（發(fā)酵工程專業(yè)論文）生姜蛋白酶的研究.pdf

摘要 摘要 生姜蛋白酶是一種有待開發(fā)利用的新的植物蛋白酶，本文對生姜蛋白酶酶活的測定 方法、生姜蛋白酶粗酶的制備、生姜蛋白酶的穩(wěn)定性及其應(yīng)用進(jìn)行了研究。 確定了生姜蛋白酶酶活測定方法。在酪蛋白溶液濃度為l ，反應(yīng)溫度為5 0 ，檸 檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液( p h 6 o ) 濃度為0 0 5 m o l l 的條件下準(zhǔn)確反應(yīng)4 m i n ，加2 m l 三 氯乙酸( 0 4 t o o l l ) 終止反應(yīng)；用紫外分光光度法測定產(chǎn)物酪氨酸的含量。本方法 r s d = i 3 9 7 ，重復(fù)性好，可以作為生姜蛋白酶酶活的檢測方法。 研究了生姜蛋白酶粗酶的提取方法，確定提取工藝為：生姜：p h 7 0 磷酸氫二鈉 磷酸二氫鉀緩沖液( o 1 m o l l ) = 1 ：4 ，用豆?jié){機(jī)打成漿，在4 下放置l h ，抽濾，棄雜 質(zhì)，所得清液即是生姜蛋白酶的抽提液；向抽提液中緩慢加入1 7 倍( v v ) 9 5 的工業(yè)酒 精沉淀酶蛋白，抽濾干燥后所得沉淀即為粗酶。其比活力達(dá)到1 5 5 3 6 u m g 蛋白。 研究了生姜的儲存溫度和方式、酶的儲存溫度、金屬離子、巰基試劑、螯合劑、抗 氧化劑對生姜蛋白酶穩(wěn)定性的影響。發(fā)現(xiàn)生姜在2 0 下冷凍儲存6 3 d ，生姜蛋白酶的酶 活沒有損失，漿狀儲存方式優(yōu)于塊狀儲存方式；溫度對生姜蛋白酶的影響較大，生姜蛋 白酶在2 0 下保存1 4 d 沒有酶活損失，而在4 與室溫下分別于1 4 d 和6 d 全部失活。 c u 2 + 、2 r n 2 + 、m 礦對生姜蛋白酶的酶活具有抑制作用，抑制能力c u 2 + m d + z n 2 + ，n 礦、 m n 2 + 、c a 2 + 對生姜蛋白酶的酶活影響不大，f e e + 具有激活生姜蛋白酶的作用，較空白( 未 添加f e 2 + ) 提高了9 8 2 倍；巰基試劑對生姜蛋白酶的激活效果為半胱氨酸 巰基乙 醇 d t t 。1 0 m m o l l 的e d t a 能夠使生姜蛋白酶的酶活提高1 2 6 2 。抗氧化劑異抗壞 血酸鈉對生姜蛋白酶酶活具有抑制作用。 考察了生姜蛋白酶在啤酒、黃酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。在啤酒糖化的應(yīng)用研究中，確定了 生姜蛋白酶最佳添加階段為糖化溫度升至6 3 時；當(dāng)生姜蛋白酶添加量為1 0 5 9 8 u k g 原料時，輔料量為4 0 的麥汁中a 氨基氮含量為1 8 1 4 6 m g l ，基本滿足酵母生長和代謝 的需求。在啤酒澄清應(yīng)用的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)生姜蛋白酶的添加量為1 3 2 u l 時，在o 保存1 0 d ，其澄清度提高了2 1 4 3 ，而啤酒的色度則降低了1 7 8 3 。在黃酒澄清應(yīng)用 的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加量為1 3 2 u l ，作用時間為1 h 時，黃酒的澄清度提高了5 2 6 。 關(guān)鍵詞：生姜蛋白酶；酶活測定；提?。环€(wěn)定性；應(yīng)用 a b s t r a c t a b s t r a c t g i n g e rp r o t e a s ei san e wp l a n tp r o t e a s e t h em e a s u r e m e mo fe n z y m ea c t i v i t y , t h e e x t r a c t i o nm e t h o do fc r u d eg i n g e rp r o t e a s e ，t h es t a b i l i t ya n dt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s e w e r es t u d i e di nt h i sp a p e r t h em e a s u r e m e n to fe n z y m ea c t i v i t yo fp r o t e a s ef r o mg i n g e rr h i z o m ew e r ei n v e s t i g a t e d e n z y m ea c t i v i t yw a sa s s a y e du s i n gc a s e i n ( 1 i n0 0 5 m o l lc i t r i ca c i d - - d i s o d i u mh y d r o g e n p h o s p h a t eb u f f e r , p h 6 0 ) a t5 0 。cf o r4 m i n t h ee n z y m ec a t a l y t i cr e a c t i o nw a ss t o p p e db y a d d i t i o no f2 m lt r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) ( 0 4 m o l l ) ，t h ep r o d u c tt y r o s i n ew a sa s s a y e du s i n g t h eu vt h er s di s1 3 9 7 ，s ot h em e t h o dh a sab e t t e rr e p e a t a b i l i t y , i tc a nb eu s e di nt h e m e a s u r e m e mo fg i n g e rp r o t e a s ea c t i v i t y t h ee x t r a c t i o nm e t h o do fc r u d eg i n g e rp r o t e a s ew a ss t u d i e d ，a n dt h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g y w a sd e t e r m i n e d f r e s hd i c e dg i n g e rw a sh o m o g e n i z e dw i t h4p a r t ( w v ) c o l db u f f e r t h e m i x t u r ew a sp l a c e da t4 cf o rl hb e f o r ef i l t r a t e d ，a d d i n g1 7 t i m e s ( v v ) i n d u s t r i a la l c o h o l ( 9 5 ) t ot h ef i l t r a t es l o w l y t h ec r u d ee 1 1 z y m ew a so b t a i n e da f t e rf i l t r a t e da n dd r i e d t h ea c t i v i t yo f t h ec r u d ee n z y m ec a nr e a c ht o4 8 1 6 2 u gd r yg i n g e r t h r o u g hr e s e a r c ho ns t a b i l i t yo fg i n g e rp r o t e a s e ，i tw a sf o u n dt h a tt h ep r o t e a s ei ng i n g e r h a dn oi n a c t i v a t i o nw h e nt h eg i n g e rw a sp r e s e r v e da t - 2 0 。cf o r6 3 d ，a n da l s of o u n dt h a t p u l p o u ss t a g ew a s ab e t t e rs t o r a g em e t h o dt h a nm a s s i v es t a g e t e m p e r a t u r eh a ds i g n i f i c a n t e f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，c r u d eg i n g e rp r o t e a s eh a dn oa c t i v i t yl o s sa t 一2 04 cf o r1 4 d ，a n d m a d e r a p i di n a c t i v a t i o na t4 ca n dr o o mt e m p e r a t u r e c u 2 + 、z n 2 + 、m 9 2 + h a da ni n h i b i t o r y e f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，i n h i b i t i n ga b i l i t yw a si ns e q u e n c eo fc u e + m 9 2 + z n 2 + n a 、m n 2 + 、 c a 2 + h a dn oe f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e f e 2 十h a dt h ea c t i v a t i o ne f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，t h e p r o t e a s ea c t i v i t yh a da n i n c r e a s eo f9 8 2 t i m e st h a nt h eb l a n k s u l f h y d r y lr e a g e n t sh a dt h e a c t i v a t i o ne f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，a c t i v i t i o na b i l i t yw a si ns e q u e n c eo fc y s t e i n e 爹 m e r c a p t o e t h a n o l d t t e d t ac a ni n c r e a s e1 2 6 2 o f t h ea c t i v i t yt h a nt h eb l a n k s o d i u m e r y t h o r b a t eh a dt h ei n h i b i t o r ye f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e t h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei nb e e ra n d y e l l o wr i c ew i n ep r o d u c t i o nw a ss t u d i e d t h r o u g hr e s e a r c ho nt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei nb e e rs a c c h a r i f i c a t i o n ，i tw a sf o u n d t h a tt h eg i n g e rp r o t e a s ec o u l db ea d d e dw h e nt h es a c c h a r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ew a s6 3 a n d w h e nt h ea d d i t i o ni s10 5 9 8 u k gm a t e r i a l ，t h ec o n t e n to fa - a m i n on i t r o g e nc a nr e a c ht o 181 4 6 m g l ，w h i c hc o u l dm e e tt h en e e do f y e a s t sg r o w t ha n dm e m b o l i s m t h r o u g hr e s e a r c h o nt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei nb e e rc l a r i f i c a t i o n ，i tw a sp r o v e dt h a tt h ec l a r i f i c a t i o n o f b e e rc a ni n c r e a s e 21 4 3 a n dt h eb e e rc o l o rc a nd e c r e a s e17 8 3 w h e nt h ea d d i t i o no f g i n g e rp r o t e a s ew a s1 3 2 u l t h r o u g hr e s e a r c ho nt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei ny e l l o w r i c ew i n ec l a r i f i c a t i o n ，i tw a sp r o v e dt h a tt h ec l a r i f i c a t i o no fy e l l o wr i c ew i n ec a ni n c r e a s e 5 6 2 w h e nt h ea d d i t i o no fg i n g e rp r o t e a s ew a s1 3 2 u la n dt h er e a c t i o nt i m ew a slh k e y w o r d ：g i n g e rp r o t e a s e ；e n z y m ea c t i v i t ya s s a y ；e x t r a c t i o n ；s t a b i l i t y ；a p p l i c a t i o n i i 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取 得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文 中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得江南 大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志 對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 簽名： 宗畸 日 期： 渺7 ? 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定： 江南大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件扣磁盤，允 許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫 進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文， 并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 簽名： 榮肖 導(dǎo)師簽名： e l 期： 刪8 f ( 第一章緒論 1 1 生姜的簡介 第一章緒論 姜( z i n g i b e ro f f i c i n a l er o s c o e ) ，別名生姜、干姜、姜皮。為多年生宿根草本【l 】， 根莖肉質(zhì)，肥厚，扁平，有芳香和辛辣味。原產(chǎn)亞洲亞熱帶，1 3 世紀(jì)傳入非洲， 中、南美洲也有引種。我國是生姜的原產(chǎn)地，在我國中部、東南部至西南部各省 區(qū)廣為栽培。 姜是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢扇鄙俚恼{(diào)味品。在我國，食姜已經(jīng)有3 0 0 0 年的歷史。本 經(jīng)載，生姜主治傷寒、頭痛，鼻塞、咳逆上氣，止嘔吐。傷寒論1 1 3 方中5 9 方有姜，以姜命名的有1 1 方。生姜揮發(fā)油【2 】有止瀉、驅(qū)風(fēng)、解熱、健胃和治療壞 血病等作用，外用可治風(fēng)濕和肌肉疼痛。姜醇 3 ( g i n g e r 0 1 ) 矛1 姜烯酚( s h o g a 0 1 ) 有抗肝 毒藥效，6 一姜烯酚的止咳作用不亞于雙氫可代因磷酸酯。姜辣素進(jìn)入人體后，能 產(chǎn)生一種抗氧化酶，它有很強(qiáng)的對付氧自由基的能力【4 】，比維生素e 還要強(qiáng)得多。 1 2 生姜蛋白酶的簡介 生姜蛋白酶是繼木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等之后發(fā)現(xiàn)的一種新的植物蛋白酶，它 在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與上述蛋白酶有很大的同源性，被認(rèn)為是木瓜蛋白酶家族的又一新成員 【6 】 1 2 1 生姜蛋白酶的研究歷史 1 9 6 8 年，m i c h i 等人首先報道了生姜蛋白酶。1 9 7 3 年，t h o m p s o n t 5 】等人從生姜根 莖中提取了生姜蛋白酶，并命名為z i n g i b a i n ，并指出它具有較高的最適溫度( 6 0 ) 等特 性，因此有較好的應(yīng)用前景。同年，i c k i k a w a 和r o s h i e 等 6 1 人用d e a e 一纖維素柱層析 對該酶進(jìn)行了純化，證明該酶是由兩個組分( g p - 一1 、g p _ 之) 構(gòu)成的，除電泳遷移率外， 兩個組分在其他方面基本相同；用s e p h a d e xg 一1 0 0 測得兩個組分的分子量均為2 2 5 0 0 ， 該酶結(jié)晶為六面體。1 9 7 8 年，o h t s u k i 、k o z o 等【7 j 人用卜1 0 0 生物膠過濾對該酶進(jìn)行純 化，得出該酶分子量為2 9 0 0 0 。19 9 5 年，o h t s u k i 8 】發(fā)表論文，報道了用d e a e - - s e p h a r o s e 和s e p h a d e xg 一7 5 純化生姜蛋白酶之后，用等電聚焦電泳可將該酶分為三個組分，并 用s d s 一聚丙烯酰胺凝膠電泳和t s k g 2 0 0 0 s w 凝膠過濾再次證明該酶分子量為2 9 0 0 0 。 同年，趙幟平桫j 等以安徽舒城的生姜為原料，采用d e a b 一纖維素d e 一5 2 和s e p h a d e x g 一7 5 純化得兩個組分，用苯酚硫酸法鑒定均為糖蛋白，并證明糖肽鍵型均為非o 型。 1 9 9 9 年，k y u n g i i o 等利用x 射線晶體衍射法研究了生姜蛋白酶2 1 a 精確度下的 晶體結(jié)構(gòu)。發(fā)表了以下重要研究成果：( 1 ) 生姜蛋白酶一i i 是一個含有2 2 1 個氨基 酸殘基的糖蛋白，在a s n 9 9 和a s n l5 6 上有兩條n 型寡糖鏈，糖基含量占8 ，并 闡明了寡糖殘基的組成及連接方式。( 2 ) 生姜蛋白酶一i i 總體結(jié)構(gòu)類似于生姜蛋白 酶等其他植物巰基蛋白酶，肽鏈折疊成兩個獨(dú)立的大小差不多的結(jié)構(gòu)域，兩者之 望壹查堂堡主堂垡笙莖 間有一道裂隙，活性中心就位于裂隙中。( 3 ) d t t 對該酶有強(qiáng)烈的激活作用。( 4 ) 結(jié) 晶為四聚體，闡明了單體間的連接方式。2 0 0 2 年，代景泉【1 1 1 以萊蕪生姜為原料，用 硫酸銨沉淀法對生姜蛋白酶進(jìn)行粗提，證明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性質(zhì)，并用 d e a e 一纖維素d e 一5 2 對該酶進(jìn)行純化，將該酶分為兩個組分。 1 2 2 生姜蛋白酶的檢測方法 為研究生姜蛋白酶，建立快速準(zhǔn)確的生姜蛋白酶酶活測定方法非常有必要。但目前， 國內(nèi)外還沒有統(tǒng)一的生姜蛋白酶酶活測定的方法。 生姜蛋白酶酶活測定，一般分兩個步驟：( 1 ) 酶與底物的酶促反應(yīng)；( 2 ) 酶促反應(yīng)后 試樣中殘余底物或酶解產(chǎn)物的測定，并據(jù)此計算酶活。 關(guān)于酶粗提物與底物的酶促反應(yīng)這一步驟，張平平等【1 3 】以1 5 j 酪蛋白為底物，在 4 0 ，p h 6 0 的條件下反應(yīng)1 0 m i n 后測定反應(yīng)產(chǎn)物酪氨酸的含量。蔡海燕等【1 4 】以2 牛 血清白蛋白為底物，在6 0 。c ，p h 6 0 的條件下反應(yīng)1 5 m i n 后測定底物牛血清蛋白含量。 p i t a y aa d u l y a t h a m 等【l5 j 以2 偶氮酪蛋白為底物，在3 8 。c ，p h 8 0 的條件下反應(yīng)3 0 m i n 后 測定酪氨酸的含量。可見由于不同研究者所設(shè)立的生姜蛋白酶酶促反應(yīng)條件不盡相同， 很難比較其效果。 關(guān)于酶促反應(yīng)后試樣中殘余底物或酶解產(chǎn)物的測定，唐曉珍、蔡海燕等【1 4 , 1 6 】學(xué)者通 過考馬斯亮藍(lán)法測定底物蛋白( 酪蛋白或牛血清) 含量的變化。測定酶促反應(yīng)后殘余的蛋 白，試劑配制困難，操作復(fù)雜，重復(fù)性較差。郝貴霞、張平平等【1 2 , 1 3 】通過茚三酮或者是 f o l i n - 酚對產(chǎn)物酪氨酸進(jìn)行染色，然后分別測定5 4 5 n m 和6 6 0 n m 下吸光值來測定酪氨酸 的含量。這一方法可以去除核酸以及雜蛋白對酪氨酸含量測定的影響，但是操作復(fù)雜， 不符合快速測定的要求。k o z oo h t s u k i 等【8 】直接測定酶促反應(yīng)產(chǎn)物酪氨酸的紫外吸收來 測定酪氨酸的含量。這種測定方法簡便、靈敏，可以較為快速地測定生姜蛋白酶的酶活。 鑒于目前生姜蛋白酶酶活測定方法尚不統(tǒng)一，有必要對酶促反應(yīng)條件開展相關(guān)研 究，建立一種簡便的測定方法。 1 2 3 生姜蛋白酶的提取方法 酶的提取方法有很多種，而有效的提取過程需要綜合運(yùn)用多種方法。為了最大限度 的提高酶的產(chǎn)量，將人力、材料和設(shè)備的成本降低到最低程度，酶的提取步驟應(yīng)該盡量 簡單。分離步驟越多，酶的收率越低，材料及動力消耗越多，成本也越高。在符合質(zhì)量 的前提下，應(yīng)盡可能的采取簡單的提純方法。 目前工業(yè)上廣泛采用的酶的提取方法主要有沉淀法和超濾法兩大類。 ( 1 ) 沉淀法 沉淀法是比較傳統(tǒng)的分離純化蛋白質(zhì)的方法，目前仍在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)廣泛使用，是提取 生姜蛋白酶的主要方法。該法所需設(shè)備簡單、操作方便，在生姜蛋白酶純化的初期，可 以迅速減少樣品體積，起到濃縮的作用，便于后續(xù)的純化，降低純化成本；還可以盡快 將目的酶與雜質(zhì)分開，提高其穩(wěn)定性；通過該方法，生姜蛋白酶的收率比較高。沉淀法 2 第一章緒論 大都需要首先制備丙酮粉，以丙酮粉作為酶的來源，其制作方法為【1 3 】：將黃姜洗凈、切 碎，加上5 倍( w v ) 在2 0 下預(yù)冷的丙酮，用組織搗碎機(jī)搗碎，放入布氏漏斗抽濾，再 用適量的冷丙酮抽濾洗滌3 次，將丙酮粉放入通風(fēng)櫥中干燥至無丙酮?dú)馕?，然后用篩子 篩去粗纖維之類，裝入塑料袋中真空密封，放入2 0 下冰箱中存放備用。 通常采用的沉淀劑主要是有機(jī)溶劑如丙酮和乙醇，鹽類如硫酸銨，以及單寧等。 目前國內(nèi)研究中采用較多的沉淀法按所用沉淀劑的不同分為3 種。 有機(jī)溶劑沉淀法：張平平在制取丙酮粉后，用丙酮沉淀生姜蛋白酶，其工藝為【1 3 】： 取丙酮粉，用p h 5 、6 的緩沖液溶解，離心后取上清液，加入1 2 倍體積的丙酮，再離 心取沉淀，冷凍干燥。唐曉珍i l7 j 則直接用無水乙醇從姜汁中沉淀生姜蛋白酶，其工藝為： 用無水乙醇( - 2 0 。c ) 與姜汁配成6 0 的乙醇姜汁溶液混勻后，4 放置3 0 m i n ，。離心取 沉淀，真空中除去乙醇并冷凍干燥，即得粗酶粉。 硫酸銨沉淀法：張平平【1 3 】通過實(shí)驗(yàn)確定了如下提取工藝：取經(jīng)丙酮沉淀獲得的粗酶 粉，加入固體硫酸銨至4 0 飽和度，離心后取上清液，加入硫酸銨至6 0 0 0 的飽和度，再 離心取沉淀，透析除鹽即可獲得生姜蛋白酶。而代景泉【墻】確定的工藝則與之略有不同： 取丙酮粉用2 0 倍( w v ) 0 1 m o l l ，p h 8 0 的磷酸緩沖液提取，上清液加硫酸銨至4 0 飽和 度，其間控制p h 7 0 ，離心棄去沉淀，上清液繼續(xù)添加硫酸銨至8 0 飽和度，離心取 沉淀，透析除鹽后冷凍干燥即可。 單寧沉淀法：唐曉珍【1 6 j 用單寧沉淀法提取生姜蛋白酶，其方法為：取丙酮粉，用 p h6 0 的緩沖液溶解并浸提3 5 m i n ，然后離心，于上清液中加入單寧至0 1 2 的濃度， 離心取沉淀，冷凍干燥即可。 ( 2 ) 超濾法 2 0 0 1 年，唐曉珍【1 9 , 3 7 】首先報道了采用超濾法提取生姜蛋白酶，基本工藝如下：生姜 洗凈切碎一榨汁一離心除去淀粉抽濾一超濾取濃汁一真空冷凍干燥保存。唐曉 珍通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：操作壓力為0 0 6 m p a 時，酶活力和膜通量最好；膜通量隨操作溫 度、姜汁流速的提高而增加，隨姜汁濃度、操作時間的增加而降低。 沉淀法仍是當(dāng)今工業(yè)中常用的酶提取方法，用沉淀法提取生姜蛋白酶，步驟較為簡 單，有利于減小提取時間對酶活造成的損失。但制備丙酮粉操作繁瑣，消耗大量丙酮， 成本高，效率低；各種沉淀劑對生姜蛋白酶的酶活也會造成損失。超濾法所有操作均在 常溫下進(jìn)行，特別適用于對熱敏感物質(zhì)的處理，且無需任何化學(xué)試劑，具有操作簡單， 效率高，成本低，無污染的優(yōu)點(diǎn)。超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑。 對于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到1 0 - 5 0 的蛋白濃度，如果將超濾所得的濃汁直接進(jìn)行 冷凍干燥，需耗費(fèi)大量能量，采用其它方法對濃汁進(jìn)行濃縮處理，也增加了成本與工作 量，不利于生姜蛋白酶的快速提取。另外，濃差極化現(xiàn)象也是超濾技術(shù)急需解決的重 要課題之一。 如何用最簡便的提取方法來最大限度的提高酶的產(chǎn)量對于生姜蛋白酶的廣泛的應(yīng) 用具有重要的意義。 3 江南火學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 4 生姜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì) 由于不同的學(xué)者在提取生姜蛋白酶時采用的生姜品種不同，提取純化方法不同，純 化的程度不同，因此對生姜蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究也沒有形成一致的結(jié)論。 張平平【l3 】等研究得到生姜蛋白酶的主要酶學(xué)性質(zhì)是：以酪蛋白為底物時，其最適作 用p h 值為6 0 ，與郝桂霞報導(dǎo)的一致；最適溫度為6 0 。c ；3 0 下保溫3 0m i n ，酶活力 不變；高于7 2 酶活力迅速下降，與郝柱霞報導(dǎo)的在9 0 。c 仍有較高的活性不一致。溫 度升高，半衰期顯著減短，在6 0 、7 0 、8 0 時，該酶的半衰期分別為1 7 m i n 、1 2 m i n 和3 m i n 。d t t 、e d t a 對酶具有激活作用；對氯汞苯甲酸、氯化鋅、硫酸銅等對酶有抑 制作用；氯化鈣、硫酸鎂、三氯化鋁對酶活影響不大。張平平等還研究了幾種食品試劑 對酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)亞硫酸氫鈉、氯化鈉對酶活力有抑制作用，蔗糖對酶活力有促進(jìn) 作用。a d u l y a t h a m 1 5 j 研究表明，生姜蛋白酶在5 存放4 d ，其活力損失8 0 。粗酶的半 衰期從5 。c 的2 4 - 0 1 6 d 降至3 0 的1 7 m i n 。0 2 ( w v ) 的v c 能使其穩(wěn)定，在5 。c 存放1 4 d 酶活力沒有損失。在6 0 時，生姜蛋白酶的半衰期是2 3 m i n ，添加o 2 ( w v ) v c 后變 成2 4 m i n 。當(dāng)溫度低于5 0 時，生姜蛋白酶完全可以被v c 穩(wěn)定。 1 2 5 生姜蛋白酶的應(yīng)用 生姜蛋白酶在食品加工中的主要應(yīng)用是肉類嫩化，果蔬汁、啤酒、葡萄酒的澄清， 動、植物蛋白的分解，焙烤食品中面團(tuán)調(diào)節(jié)劑，乳制品凝固劑，化妝品添加劑等。 ( 1 ) 生姜蛋白酶在肉類嫩化中的應(yīng)用 2 0 - 2 2 生姜蛋白酶是一種巰基醇蛋白酶，可分解膠原蛋白和肌動球蛋白，從而使肉嫩化， 且對膠原蛋白的分解能力要比對肌動球蛋白的分解能力高出好幾倍。該酶可降解肌原纖 維，導(dǎo)致肌原纖維的斷裂從而提高肉類的嫩度。專家們通過采用生姜蛋白酶作用于雞肉、 牛肉、豬肉等，證明了生姜蛋白酶對肉的嫩化作用。有專家通過對酶的用量、p h 、處理 溫度、處理時間的測試，確定生姜蛋白酶對牛肉嫩化的最佳工藝條件是：酶用量為0 0 6 ， p h 為7 o ，處理溫度為5 0 ，處理時間為2 h ；可使牛肉嫩度達(dá)到最佳使用狀態(tài)，顏色 較好，柔嫩多汁且具有良好的彈性。還有專家研究生姜蛋白酶和生姜汁對豬肉的嫩化效 果，通過測定豬肉的最大剪切力，得到的生姜蛋白酶和生姜汁對豬肉的嫩化效果都非常 顯著，生姜蛋白酶的最佳用量為0 0 1 ，最佳p h 為7 o ，最佳預(yù)處理溫度為3 0 ；生 姜汁對肉嫩化的作用是生姜汁中生姜蛋白酶的作用結(jié)果。 ( 2 ) 生姜蛋白酶在酒類澄清中的應(yīng)用 2 3 2 5 】 唐曉珍研究表明，生姜蛋白酶能將酒中的大分子蛋白質(zhì)分解為小分子多肽、氨基酸 等，從而顯著提高啤酒和紅葡萄酒的澄清度。對紅葡萄酒的最適加入量為0 0 5 m g l ，最 佳預(yù)處理溫度為2 0 3 0 。對啤酒的最適加入量為5 m g l ，最佳預(yù)處理溫度為6 0 。在 酶制劑的用量上，生姜蛋白酶的用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于木瓜蛋白酶的用量，具有更高的商業(yè)價值。 唐曉珍所提出的啤酒的最佳預(yù)處理溫度為6 0 這一觀點(diǎn)與啤酒儲存溫度相差太大， 4 第一蘋緒論 生姜蛋白酶能否在啤酒儲存溫度下( o ) 提高啤酒的澄清度還有待進(jìn)一步研究。 p ) 生姜蛋白酶在乳制品中的應(yīng)用 2 6 - 2 9 】 姜汁具有凝乳的作用，我國傳統(tǒng)食品“姜撞奶”采用姜汁作為凝乳劑，其中的凝乳因 子已被證明是生姜蛋白酶。其凝乳的機(jī)理現(xiàn)已證明是生姜蛋白酶將乳中酪蛋白膠粒外圍 的k c a s e i n 及1 3 - c a s e i n 在c a 2 + 參與下形成網(wǎng)狀的凝膠體。采用正交試驗(yàn)得到制作姜汁 凝乳的優(yōu)選工藝，即姜汁添加量1 0 ，c a c l 2 添加量0 0 5 ，凝乳溫度3 0 3 5 ，p h 為5 0 ，得到了口感和風(fēng)味都較好的產(chǎn)品。生姜蛋白酶的凝乳性質(zhì)使之有望成為奶酪生 產(chǎn)中小牛皺胃酶的替代品，以緩解日益緊張的小牛皺胃酶供應(yīng)。 1 2 6 生姜蛋白酶的市場前景及有待研究的問題 ( 1 ) 市場前景 將生姜蛋白酶開發(fā)為成熟的酒類澄清劑、牛奶凝乳劑、肉質(zhì)嫩化劑等新型環(huán)保安全 的食品添加劑，勢必為生姜深加工帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。生姜蛋白酶與木瓜 蛋白酶既屬“同族”，應(yīng)具有木瓜蛋白酶的作用，因此我們可以考慮將其代替木瓜蛋白酶 應(yīng)用在各種領(lǐng)域，拓寬應(yīng)用范圍，提高價值。總之，生姜蛋白酶在工業(yè)上有廣闊的應(yīng)用 前景。 ( 2 ) 有待研究的問題 就目前來看，對于生姜蛋白酶的研究進(jìn)展并不快，一些作用機(jī)理還存在爭議，工業(yè) 化生產(chǎn)程度還不夠。 ( 1 ) 需建立一種簡便、有效、統(tǒng)一的酶活測定方法 目前不同學(xué)者所用的生姜蛋白酶檢測方法各不相同，無法對生姜蛋白酶的研究結(jié)果 進(jìn)行比較和系統(tǒng)的總結(jié)，因此建立一種簡便、有效、統(tǒng)一的酶活測定方法是極其必要的。 ( 2 ) 急需工業(yè)化提取生姜蛋白酶的工藝技術(shù) 雖然人們已經(jīng)試驗(yàn)利用硫酸銨、丙酮、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、d e a e 一纖 維素、d e a e _ 一瓊脂糖、電泳等層析、分離技術(shù)對生姜蛋白酶進(jìn)行了分離純化研究。但 這些技術(shù)方法存在成本高、產(chǎn)量低，操作繁瑣等缺點(diǎn)，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。要大規(guī)模的 利用生姜蛋白酶，應(yīng)在簡化生姜蛋白酶的工業(yè)化提取方法、降低提取成本等方面進(jìn)行研 究。 ( 3 ) 生姜蛋白酶在酒類澄清、麥汁制備等方面的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究 國內(nèi)外有對木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶在酒類澄清方面的研究和報道， 生姜蛋白酶對酒類澄清方面的應(yīng)用研究較少，并且主要是對啤酒與葡萄酒的研究，+ 生姜 蛋白酶在黃酒澄清中的應(yīng)用研究目前尚未有報道。 在麥芽糖化過程中加入生姜蛋白酶，能否有效地解決因麥芽溶解不好或輔料量大 ( 如超過4 0 ) 時麥汁瞞基氮含量的不足的問題也有待進(jìn)一步研究。 ( 4 ) 生姜蛋白酶的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步的研究 由于溫度、金屬離子、抗氧化劑、激活劑等因素對生姜蛋白酶穩(wěn)定性的影響很大， 5 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 限制其在工業(yè)上推廣應(yīng)用，如何避免上述因素對生姜蛋白酶酶活的影響，提高生姜蛋白 酶的穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步研究。 本研究的目的就是探討解決上述問題的方法。這些問題的解決，對于穩(wěn)定生姜種植 面積，保證生姜產(chǎn)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展，擴(kuò)大生姜資源的利用途徑，調(diào)節(jié)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)均具 有重要意義。可以改變長期以來我國植物蛋白酶資源長期以來主要依賴于木瓜、菠蘿等 少數(shù)熱帶水果資源的現(xiàn)狀。對于進(jìn)一步豐富生姜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)和以生姜為原料開發(fā) 新型的營養(yǎng)、保健制品均具有積極的作用或指導(dǎo)意義。 1 3 主要研究內(nèi)容 1 生姜蛋白酶檢測方法的研究 2 生姜蛋白酶提取的初步研究 3 生姜蛋白酶穩(wěn)定性的研究 4 生姜蛋白酶應(yīng)用的初步研究 6 第二章材料與方法 2 1 材料 2 1 1 實(shí)驗(yàn)儀器 第二章材料與方法 7 5 2 n 型紫外可見光分光光度計 d k z - 2 型水浴鍋 s h b - 1 1 1 型循環(huán)水式多用真空泵 生姜研碎用豆?jié){機(jī) 垂直板電泳儀 u v p 凝膠成像系統(tǒng) 3 2 0 - sp h 計 m a 4 0 快速水分測定儀 2 1 2 實(shí)驗(yàn)試劑與原料 上海精研 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 上海預(yù)康科教儀器設(shè)備有限公司 市售 北京六一廠 英國u v p 公司 m e t t l e rt o l e d o 公司 s a r t o r i u s 公司 酪蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，三氯乙酸，檸檬酸，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀， 氫氧化鈉，酪氨酸，靠馬斯亮藍(lán)g 2 5 0 ，茚三酮，碘酸鉀，甘氨酸，硫酸錳，硫酸鋅， 硫酸亞鐵，硫酸鎂，e d t a ，異抗壞血酸鈉，巰基乙醇，d t t ，半胱氨酸。以上試劑均 為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大麥芽、生姜，市售。 2 2 方法 2 2 1 生姜蛋白酶酶粉的制備方法 生姜：p h 7 0 磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀緩沖液( 0 1 m o v l ) = 1 ：4 ，用豆?jié){機(jī)打成漿， 在4 。c 下放置1 h ，使緩沖液充分提取生姜中的蛋白酶，抽濾，棄雜質(zhì)，所得清液即是生 姜蛋白酶的抽提液。向抽提液中緩慢加入1 7 倍( v v ) 的工業(yè)酒精( 9 5 ) 沉淀酶蛋白，抽濾 干燥后所得沉淀即為粗酶。 2 2 2 酶活測定方法 生姜蛋白酶活力的定義：在5 0 。c 、p h 6 0 條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生l l , t g 酪氨 酸，定義為1 個蛋白酶活力單位。 本論文最終確定的酶活測定的基本方法：取試管3 支，編號1 、2 、3 ，每管內(nèi)加入 1 酪蛋白l m l ，置于5 0 c 水浴中預(yù)熱2 m i n ，再加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酶液l m l ( 酪蛋白溶 液與酶液均以0 0 5 m o l lp h 6 0 的檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液配制) ，精確保溫反應(yīng)4 m i n 7 堊墮盔蘭嬰主堂篁絲奎 后，立即在每管中加入0 4 m o l l 三氯乙酸2 m l ，以終止反應(yīng)，待殘余蛋白質(zhì)沉淀后過 濾，濾液在2 7 5 n m 下測定吸光度值。 空白試驗(yàn)也取試管3 支，編號( 1 ) 、( 2 ) 、( 3 ) ，測定方法同上，唯在反應(yīng)之前要先加 0 4 m o l l 三氯乙酸2 m l ，使酶失活。 樣品的平均o d 值減去空白的平均o d 值得到凈o d 值。 由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，查找凈o d 值所對應(yīng)的酪氨酸的含量，按以下公式計算酶的比 活力( u m g 蛋白) ： 生姜蛋白酶比酶活( u m g 蛋白) = 半羆 式中：a 一測得o d 值后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的酪氨酸的含量( p g m l ) ； t 一酶促反應(yīng)時間，定為4 m i n ； v 一反應(yīng)液的體積，4 m l ； b 一測得o d 值后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的蛋白含量( 肛咖l ) ； v 一酶促反應(yīng)所用酶液的體積，為l m l ； 1 0 0 0 1 0 0 0 1 x g m g 為便于研究生姜蛋白酶的提取效果，也有必要計算每克干姜含有的酶活力( u g - - 干姜) 。 計算公式如下： 每克干姜含有的酶活力( u 儋干姜) = 壘罟n 壬l _ 式中：a 一測得o d 值后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的酪氨酸的含量( f g m l ) ； t 一酶促反應(yīng)時間，定為4 m i n ； v 一反應(yīng)液的體積，4 m l ； w 一生姜水份百分含量( ) n 一稀釋倍數(shù)( 1 儋) ；計算公式： 、。稀釋濕酶粉所用緩沖液的體積得到的濕酶粉的質(zhì)量 酶促反應(yīng)所用酶液的體積所用濕酶粉的質(zhì)量 0 8 0 0 0 7 o 6 0 0 j 型0 5 0 0 趟0 4 0 0 玉。o o 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 4 06 08 01 0 01 2 0 酪氨酸含量( b tg m l ) 圖2 1 酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 f i g 2 - 1s t a n d a r dc u r v eo ft y r o s i n e 8 第二章材料與方法 2 2 3 檢驗(yàn)酶活測定方法精密度的試驗(yàn)方法 。由2 2 1 所述方法制備酶粉，按照2 2 2 所述的酶活測定方法平行測定5 次酶活，計 算標(biāo)準(zhǔn)偏差s 和r s d 值，考察所確定酶活測定方法的精密度。 2 2 4 蛋白質(zhì)含量測定方法 考馬斯亮藍(lán)法 3 0 l 。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2 2 。 o2 04 06 08 01 牛血清蛋白濃度( 1 ig m e ) 圖2 2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 f i g 2 2s t a n d a r dc u r v eo fb o v i n es e r u ma l b u m i n 2 2 5s d s p a g e 電泳方法 見文獻(xiàn)【3 1 】。 2 2 6 酶穩(wěn)定性的研究方法 ( 1 ) 生姜儲存時間與儲存方式對生姜蛋白酶穩(wěn)定性影響的研究方法 將生姜洗凈，切碎，打成漿，2 0 9 每份分裝，置于- 2 0 。c 冰箱中保存。將生姜切成塊， 2 0 9 每份分裝后置于- 2 0 。c 冰箱中保存。每隔7 d 測定一次酶活，考察儲存時間及儲存方 式對生姜蛋白酶酶活的影響。酶提取方法及酶活檢測方法按2 2 1 和2 2 2 所述。 ( 2 ) 溫度對生姜蛋白酶穩(wěn)定性影響的研究方法 將酶粉存放在室溫、4 。c 、2 0 下，每隔2 d 測定一次酶活，考察儲存溫度對生姜 蛋白酶酶活的影響。 ( 3 ) 金屬離子對生姜蛋白酶穩(wěn)定性影響的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入m n s 0 4 h 2 0 ( f e s 0 4 7 h 2 0 、c a c l 、m g s 0 4 、z n 7 h 2 0 、 n a 2 s 0 4 ) ，使m n 2 + ( f e 2 + 、c a + 、m 9 2 十、z n z + 、n a + ) 濃度分別為o 、o 5 、1 、2 、5 m m o l l ， 混勻后按2 2 2 所述測定酶活，并計算抑制百分率。 9 咖 啪 鯽 珊 瑚 咖 l 0 o 0 o o 趔越裝登 堊塑奎蘭堡主蘭篁笙莖 金屬離子對蘸活性的抑制百分率- 魂= 皇壑型絲墅筆驀鑫簍翥鬟妻掣。 ( 4 ) 巰基試劑對生姜蛋白酶穩(wěn)定性影響的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入半胱氨酸( 巰基乙醇、d t t ) ，使巰基試劑濃度分別為0 、 1 0 、2 0 、3 0 、4 0 m m o l l ，混勻后按2 2 2 所述測定酶活。 ( 5 ) 螯合劑對生姜蛋白酶酶活影響的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入e d t a ，使e d t a 濃度為0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 m m o l l ，混 勻后按2 2 2 所述測定酶活。 ( 6 ) 抗氧化劑對生姜蛋白酶穩(wěn)定性影響的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入異抗壞血酸鈉，使異抗壞血酸鈉濃度為0 、1 、3 、5 、1 0 、 2 0 m m o l l ，混勻后按2 2 2 所述測定酶活。 2 2 7 生姜蛋白酶應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法 ( 1 ) 生姜蛋白酶在麥汁制備中添加時間的研究方法 以1 ：5 的料水比，其中輔料大米粉的用量為4 0 ，高溫淀粉酶用量為0 2 m l k g 大 米粉，按以下雙醪浸出糖化法糖化曲線【3 2 1 制作麥汁，分別在糖化溫度為3 7 c 、5 0 。c 、 6 3 c 、7 8 c 時加入粗酶粉，每千克原料中粗酶粉的添加量為2 1 1 9 6 u ，考察生姜蛋白酶 對麥汁中0 【氨基氮含量的影響，確定最佳添加時間。 圖2 3 糖化曲線 f i g 2 3m a s h i n gc u r v e ( 2 ) 生姜蛋白酶在麥汁制備中添加量的研究方法 在糖化溫度為6 3 。c 時加入粗酶粉，添加量為0 、2 6 5 0 、5 2 9 9 、1 0 5 9 8 、1 5 8 9 7 、 2 1 1 9 6 u k g 原料。按圖2 3 所示的糖化曲線制作麥汁，測定麥汁中的o 【氨基氮含量，確 定生姜蛋白酶粗酶粉的添加量。 1 0 墨三重型型皇查鎏 ( 3 ) a 氨基氮含量測定方法 q 一氨基氮含量測定方法采用茚三酮比色法【3 3 1 。 ( 4 ) 生姜蛋白酶在啤酒澄清中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法 將主發(fā)酵完的啤酒過濾，在其中添加粗酶粉，添加量分別為0 1 3 2 4 9 1 u l ，于0 。c 溫度下存放。在第0 、2 、4 、6 、8 、1 0 d 測定啤酒的澄清度、蛋白含量、色度以及其它 感官指標(biāo)，確定生姜蛋白酶的最佳添加量。 啤酒澄清度的測定方法 2 4 】：用1 0n u l l 比色皿在6 6 0 n m 下測定其透光度。以t 6 6 0 表 示啤酒的澄清度。 蛋白含量測定方法：考馬斯亮藍(lán)法。 啤酒色度的測定方法：見g b t4 9 2 8 2 0 0 8 。 s = a 4 3 0 2 5 x n 式中：s 一啤酒的色度，單位為e b c 。 3 0 一試樣在波長為4 3 0 n m ，1 0 m m 玻璃比色皿測得的吸光度。 2 5 一換算成標(biāo)準(zhǔn)比色皿的厚度，單位為i i l l n 。 n 一稀釋倍數(shù)。 ( 5 ) 生姜蛋白酶在黃酒澄清中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法 將市售散裝黃酒用濾紙過濾，放入5 0 水浴中預(yù)熱5 m i n ，然后在其中添加粗酶粉， 添加量分別為0 1 3 2 4 9 1 u l ，分別在0 m i n 、1 5 m i n 、3 0 m i n 、l h 、2 h 、3 h 時取樣放在4 溫度下保存1 d ，然后測定黃酒的澄清度以及黃酒中的蛋白含量，確定生姜蛋白酶的用量 以及作用時間。 黃酒澄清度的測定方法 3 4 】：用1 0i t i i l l 比色杯在8