（食品科學(xué)專業(yè)論文）碳源對干酪乳桿菌LC2W胞外多糖的生物合成及免疫活性的影響.pdf

上海海洋人學(xué)碩十學(xué)位論文 碳源對干酪乳桿菌l c 2 瓣胞外多糖的生物合成及免疫 活性的影響 摘要 近年來，乳酸菌胞外多糖受到越來越多的關(guān)注，除了可以改善產(chǎn)品的質(zhì)地如 疊感和粘稠度外，它還有很好的生理活性，如：抗瓣癯、免疫調(diào)節(jié)等。本文對于 酪乳桿菌l c 2 w 胞外多糖的生物合成、分離純化、結(jié)構(gòu)和免疫活性等進行了系統(tǒng) 研究。 以m r s 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對影響干酪乳桿菌l c 2 w 產(chǎn)胞外多糖的主要營養(yǎng)因子： 葡萄糖、酪蛋自胨和酵母提取物進行了單因素及難交試驗，確定培養(yǎng)基組成為葡 萄糖6 0 0 l ，酪蛋白胨1 6 o l ，酵母提取物1 0 0g l ，牛肉膏粉8 o l ，磷酸 氫二鉀2 o l ，吐溫一8 0l 。om l l ，檸檬酸氫二銨2 o l ，乙酸鈉5 o l ，硫酸鎂 e 。2 ，硫酸錳0 。0 4 l 。 采用響應(yīng)面分析法( r s m ) 對影響干酪乳桿菌l c 2 w 合成胞外多糖的培養(yǎng)條 件進行了優(yōu)化。確定的最適培養(yǎng)條件為：接種量4 ，發(fā)酵溫度3 1 5 ，發(fā)酵時 間3 2h 。驗證試驗結(jié)果表明，在此條件下胞外多糖的產(chǎn)量可達1 5 7 4 6m l 。此外 研究還發(fā)現(xiàn)控制p h6 。o 左右發(fā)酵，e p s 的產(chǎn)量可達3 7 1 9 0m 乙，是未控制p h 時 產(chǎn)量的2 3 6 倍。 對影響干酪乳桿菌l c 2 w 胞外多糖提取的主要工藝參數(shù)進行了研究。單因素 和爰交試驗結(jié)果表明，耀截罄分子量為1 0k d 的超濾膜將發(fā)酵上清液濃縮4 倍后， 用終濃度為6 的三氯乙酸脫蛋白，蔣用5 倍體積9 5 乙醇4 沉淀2 4h ，多糖 提取效果較佳。在此條件下，蛋白脫除率可達8 8 3 5 ，e p s 提墩率可達9 2 1 7 。 分別以葡萄糖、乳糖為碳源合成的粗多糖經(jīng)過d 囂a es e p h 鑫翔s ef a s lf l o w 離子 交換柱分級純化均得到三個組分：g 1 、g 2 、g 3 和l 1 、l 2 、l 3 。分別為羊h 多糖質(zhì) 量的2 1 3 3 、3 3 5 3 、2 9 6 7 和3 6 7 3 、1 8 5 1 、2 1 6 7 ，總回收率為8 4 5 3 和7 6 。9 l 。g l 、g 2 和l l 、l 2 為中性多糖，在s e p h a r o s ec l 。6 b 和h p l c 上都 顯示均一綴分。 運用紫外光譜、紅外光譜、h p l c 和氣相色譜對兩種碳源獲得的單一組分g 1 、 g 2 和l 1 、l 2 的結(jié)構(gòu)進行了初步分析。紫外光譜分析都不含蛋囪和核酸；紅外光 譜分析g l 、g 2 和l l 、己2 均呈現(xiàn)多糖的特征峰，但波形、特征吸收波段、波峰強 度有些差異；h p l c 測定g 1 、g 2 、l 1 和l 2 的平均分子量分別為6 6 5 1 0 d a 、 上海海洋大學(xué)碩+ 學(xué)位論文 l 。0 l 1 0 4d a 、2 2 5 1 0 6p a 和l ，3 6 l 4d a ；氣褶色譜分享廳g l 、g 2 和l l 、l 2 的主 要單糖組成摩爾比分別為：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖= 3 0 7 ：3 2 9 ：l ；鼠李糖：葡 萄糖：半乳糖= 2 8 4 ：6 4 ：l ；甘露糖：葡萄糖：半乳糖= 1 7 2 4 ：6 0 3 ：l ；甘露糖： 葡萄糖：半乳糖= 2 8 。7 l ：5 9 8 ：l 。 體外細胞培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，g l 、g 2 和l l 、l 2 均無細胞毒性，在5 8 0u g m l 的濃度范圍內(nèi)l 1 對b 淋巴細胞增賄的抑制作用比g 1 強，具有明顯的劑量效應(yīng)， 其抑制作用與濃度呈負相關(guān)；與此相反，在5 8 0u m l 的濃度范圍內(nèi)，g 2 對b 淋 巴細胞增殖擲鍘作用眈己2 強，表現(xiàn)為明顯的劑量效應(yīng)，其抑制作焉與濃度呈正相 關(guān)。 因此，碳源的改變會影響干酪乳桿菌l c 2 w 胞外多糖的組成，并引起其生理 活性產(chǎn)生差異。 關(guān)鍵詞干酪乳桿菌l c 2 w ，胞外多糖，分離純化，結(jié)構(gòu)，免疫 玨 上海海洋人學(xué)碩士學(xué)位論文 c j j l l b o ns o 猁俺e so nb i o s y n t h e s i sa n dl m m l 薹n o m o d h l a t i n g a c t i v i t yo fe x o p o l y s a c c h a r i d e s f r o m 口c 加6 口c 珊跖sc 甜s 8 l l c 2 w a bs t r a c t r e c e n t l y ，e x o p 0 1 y s a c 曲a r i d e s ( e p s ) p r o d u c e db yt h ef o o d 喈r a d el a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) w e r ei n t e n s i v e l ys t u d i e d b e s i d e si t sw i d ea p p l i c a t i o ni n t h ef o o di n d u s t r yf o ri t s i 撒o v e 礅e 捻o f 專h ef o o dl e x 專u r es 戳h 勰m o 滋h 凳e l 馘dv i s c o u 懿e s s ，s o m ee p s 魏勰b e e 玨 d e m o n s t r a t e dav a r i e t yo fh e a i t h p r o m o t i n gb e n e f i t s ，彈時i c u l a r l y a n t i t u m o ra n d i m m u n o m o d u l a t i n ga c t i v i t i e s i nv i v o t h eo b j e c t i v eo ft h i sp a p e rw a st os t u d yt h e b i o s y n t h e s i s ，p u r i 矗c a t i o n ，c o m p o s i t i o na n di m m u n o m o d u l a t i n ga c t i v i t yo fe p sp r o d u c e db y 三a e 彩芻( e i 露勰e z 曩g il c 2 w ， f i r s t l y ，t h ei m p a c to ft l l r e em a i nn 仇r i t i o nf a c t o r si nt h eg r o 、v t hm e d i u m ，b a s e do nm e c o m m e c i a lm r sb r o m ，o ne x o p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c t i o nb y 口c o 施c 湃甜sc 口刪乙c 2 w w 鑫ss 玨d i e d ，m e 式毪掇e o 瓣p o 建e 嫩sw e 愆o p t i m i z e d 姆m e 疆so fs i 娃g l e 是e o f 絕蛙蕊d o r m o g o n a le x p e r i m e n t s t h eo p t i m i z e dm e d i u m ( o p m ) w a sc o m p o s e do fg l u c o s e6 0 0 l ， c a s e i nt r y p t o n el6 og l ，y e a s te x t r a c t10 0g l ，b e e fe x t r a c tp o w d e r8 0g l ， k 2 | p 0 42 o l ，骶e n 瀚1 om l l ，n 弧e5 o 啦，湖m o n i u mc ；讎e2 。0 l ，m g s 0 4o 。2 班，m n s 0 4 o 0 4 l t om a x i m i s et h ey i e l do ft h ee p s ，t h ec u l t u r i n g n d i t i o n s ( i n o c u l ar a t i o ，i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r ea n dt i m e ) f o re p sp r o d u c t i o nw e r eo p t i m i s e d b ym e a n so fr e s p o n s es u r f a c e a n 采v s i s ，t h eo p i m 疆磁e o n d i t i o 玨sw e 懟e o n s 呈s e do fi n o g u l a 斌i o no f4 ，e 疆i 瓤薹i i 鼓g 融3l 。5 f o r3 2h u n d e rt h em e n t i o n e dc u l t u r i n gc o n d i t i o n s ，t h ey i e l do fe p sw o u l dr e a c i hl5 7 4 6 m g l i na d d i t i o n t h ey i e l do fe p sc o u l db ee i l l l a n c e df u 曲e rt oal e v e lo f3 7 1 9 0m l ，i f 落ee p sb i s v l l 彘e s i sw e l e l l 譬i e do l 建毽n d e fe o 娃s t a 懿lp 薹 v a l u eo f6 。0 ，a 鼗i 建e 薹e a s eb y2 。3 6 f o l d sc o m p a r e dw i t hm ey i e l do b t a i n e du n d e rn a t u r a lp hv a l u e n ep a r a m e t e r si n v o l v e di np r e p a r a t i o no fe p sf r o m 三以c 幻6 搿c f 刀淞c 哪p fl c 2 w w e r e 越s oi n v e s t i 鼯t e d 。s u p e r 娃a n t a n to fe u l t u r e dm r sb r o t hw a s & r s t l yu l t r a 蠡l t 戡e d ol 繕o f 蕊窶誣a lv o l u m eb yam e m b r a n ew i t hm w c 0o fl0 k d ，t h e nt h ep r o t e i n si n 落er e t e n 談e w e r ee l i m i n a t e db va d d i t i o no ft c at oa nu l t i m a t ec o n c e n t r a t i o no f6 ( w v ) ，a n dn n a l l y5 上海海洋人學(xué)碩十學(xué)位論文 v o l u m e sq f9 5 p r e c h i l l e de t h a n o lo ft h er e t e n t a t ew e r ea d d e d ，a j l dt h ee p sw a s p r e c i p a t e da t4 f o r2 4h d u r i n gt h i sp r o c e d u r e ，8 8 3 5 o ft h ep m t e i n sw e r e e l i m i n a t e d a n dt h ee p sr e c o v e r yr a t er e a c h e d9 2 1 7 s e c o n d l v ，e p ss y n t h e s i z e db y 6 c a s e fl c 2 w 仔o m d i f - f e r e n tc a r b o ns o u r c e s ( g l u c o s e o rl a c t o s e ) w e r e 行a c t i o n a t e db ya n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a e - s e p h a r o s ef a s t f l o wc o l u m n b o t ho ft h e mc a u lb e 仔a c t i o n a t e di n t ot h r e ep e a k s ：g 1 ，g 2 ，g 3a n dl1 ，l 2 ， l 3 ，w i t hg l ，g 2 ，g 3a c c o u n t e df o r2 1 3 3 ，3 3 5 3 ，2 9 6 7 o ft h ee p so b t a j n e df r o m m e d i u mu s i n gg l u c o s ea sc a r b o ns o u r c e ，w h i l el 1 ，l 2 ，l 3a c c o u n t e df o r3 6 7 3 ，1 8 51 ， 21 6 7 o fm ee p so b t a i n e d 仔o mm e d i u mu s i n gl a c t o s ea sc a r b o ns o u r c e t h er a t eo fe p s r e c o v e r yw a s8 4 5 3 a n d7 6 9 1 r e s p e c t i v e l y g 1 ，g 2a n dl l ，l 2w e r ea l l n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e s t h ep u r i t yo fg 1 ，g 2a n dl 1 ，l 2f r a c t i o n sw e r ef u n h e ri d e n t m e db yg e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yo ns e p h a r o s ec l 一6 bc o l u m na n dh p l cr e s p e c t i v e l y n e x t l y ，b ym e a n so fu v s p e c t r o s c o p y ，f t - i r ，h p l ca n dg c ，t h ec o m p o s i t i o no fg l ， g 2a n dl1 ，l 2 、e r ea n a l y z e d f t i rs p e c t r o s c o p i cg r 印h so ft h e4e p s 仔a c t i o n ss h o w e d c h a r a c t e r i s t i cb a n do fp o l y s a c c h 撕d e ，b u tt h eb a n d sw e r ed i f f e r e n ti ns h a p e ，c h a r a c t e r i s t i c a b s o 印t i o nr e g i o na n di n t e n s i t yo fp e a k t h ea v e r a g ew e i g h tm o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) o f g l ， g 2a n dl 1 l 2w e r e6 6 5 1 0 5d a ，1 0 1 1 0 4d a ，2 2 5 1 0 6d aa n d1 3 6 1 0 4d ar e s p e c t i v e l y ， m e a s u r e db yg e lf i l t r a t i o nh p l c t h em o l er a t eo f m o n o s a c c h a r i d e sw a sr h a m n o s e ：g l u c o s e ： g a l a c t o s e = 3 0 7 ： 3 2 9 ： 1 ，r h a m n o s e ：9 1 u c o s e ：g a l a c t o s e = 2 8 4 ： 6 4 ： 1 ，m a n n o s e ：9 1 u c o s e ： g a l a c t o s e = 1 7 2 4 ：6 0 3 ：l ，m a r u l o s e ：9 1 u c o s e ：g a l a c t o s e = 2 8 7 1 ：5 9 8 ：1f o rg 1 ，l 1 ，g 2a n d l 2r e s p e c t i v e l y ，a n a l y z e db yg c t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec h a n g eo fc a r b o ns o u r c e c o u l da f f e c tm es t m c t u r e so fe p s ， i n c l u d i n g m o l e c u l a rw e i g h t ，t h em 0 1 er a t eo f m o n o s a c c h a “d e s f i n a l l y ，g1 ，g 2a n dl1 ，l 2s h o w e dn oc y t o t o x i c i t yt ol y m p h o c ”e sc u l t u r e di nv i t l o o nt h ec o n t r a r v ，a 1 1o ft h e4e p sf r a c t i o n sd e m o n s t r a t e ds t r o n gi 1 1 h i b i t o r ya c t i v i t yt ot h e p r o l i f e r a t i o no fb 1 y m p h o c y t e ss t i m u l a t e db yb a c t e “a 1l i p o s a c c h a r i d e si n v i t r o i nt h e r a n g eo f5 8 0 u g m l ，t h ei n h i b i t o r y a c t i v i t i e so fg 1a n dl 1t ot h ep r o l i f e r a t i o no f b 1 y m p h o c ”e sw e r en e g a t i v e l yc o l l r e l a t e dt ot h ec o n c e n t r a t i o no fe p s ，w h e r e a sg 2a n d l 2p o s i t i v e l yc o r r e l a t e dt ot h ec o n c e n t r a t i o no fe p s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef o u r e p sf a c t i o n sw e r ep o t e n t i a li ni m m u n o s u p p r e s s i o n t h e r e f o r e 。i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a tt h ec a r b o ns o u r c e si nt h eg r o w t hm e d i u mm i g h t b ead e c i s i v ef - a c t o rf o rt h ec o m p o s i t i o na n de v e nt h eb i o a c t i v i t yo f t h ee p ss y n t h e s i z e db y 6 c 臼s g fl c 2 w i v 上海海洋入學(xué)碩十學(xué)位論文 k e yw o r d s 三口c ，d 6 口c f ，甜sc 口s p f l c 2 w ，e x o p o l y s a c c h a r i d e s ，p u r i f i c a t i o n ， c o m p o s i t i o n ，i m m u n o m o d u l a t i n ga c t i v i t y v 上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇淺嚴謹學(xué)風(fēng)。所星交的學(xué)位 論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行研究工作所取褥的成果。除 文中已經(jīng)明確注明靜雩| 用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集 體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過篦作品及成果的痰容。論文為本人親魚撰寫，我 對所寫的內(nèi)容負責(zé)，并完全意識到本聲明的法律結(jié)采由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名：奎l 翠手 日期：1 3 i 口蜷年占月j 占日 上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使焉學(xué)位論文的規(guī)定， 同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子 舨，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位 論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、 縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 鏍密 疊 ，在年瓣密蓐適焉本敝權(quán)書。 本學(xué)位論文屬于 不保密 口 學(xué)位論文作者簽名：謄j 翠平 嗣期：盛嘲年占月6 日 指導(dǎo)教師簽名： 日期捌年擊卵f u t ， 上海海洋大學(xué)碩十學(xué)位論文 1 】乳酸菌胞外多糖 第一章緒論 乳酸菌是一類能發(fā)酵利用碳永化合物并產(chǎn)生大量乳酸的細菌，按镥杰氏系統(tǒng) 細菌學(xué)手冊中的生化及形態(tài)分類法，乳酸菌被劃分為1 8 個屬，乳酸菌是益生菌最 主要的來源，許多乳酸菌是人體腸道固有的益生葭，它具有改善人體腸道菌群， 調(diào)節(jié)機體免疫力，抑腫瘸，降低盤清膽圈醇，調(diào)節(jié)血壓等重要的生理活性譬囊j 。多 糖是指由二十個以上單糖組成的糖類化合物，根據(jù)來源不同，可分為植物多糖、 動物多糖和微生物多糖。乳酸菌胞外多糖( l a be p s ) 是指乳酸菌在其生長、代謝 過程中分泌到細胞外的糙液或莢膜多糖冷l 。 一般認為，乳酸菌的益生作用一方面通過益生菌自身的定植、繁殖作用實現(xiàn)， 而另一方麗則來自其代謝產(chǎn)物如胞外多糖的作用。近年來，乳酸菌胞外多糖越來 越受到關(guān)注，除了可以改善產(chǎn)品的質(zhì)地如口感和粘稠度外，還具有多種潛在的生 理功能。在很多具有保健功能的傳統(tǒng)發(fā)酵制品中都含有大量產(chǎn)胞外多糖的舔株， 如斯堪的納維亞地區(qū)的v i i l i 和高加索地區(qū)的k e f i r 。k i t a z a w a 等認為發(fā)酵乳對人 體健康有益的生理特性與乳酸菌的細胞壁成分有關(guān)，特別是胞外多糖【4 j 。目前已發(fā) 現(xiàn)胞外多糖具有抗薹孛瘤、抗?jié)n瘍、提高免疫力及降低膽固醇等活性筘l 。 1 2 乳酸菌胞外多糖國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 1 2 i 產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌 目前有關(guān)乳桿菌( 五口c 幻6 以c f 7 7 甜s ) 、鏈球菌( 鼢印砌c c 淞) 、明串珠菌( 髓甜c o 瑚s 幻c ) 和乳酸乳球菌( 盤e d e o c g 淞) 等幾個屬的菌株產(chǎn)胞外多糖的研究比較多，由腸膜明串 珠菌( k 材c 掰g s g 黝g 陽矗恕ss 材凇矽施x 凇囂紀掰瓏) 生產(chǎn)的右旋葡萄糖酹屬于最早被開發(fā)利 用的乳酸菌胞外多糖，也是f d a 批準的第一種可添加于食品中的微生物胞外多糖。 大多數(shù)產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株是從乳及乳制品中分離得到的，但也有部分 菌株是從發(fā)酵離制品中分離獲得的。從乳品中分離獲得的生產(chǎn)菌株有：德氏保掬 利亞乳桿菌( 三6 沈珀，“p c 肪fs 甜6 印6 蹦f i 孵r 七材s ) 、瑞士乳桿菌( 三6 加z v p ，紀塒) 干潞乳桿 上海海洋人學(xué)碩十學(xué)位論文 菌干酪亞種6 s g ；s 掰6 印。凇喲、開囂爾乳桿菌( 務(wù)婦研磁靠咖幽 璐) 嗜酸乳杼菌 犯6 伽溉妒乃舢) 、嗜熱鏈球菌( s 腩p m 哪f d 淞) 、乳酸乳球菌乳脂亞種( 三奠z ，以甜西 翩6 印c 陀刪o ，括) 、乳酸乳球菌( 五a 脅c 凰s “6 踞腸c 加) 、腸膜明串珠菌 ( 如鼴瓏囂g 黝p 陽矗奄s5 掰參印。搬g s g 囂紹黝f 旋s ) 等。此外，乳酸菌中的片球菌( 忍痰d e d g 瓣 菌株也可以產(chǎn)生胞外多糖。 乳酸菌菌株不同，產(chǎn)生胞外多糖的量亦不相同【6 j 。迄今已有的研究表明，乳酸 菌產(chǎn)胞外多糖的最大量變化在1 2 0 0m 歲l ( 鼠李糖乳桿菌。砌口掰托穢s 淞) 到1 3 7 5m l ( 清酒乳桿菌。s 搖幻掙。j ) 之聞l 強。表 1 列出了部分乳酸菌種屬產(chǎn)胞外多糖的情 況f 7 - l 卯。 表卜1 不同乳酸菌合成e p s 的量 1 矗b l el - l 下h ey i e l do fe p sp f o d 娃e e db y 矗c f 格靠e 妊6 程c g r 級 1 2 2 乳酸菌胞外多糖的分類與生物合成 按照合成位點和合成模式不同，乳酸菌胞外多糖分為兩種類型，即位于細胞 壁外的同源多糖( h o m o p o l y s e h 撕d e ) 與位于細胞膜上的異源多糖 ( h e t e r o p o l v s a c e h a r i d e ) 【1 6 f 刀。同源多糖是在胞外合成的，由一種單糖組成，含有 4 個亞基：1 ) c i d 。葡聚糖，主要由葡萄糖殘基以0 【，l ，6 糖苷鍵連接，同時在3 位上 連有不同程度的分支，而在2 位和4 位上很少有分支；( 2 ) d d 葡聚糖，出葡萄糖 殘基以1 ，3 糖苷鍵連接，以1 ，2 鍵形成分支；( 3 ) 集聚糖，主要宙d 一果糖殘基 以d 2 ，6 。糖苷鍵連接而成；( 4 ) 其他種類的多聚糖，如聚半乳糖是由結(jié)構(gòu)一致的重 2 上海海洋人學(xué)碩十學(xué)能論文 復(fù)單體以不同的糖苷鍵連接組成的。異源多糖是噱嗜熱菌和嗜澡菌合成的，是由2 個以上單糖組成的單元聚合而成，在重復(fù)單元中可以存在非糖分子。 同型多糖的合成體系包括糖基供體、糖基受體和糖苷轉(zhuǎn)移酶。如腸膜明串珠 菌合成葡聚糖，它是單鏈反應(yīng)機制，以蔗糖為唯一底物，合成所需的能量來自蔗 糖的水解，不需脂載體和獨立的分支酶，合成靜葡聚糖分子量大。其合成途徑如 下： 葡聚糖蔗糖酶 蔗糖+ ( 1 ，6 一氈一d 葡聚糖) 。( 1 ，6 程一d 。葡聚糖) 。+ l + 果糖 異型多糖的合成體系則包含5 個因子：糖基一核苷酸、?；w、脂中間體、 酶系統(tǒng)及糖基受體，在細胞膜上合成多糖需要活性前體，即各種高能態(tài)的單糖， 這些高能態(tài)的單糖主要是糖基一二核苷酸，所有含 鬟；萄糖的多聚物( 除糖原外) 均_ 以 u d p d 葡萄糖為供體；乙酸、丙酮酸、3 羥基丁酸等的活性形式是酰基，是胞外 多糖合成所必需的；異戊二烯脂中涮體整合多糖的重復(fù)單元，在原核細胞多糖合 成中起作黑的是焦磷酸異戊二烯脂；酶體系包括己糖激酶、糖基一核苷酸合成及 轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、聚合酶等。目前對乳酸菌異源多糖的合成了解甚少h 黼。 對乳酸菌e p s 生物合成的基因調(diào)控研究表明，嗜溫乳酸菌產(chǎn)生e p s 的特性受 大小不一的各種質(zhì)粒的控制，但是，某些條件下( 如高溫、頻繁傳代) 產(chǎn)e p s 的 特性容荔喪失。v e d a m u h u 等人發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌乳脂亞種m s 的產(chǎn)e p s 特性受一 個1 8 5 。m d a 的質(zhì)粒的控制，這個質(zhì)粒還具有抗噬菌體的特性吲。v e s o v o 等發(fā)現(xiàn)干 酪乳桿菌干酪亞種產(chǎn)e p s 的特性受個4 5 m d a 的質(zhì)粒的控制，同時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)e p s 的德氏乳桿菌傈加剩亞亞種不含質(zhì)粒疆引。 嗜熱性乳酸菌通常不含質(zhì)粒，e p s 的編碼基因通常在染色體上，例如，s t i n g e l e 發(fā)現(xiàn)的斷p p 幻c d c c 塒，乃8 r 聊d 礎(chǔ)f ，甜ss f i 6 編碼基因和g r i 銜n 發(fā)現(xiàn)的脅p p 肋c o c c 甜s s 旋豫r i 瓣s s p 。繡g 刪節(jié)是f z 淞s t f a i nn c b f2 3 9 3 編碼基因都在染色體上1 2 4 ，2 5 j 。 l t 2 - 3 乳酸藹胞外多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)分析 目前有關(guān)乳酸菌胞外多糖分離純化和結(jié)構(gòu)分析的研究很多，分離純化的目的 是通過分離濃縮發(fā)酵液，得到穩(wěn)定的、易使用的、易再溶的多糖產(chǎn)品。多糖分離 純化所采耀的步驟基本相同，但基于其體培養(yǎng)介質(zhì)和胞外多糖性質(zhì)的不同，分離 手段又存在差異；多糖結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，對多糖結(jié)構(gòu)進行解析比較困難，隨著現(xiàn)代 分析技術(shù)的飛速發(fā)展， l a be p s 的結(jié)構(gòu)解析也會越來越方便。 l 。2 3 1 乳酸菌胞外多糖的分離純化 e p s 的分離純化是多糖結(jié)構(gòu)解析以及研究功能特性的基礎(chǔ)，多糖的分離純化 上海海洋人學(xué)碩十學(xué)位論文 方法要攝據(jù)多糖豹性質(zhì)和所含雜質(zhì)成分來決定1 2 翻。通常采用的步驟是先除蛋白， 再用有機溶劑沉淀e p s 瞄卜3 u j 。 脫蛋囪常用的方法有：( 1 ) s e v a g e 法。此法的優(yōu)點是條件溫和，不會引起活性 多糖變性，缺點是效率低，要經(jīng)多次反復(fù)爿能將蛋自除盡；( 2 ) 三氟三氯乙烷法： 將三氟三氯乙烷與提取液按l ：l ( v v ) 混合，搖動、離心，提取液中的蛋白質(zhì)被抽 提到溶劑層中，此法效率高，但溶劑易揮發(fā)，不宜大量使用；( 3 ) 在提取液中加入 三氯乙酸至終濃度達4 1 4 ，提取液中的蛋白質(zhì)在三氯乙酸的作用下成膠狀， 此法優(yōu)點是效率高，操作簡單，缺點是作用剔烈，對含吠哺糖殘基的多糖有破壞 作用，要控制好最佳用量。 對于些低分子量的雜質(zhì)，如無機鹽、脫蛋白殘留劑、低聚糖等，常采用透 析法、離子交換樹蒡誓法和凝膠過濾法將其除去。 常用的溶劑有小分子醇類如甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮，這些溶劑可降低多 糖的溶解性，而且可回收再利用，為節(jié)約有機溶劑的用量，常對提取液濃縮后再 進行沉淀。超濾作為一種薪型、高效的分離技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用到e p s 的分離過程， 膜分離技術(shù)具有設(shè)備簡單、可常溫操作、無相變及化學(xué)變化、選擇性高及能耗低 等優(yōu)點阢3 2 1 ，超濾可以除去e p s 溶液中低分子量雜質(zhì)和色素【3 3 3 4 1 。 初步分離礙到的e p s 可能是多種多糖的混合物，甚至還含有一些難以去除的 雜質(zhì)，因此，需要進一步純化以得到高純度的多糖。常用的方法是通過離子交換 柱和凝膠層析柱分離，離子交換常用介質(zhì)為d e a e 纖維素、d e a e 葡聚糖、d e a e 瓊脂糖等，凝膠柱層析介質(zhì)主要有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺葡聚糖 凝膠等1 3 5 夕”。 1 2 3 2 乳酸菌胞外多糖純度鑒定 e p s 是一種大分子化合物，其純度標準不能用常用小分子化合物的純度標準 來衡量，因為即使是多糖純品，其微觀也是不均一的，它的純度只代表某一多糖 的相似鏈長的平均分布，通常多糖純品實質(zhì)上是一定分子量的均一組分。多糖純 度鑒定通常有四種方法：比旋度法、超離心法、高壓電泳法和凝膠過濾法。附三 種方法誤差較大，目前最常用且較準確的方法就是第四種方法，即h p l c 法瞄引。 1 2 3 。3 乳酸菌胞外多糖酌結(jié)構(gòu)分櫥 乳酸菌e p s 是由許多重復(fù)單位構(gòu)成的帶有分支結(jié)構(gòu)的多糖，分子量大，結(jié)構(gòu) 復(fù)雜，多糖的一級結(jié)構(gòu)變化較大，而且一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)( 構(gòu)象) ，它的結(jié)構(gòu) 層次與蛋憊質(zhì)的結(jié)構(gòu)含義基本相同，也可以分為一級、二級、三綴、四級等。多 糖的二級結(jié)構(gòu)通常是指多糖的骨架形式，即多糖骨架鏈內(nèi)以氫鍵結(jié)合所形成的各 種聚合體，系指多糖分子的主鏈構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈的空間排布；在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 4 上海海洋火學(xué)碩十學(xué)能論文 上進一步卷益或拆疊，或者是兩鏈雙螺旋攙歹l 形藏一特定構(gòu)象怒多糖鯰三綴結(jié)構(gòu)： 多糖的四級結(jié)構(gòu)是指相同或不相同多糖鏈的協(xié)同結(jié)合，即亞單位現(xiàn)象。 糖鏈的結(jié)構(gòu)遠比月太鏈復(fù)雜，肽鏈的合成有模板，可以通過c d n a 的測序來推 測肽鏈的氨基酸順序，但糖鏈的合成沒有模板，無法利用“模叛”類的模式來推 測糖基順序，因此，糖鏈的一級結(jié)構(gòu)分析一直比較落后。近年來糖鏈結(jié)構(gòu)測定技 術(shù)突飛猛進，如：高分辨率核磁共振，快原子轟擊質(zhì)譜( f - a b 。m s ) 等，使完熬的多 糖結(jié)構(gòu)分析包括對多糖的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的分析才得以實現(xiàn)。到目前為止， 已經(jīng)建立的多糖一級結(jié)構(gòu)的分析方法有化學(xué)分季廳法( 懿酸水解、過碘酸氧化、s m 漣 降解、堿降解、甲基化反應(yīng)、乙酰解等) 、物理分析法( 包括高效液相色譜法、氣相 色譜法、紅外光譜法、核磁共振譜法、質(zhì)譜分析法等) 和生物分析法( 主要是酶化學(xué) 方法、 。多糖的二級、三綴結(jié)構(gòu)的研究更為困難，鼴靜采用的方法有：x 射線衍射 法、熒光法、毛細管電泳法、h cn m r 及2 dn m r 、旋光度( 0 r d ) 和圓二色譜( c d ) 、 快原子轟擊質(zhì)譜( f a b 。m s ) 、氣質(zhì)聯(lián)用( g c m s ) 、酶技術(shù)n m r 等。 乳酸菌胞外多糖相對分子量較大，分子量范圍一般在l 。o 1 0 4 d a 到6 o 1 0 6 d a 之問瑟。秘，但是其重復(fù)革元相對簡單，單糖組成中一般總含有d 一葡萄糖、d 半乳糖 和l 一鼠李糖，只是三者的組成比例不盡相| 司【鯔制j 。然而甜c f 面砌f ，螂l m g9 4 3 3 f 4 3 l 、三6 庇口如p f f c 疆n c d 07 6 6 【4 4 1 、厶b 。砌印豫船o s “sc 8 3 【4 引、s ，辦口，m d 口矗f z 甜ss 蝣2 0 【4 6 】 等乳酸蘸所產(chǎn)胞外多糖中沒有鼠李糖，s 踴g ，班印是鑫淞o 爻購l 新產(chǎn)胞外多糖中僅含 半乳糖和鼠李糖【4 7 1 ，上6 s 口婦0 1 所產(chǎn)胞外多糖僅含葡萄糖和鼠李糖【4 羽。三6 c 伽口f c g l l 除了鼠李糖、半乳糖和葡萄糖之外，還含有少量的阿拉伯糖和甘露糖1 4 川。除 了單糖之外，有些胞外多糖中還含有其它特殊基隧如n 乙酰基、o 乙?；?、磷酸 基和乙酸基等 弱巧越，還有些胞外多糖結(jié)合蛋白質(zhì)或肽類形成糖蛋白或糖。肽復(fù)合 物。有些乳酸菌能夠產(chǎn)生一種以上的胞外多糖，如果分離和純化方法不當可能很 難將這些臌外多糖分離純化出來【5 3 l 。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件無論對e p s 組成還是結(jié)構(gòu) 影穩(wěn)都很大。國外已有許多學(xué)者對乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)進行了分紊廳，僮是國內(nèi) 鮮見報道，關(guān)于干酪乳桿菌產(chǎn)生的雜多糖結(jié)構(gòu)目前國內(nèi)外均未見報道。 1 2 4 乳酸菌胞外多糖的生理功能 自1 9 8 2 年冒本學(xué)者弧i o m i 等湖報道乳酸菌囂p s 具有抗腫癯作用以來，乳酸 菌胞外多糖功能研究引起了許多學(xué)者的注意?，F(xiàn)在已有大量證據(jù)表明，乳酸菌胞 外多糖具有很好的生物學(xué)功能，如抗腫瘤、抗?jié)?、調(diào)節(jié)免疫力及降低膽固醇、 調(diào)節(jié)血壓等活性，對人類健康都是有益的。另外，乳酸菌胞外多糖的不可消化性 方蠹也開始了研究，有望將乳酸菌胞外多糖作為益生元加| 以剩用( 見圖l 。l j ) 。 因此，乳酸菌e p s 作為對人體健康和經(jīng)濟都有利的功能食品成分有進一步丌發(fā)和 上海海洋人學(xué)碩士學(xué)能論文 發(fā)展的潛力，受到了極大的關(guān)注。 有蓋竺 的俸糟 蠲 _ 1 乳酸菌胞外多糖促透人體健康的途徑 f i g u r e l - 1s c h e n l a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ep o s s j b l eh e a i t h p r o m o t i n gp r o p e n i e so f e x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c e db yl a c t i ca c i db a c t e r i a l 。2 。4 1 乳酸菌胞夕| 、多糖對菌體的保護作用 乳酸菌e p s 主要起保護菌體的作篇，包括保護細胞免受毒害、抵御不良環(huán)境、 增強抗性、鰲合金屬離子、定植和細胞識別、并可能抑制溶菌酶和防御噬菌體的 進攻。因為乳酸菌e p s 可以結(jié)合水形成親水表面防止細胞干裂，鰲合重金屬離子 防止其毒害，饅噬菌體不敏感從麗防止其侵害，防止抗生素破壞細胞( 抗生素必須 在胞外多糖中達到飽和才能到達細胞壁) ，提供高氯張力等，從而使菌體耐受低濕 度的環(huán)境【”j 。 l 。2 。4 。2 乳酸菌胞外多糖促進菌體在腸道黏膜上的吸附 除了乳酸菌活菌可以調(diào)節(jié)腸道蘺群平衡，促進健康外，膳食中的多糖作為一 種益生素對腸道的調(diào)節(jié)和對腸道有益菌的定植也超到重要作用【1j 。對于細菌粘附作 用的研究表明，細菌產(chǎn)生的e p s 可以提高菌株對腸道表面的非特異性粘附能力1 5 引。 g e f n l a n 等推測，e p s 使食品的黏度增加，從麗延長了發(fā)酵乳制晶在胃腸道內(nèi)的存留 時間，因此對益生菌在腸道內(nèi)短暫的定植非常有益1 57 | 。 l 。2 4 3 乳酸菌胞外多糖的抗腫瘤作用 酯i 激等人發(fā)現(xiàn)了三露歇務(wù)癢e 露淄務(wù)掰毳瞪r i e 璐8 7 8 r 所產(chǎn)塞p s 具有抗脖潼活性圈， o d a ，m 等也報道了l a be p s 的抗腫瘸活性5 9 1 ，k i t a z a w a 等【6 0 】報道，向荷肉瘤s 1 8 0 小鼠腹腔中注入乳酸乳桿菌乳油亞種k v s 2 0 含有e p s 的菌體凍干后，產(chǎn)生了抗癌 效果，而注射僅含菌體黔荷肉瘤s 1 8 0 小鼠沒有此效果。曩翦研究認為乳酸蘸囂跫外 多糖抗腫瘸作用機制為：( 1 ) 影響血液供應(yīng)，鑒于細菌素能引起腫瘤細胞的出血 6 上海海洋人學(xué)碩十學(xué)位論文 性壞死，曾經(jīng)設(shè)想多糖的抗蒡孛瘤可熊影喃蒡孛瘤纓胞的盤液供應(yīng)；( 2 ) 對纓胞體積 和空胞化的影響，多糖分子可以從腹膜吸附進入胤液循環(huán)，然后活化多糖分子， 其活化的部分擴散回到腹膜腔內(nèi)以直接影響腫瘤細胞：( 3 ) 多糖分子或其一部分， 可以刺激一種器官和組織偽】腎上腺和鼴狀內(nèi)皮系統(tǒng)) ，再分泌種物質(zhì)作用于囂孛瘤 細胞；( 4 ) 細胞膜接觸抑制的功能，d e a e 一右旋糖苷，對于腹水腫瘤細胞，體內(nèi) 和體外試驗表明有抑制效應(yīng)。 l 。2 。4 。4 乳酸菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)作用 e p s 篡有免疫調(diào)節(jié)作用是通過許多研究者散的有關(guān)實驗得爨的結(jié)論。例如： g o m e z 等從青春雙歧桿菌a t c c1 5 7 0 3 培養(yǎng)物的上清液中分離得到的胞外物質(zhì)能 增強鼠脾淋巴細胞活性，從胞外物質(zhì)中分離得到的e p s 顯示出較高的淋巴細胞增 殖作用酬。k i a z a w a 曾報道三駐國e d e 穢瓣紜。嫩s 掰務(wù)幫f 愆搬d r 瑟產(chǎn)生的磷酸多糖不但 具有抗腫瘤效果，而且具有一定的提高免疫活性1 6 2 矧，他也發(fā)現(xiàn)三日c 幻6 d c f ，z 淞 如舾r 甜p c m 量即6 “f j 聊尸f c 甜s0 l l l 0 7 3 r 。1 所產(chǎn)e p s 能夠促進淋巴細胞的增殖，增強 重噬細胞的吞噬功能f 6 5 6 l 。顧瑞霞對唾液鏈球菌嗜熱亞種的研究發(fā)現(xiàn)，e p s 對小 鼠的細胞免疫和體液免疫均有促進作用強引。顧笑梅等研究了乳酸菌z 2 2 2 產(chǎn)生的胞 外多糖對荷瘤小鼠機體免疫功能的影響，結(jié)果表明，e p s 具有較高的促進淋巴細 胞產(chǎn)生特異抗體的能力，能對抗由壞磷酞胺引起的禱瘤小鼠脾臟重量的降低和提 高小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)應(yīng)答能力洚搬。河南大學(xué)許瘧泰等發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌e p s 連 續(xù)喂養(yǎng)小鼠可提高小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)應(yīng)答能力，促進脾細胞抗體形成及增強 巨噬細胞的吞噬功能，有增強機體免疫的作用【6 圳。 由乳酸藕產(chǎn)生的p s 還具有其他免疫功能，如誘導(dǎo)細胞生長抑制素( 7 于擾素 和白介素1 伐) 的產(chǎn)生等。但是關(guān)于l a be p s 在抑制淋巴細胞分裂增殖，降低免疫 力，抑制過敏反應(yīng)等方面未見報道。 l 。2 。5 乳酸菌胞外多糖的構(gòu)效關(guān)系 多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，結(jié)構(gòu)與功能之間具有決定與被決定的關(guān)系。 多糖結(jié)構(gòu)中的每一個因索對其生物活性都有不同程度的影響。e p s 的生物活性受 到多糖的級結(jié)構(gòu)包括單糖組成、連接方式、糖菅鍵類型和分支度等因素影響l 。 多糖斡主鏈結(jié)構(gòu)與其生物活性關(guān)系密切，例如，翟騎普遍認為葡萄糖鏈上的一l ，3 一 糖苷鍵和支鏈上的p 1 ，6 糖苷鍵是多糖抑制腫瘤所必需的1 7 。p 1 ，3 連接的葡聚糖 和半乳聚糖有抑瘤活性，b 1 ，3 為主鏈的葡聚糖中含( 1 ，6 ) 支鏈的多糖部分有活性。 多糖的側(cè)鏈基匿和分支程度都與其生物活性有緊密關(guān)系f 霸，眾多研究也表瞬，對 多糖d 葡萄糖單元支鏈的去除和修飾都可能會引起多糖活性變化。在單糖的連接 位置方面，具有l(wèi) _ 3 連接方式的多糖大多具有生物活性，部分1 _ 6 連接方式的 7 上海海洋人學(xué)碩十學(xué)位論文 多糖也具有生物活性，焉l 一2 、l _ 4 等連接方式的多糖剮活性很小。多糖生物活 性還與其分子的空間構(gòu)蒙有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，高分子量d 1 ，3 d 葡萄糖高度有序的三 股螺旋結(jié)構(gòu)對于免疫調(diào)節(jié)活性至關(guān)重要1 7 引。 1 2 。6 影響乳酸菌胞外多糖合成的主要因素 目前，有關(guān)研究已經(jīng)表明，影響乳酸菌合成胞外多糖的主要因素有鎣株遺傳 特性、培養(yǎng)基類型及組成和發(fā)酵條件( 如發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、p h 值) 等m 7 6 | 。 1 2 6 1 菌株逮傳特性 不同的乳酸菌菌株囂鸛的合成能力差別很大，焉同一品季睪的不同蒜系瞧具有 相當大的差異，并且不同的學(xué)者報道的結(jié)果也不盡相同，胞外多糖產(chǎn)量的不穩(wěn)定 性與其黏度結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性一樣