斷提出新的熒光探針、新的熒光染 料、新的染色方法等等，使流式細胞技術在新的細胞參數(shù)指標分析方面日益發(fā)展。在分 析軟件上，設計出了更多的、操作簡便的、功能強大的應用分析軟件和圖形編輯軟件， 全面的提高隊數(shù)據(jù)自動分析能力。 1 3 雙向電泳技術的研究應用進展 1 3 1 蛋白質組學 9 第一章前言 蛋白質組( p r o t e o m e ) 指由一個基因組( g e n o m e ) 或一個細胞、組織表達的所有蛋 白質。這一概念的是澳大利亞m a c q u a r i e 大學的w i l k i n s 和w i l l i a m s 于1 9 9 4 年最先提出 的【7 6 j 。在翻譯轉錄時，一個基因可以以多種m r n a 形式進行剪接，并且同一蛋白可能 以許多形式進行翻譯后的修飾。所以一個蛋白質組并不是一個基因組的直接產物，蛋白 質組中蛋白質的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目。因此，蛋白質組更為準確的定義應為 一種細胞內存在的全部蛋白質。生物體內的蛋白質組隨著組織發(fā)育、功能的建成和受環(huán) 境狀態(tài)的改變而改變。蛋白質組學旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式， 其內容主要包括鑒定和分析蛋白質的表達水平、存在方式、修飾形式、結構、功能及其 他們的相互作用等。 1 3 1 1 植物蛋白質組學 近些年來，基因組學研究發(fā)展迅速，先后己經完成了多種模式植物和重要農作物基 因組的測序工作【7 7 1 。植物基因組學研究已經轉入到功能基因組學的研究上面。目前已經 提出了很多功能基因組學研究的新方法，例如e d n a 微陣列、d n a 芯片、基因表達系統(tǒng) 分析( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 和基因敲除( g e n ek n o c ko u t ) ，它們都 能夠有效分析和鑒定大量基因的表達模式和功能類型。然而基因的功能最終是以蛋白質 的形式表現(xiàn)出來的，每種蛋白質都有其特有的存在和活動規(guī)律，因此在轉錄水平上獲得 的基因表達的信息并不足以揭示其在細胞內的確切功能，這就需要直接分析蛋白質的表 達模式和功能模式。蛋白質組學即成為了現(xiàn)今生物學界的新的研究熱點。植物蛋白質組 學是在植物基因組學的研究成果基礎上，利用高通量的蛋白質分析技術和鑒定技術，對 植物細胞內蛋白質組學進行研究的- - f - i 新興學科。高通量蛋白質組技術包括雙向電泳技 術( t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 、蛋白質芯片技術、質譜技術和酵母雙雜 交技術，這些技術促進了植物蛋白質組學的發(fā)展。目前，植物蛋白質組學研究已由植物 類群、組織、器官和細胞水平深入至亞細胞水平【7 引，一些重要的細胞器，如葉綠體、線 粒體等蛋白質組已被分析和鑒定，已發(fā)現(xiàn)了許多新的葉綠體和線粒體蛋白質【7 9 8 1 】。 1 3 1 2 蛋白質組學技術 蛋白質組學技術大致包括一下三大技術：1 ) 蛋白質分離技術：2 ) 鑒定技術( 如生 物質譜技術) ；3 ) 蛋白匹配數(shù)據(jù)庫分析技術。 該技術的過程流程基本為：蛋白樣品制備一2 d e 電泳一圖像采集、比對和分析一凝 膠切點一胰蛋白酶( t r y p s i n ) 等消化一提取肽混合物- - m a l d i t o f m s 質譜技術分析 一獲得肽質量指紋( p m f ) 一在m a s c o t 等數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質匹配一獲得鑒定蛋白質一 l o 西北大學碩士學位論文 對蛋白進行功能驗證。 1 3 。2 雙向電泳技術 1 9 7 5 年o f a r r e l 等首次提出雙向電泳技術【8 2 】，其方法可以在同一塊凝膠上同時分離數(shù) 千種蛋白，因此在蛋白質組學研究中一直處于核心地位。隨著質譜分析技術的發(fā)展，雙 向電泳技術與之的結合使用，滿足了準確、快速、高通量的蛋白質組學研究的需求8 3 , 9 4 】。 目前，雙向電泳系統(tǒng)大都使用的是第一向為等電聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，i e f ) ， 第二向為s d s 聚丙烯酰胺凝膠電泳( s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s d s p a g e ) 的二維電泳體系。樣品經過電荷和質量水平上的兩次分離后，蛋白可以以點的形態(tài)展現(xiàn) 出來。根據(jù)c a r t e s i n 坐標系統(tǒng)，從左到右是等電點的增加，從下到上是分子量的增加。 該技術的基本流程如下： 1 ) 樣品制各 樣品制備的好壞對雙向電泳的最終結果來說是至關重要的。它的主要目標是去除 鹽、脂類、多糖和核酸等干擾物質，盡可能提取組織或細胞內所有蛋白，同時防止蛋白 發(fā)生化學修飾或降解，保證蛋白的完整性。其主要步驟包括細胞破碎、干擾物去除、蛋 白提取及復溶。在這整個過程中，蛋白的提取和復溶是關鍵步驟，其中涉及到裂解液的 選擇和嚴謹度的高低。針對不同樣品和實驗目的應選用適當?shù)牧呀庖汉蛧乐敹取乐敹?越高，樣品中的干擾物就越少，樣品更為純化，但同時會損失部分蛋白，丟失蛋白差異 信息。 目前，在雙向電泳中所用的裂解液一般包括中性促溶劑( 尿素，硫脲) 、非離子去 污劑( n p 4 0 ，t r i t o nx - 1 0 0 ) 或兼性離子去污劑( c l a j p s ) 、還原劑( d t t ，d t e ，t b p ) 、 載體兩性電解質或i p g 緩沖液等。 植物組織中一般含有大量的色素、酚類、核酸及次生代謝產物，這些物質都嚴重影 響雙向電泳分辨效果。v a l c u 等人【8 5 l 設計出了一種適合溶解分離木本植物的蛋白裂解 液，并且發(fā)現(xiàn)尿素與硫脲組合的溶解效果不因樣品類型的改變而改變，去污劑組合的溶 解效果卻因樣品類型的改變而改變。g o m e z 等人在實驗中建立了一套適用于椰棗樹葉 片中提取全蛋白的提取液體系。m a l d o m a d o 8 7 】等人比較了三種不同的蛋白提取裂解液， 在蛋白產率上沒有顯著的差別，提取的蛋白大多存在p h5 - 8 和1 4 8 0 k d a 范圍之內，t c a 丙酮酚法對蛋白點的聚焦、強度、重現(xiàn)性有較好的結果。s a r m a1 8 8 1 等人系統(tǒng)地研究了提 高雙向電泳的分辨率的植物蛋白分離提取和穩(wěn)定性的問題，提出將d t t 用于所用的溶 液中，采用含用大量d t t 的高濃度去污劑和交性劑的混合提取液可以提高蛋白的復溶 1 1 第一章前言 效果，并增強樣品蛋白液的穩(wěn)定性。這些裂解液適合多種組織和細胞蛋白質樣品的制 備，但是對具體樣品有時也需要做適當?shù)母倪M。 2 ) i e f 等電聚焦是目前最常用的第一向分離技術。該技術是根據(jù)蛋白質的等電點不同而將 它們分開，因此p h 值梯度的維持對其是相當重要的。 在最早的等電聚焦中，是通過兩性電解質在聚丙烯酰胺管膠內產生的p h 梯度將蛋 白質分離【8 9 1 。然而這種方法存在著很多的缺點：1 ) 重復性差：2 ) p h 梯度不穩(wěn)定：3 ) 管膠機械強度低。g 6 r g 等人【則是首先使固相膠條進行等電聚焦電泳。固相膠條發(fā)展至 今，已經具有不同p h 范圍、不同線性關系、不同長度，而且完全商品化。近些年來， 極窄p h 范圍的重疊固相膠條及堿性p h 范圍膠條的出現(xiàn)，進一步提高了低豐度蛋白和 疏水蛋白的分辨率，對蛋白質組學研究提供了新的研究平臺。 樣品的上樣量和聚焦程序的選擇是等電聚焦的兩個核心內容，需根據(jù)不同樣品特 性、i p g 膠條的p h 范圍和長度、凝膠染色的方法等因素進行優(yōu)化選擇。 3 ) 膠條平衡 目前，比較常用的是兩次平衡，分別在平衡緩沖液中加入d t t 和碘乙酰胺。第一 次平衡加入d t t 的作用是打開二硫鍵，保持蛋白還原狀態(tài)，使之能與s d s 充分結合； 第二次平衡加入碘乙酰胺是為了去除多余的d t t ，保證第二向電泳結果的穩(wěn)定性。 4 ) s d s p a g e s d s p a g e 一般分為水平式及垂直式兩種類型，兩者各有特色【9 l 】。凝膠的制備也分 為均一膠和梯度膠兩種模式。s d s p a g e 膠濃度的選擇，需根據(jù)樣品性質和實驗目的而 定，最常用的是分辨范圍在1 5 6 0 k d a 的1 2 t 均一膠。均一膠的優(yōu)點是灌膠方便，重 復性好；缺點是蛋白點較為集中，分辨率不高。常用的緩沖系統(tǒng)是l a e m m l i 的t r i s g l y c i n e 不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)【9 2 】。針對于低分子量蛋白( 小于1 5 k d a ) 一般采用t r i s t r i c i n e 緩沖液 系統(tǒng)，糖蛋白則采用硼酸鹽。 4 ) 圖像獲得和掃描分析 凝膠染色的目的是把所分離的蛋白可視化，目前常用蛋白染色方法有靠馬斯亮藍法、 銀染法、熒光標記染色法和負染法等，它們在操作性、靈敏度、兼容性及定量分析等方 面各有特劇9 3 1 。 5 ) 蛋白檢測與鑒定 關于蛋白質的鑒定，現(xiàn)比較常用的方法有h p l c m s 、l c e s i - m s 和m a l d i - t o f - m s ， 1 2 謠北大學頂i ：學位論文 它們在操作系統(tǒng)、處理模式、鑒定能力上各有特點【9 4 1 ，應根據(jù)具體的實驗目的選定，或 者選取同時多種方法。 1 3 3 雙向電泳技術在植物蛋白質組學中的應用 差異蛋白質組學作為蛋白質組學的一個研究策略，它的主要目標是研究各種因素引 起的蛋白質組成或者含量變化，以發(fā)現(xiàn)具有差異的蛋白質，通過對這些差異蛋白進行深 入研究，探究影響因素和蛋白質變化的機理。目前，差異蛋白質組學作為專門的技術體 系廣泛應用于植物生理、植物組織器官和亞細胞、植物突變體、植物遺傳多樣性等多方 面研究。雙向電泳技術則為差異蛋白質組學研究的主要技術。 在植物生理應答機制的研究中，以雙向電泳技術為核心的差異蛋白質組學研究被大 量應用。植物在受到外界環(huán)境中的許多因子作用時，會引起植物體內大量的蛋白質在表 達種類和數(shù)量上發(fā)生變化，研究這些差異蛋白質可以使我們更好地了解植物對環(huán)境的信 號應答和適應機制等。x u 等人【9 5 】利用紫外線照射大豆，發(fā)現(xiàn)其葉片中黃酮含量出現(xiàn)明 顯變化，因此，他們利用雙向電泳技術分別分析了經過和不經過紫外照射的大豆葉片蛋 白，鑒定出了6 7 個變化顯著的蛋白質，它們分別參與了包括疾病防御、能量代謝、蛋白 合成、轉錄和次級代謝等很多生物過程，為研究黃酮在保護植物葉片抵御紫外線傷害機 制方面提供了大量的資料基礎。n e i l a 等人【9 6 l 利用雙向電泳技術研究了鹽脅迫下一種葡萄 品種( t u n i s i a n ) 的蛋白質組學變化，實驗結果發(fā)現(xiàn)植物經過濃度為1 0 0 m m o l l 的n a c l 處理1 5 天后，共檢測和鑒定了9 個下調蛋白，3 2 個上調蛋白和7 個新蛋白。 此外，在植物轉基因突變研究中，應用雙向電泳技術對經轉基因或基因敲除產生的 重組體與野生對照株進行差異蛋白質組學研究，并結合基因功能研究，可為轉基因突變 后的生理生化變化提供信息。r o c c o 等人【9 7 】在煙草植物中表達番茄p r o s y s t e m i n 基 ，煙 草獲得較高的抗病原體和氧化應激作用，然后利用雙向電泳技術分析了煙草葉片的蛋白 質組學，為利用蛋白質組學技術系統(tǒng)分析植物組織轉基因的表達機制提供資料。k o m a t s u 等人【9 8 】利用雙向電泳技術分析了突變型的水稻胚蛋白質組，鑒定出明顯下調表達的7 種 胚蛋白，通過后續(xù)實驗