（分析化學(xué)專業(yè)論文）基于核酸探針的汞離子和鉛離子檢測.pdf

r 一 l 、 ， 產(chǎn) ， l 、 j l 鼉 ：u 湖南大學(xué) 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進(jìn)行研究所取得的 研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或 集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均 己在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。 作者簽名： 黼弘 r 期： 9 , , o t t 年6 月同 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保 留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借 閱。本人授權(quán)湖南大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 本學(xué)位論文屬于 l 、保密口，在年解密后適用本授權(quán)書。 2 、不保密團(tuán)。 ( 請在以上相應(yīng)方框內(nèi)打“、j ”) 同期：2 0 1 1 年6 月2 同 日期： 2 0 11 年6 月2 日 秒認(rèn)夠弋西韶分銻i、 疋礪彳函拘 。r心夕 名名奎暨 剖雕 作導(dǎo) 一 基于核酸探針的汞離子和鉛離子檢測 摘要 目前，重金屬離子污染已對人類生存環(huán)境造成了極大威脅。許多有毒重金屬 離子難以被微生物降解，可以通過生物鏈的蓄積進(jìn)入人體，嚴(yán)重威脅著人類的身 體健康及生命安全。因此，發(fā)展簡單、快捷、靈敏、實用的重金屬離子檢測方法 對控制環(huán)境污染、保護(hù)人類健康都具有重要的意義。核酸探針具有實時、快捷、 穩(wěn)定、直觀的超靈敏等分析檢測的優(yōu)點，使其在醫(yī)藥、環(huán)境、食品等眾多領(lǐng)域的 重金屬分析檢測中，具有極其廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。因此，在本論文的研 究中，我們構(gòu)建了以下三種基于核酸探針的汞離子和鉛離子的檢測方法： ( 1 ) 基于環(huán)糊精芘協(xié)同作用熒光檢測汞離子( h 9 2 + ) 。實驗設(shè)計了一條莖部含 有錯配胸腺嘧啶( t ) 堿基對，兩端分別標(biāo)記芘分子的d n a 探針。在h 9 2 + 存在下， 探針分子通過形成t h g ”t 結(jié)構(gòu)以及丫環(huán)糊精的協(xié)同作用，產(chǎn)生芘分子的二聚體熒 光信號。在優(yōu)化的實驗條件下，傳感體系的響應(yīng)信號在h 9 2 + 濃度為0 5l t m 至3 0l x m 的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為o 3 “m 。此方法具有良好的選擇性，同時 基于芘分子二聚體熒光長壽命的特點，利用時間分辨技術(shù)，有望應(yīng)用于復(fù)雜生物 樣品h 矛+ 檢測。 ( 2 ) 基于脫氧核酶( d n a z y m e ) 免標(biāo)記比色檢測鉛離子( p b 2 + ) 。實驗設(shè)計了 條包含d n a z y m e 以及富烏嘌呤堿基( g ) 鏈的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)的核酸探針，通過p b 2 + 作用后，將d n a z y m e 中底物鏈釋放出來，形成g 四鏈體引發(fā)顯色反應(yīng)，通過吸 收信號的響應(yīng)來達(dá)到檢測p b 2 + 的目的。體系的響應(yīng)信號在p b 2 + 濃度為5n m 至1 0 0 n m 的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限可以達(dá)到3n m 。此外，該方法還具有良 好的選擇性。 ( 3 ) 基于脫氧核酶免標(biāo)記熒光檢測鉛離子。利用d n a z y m e n - 以在p b 2 + 的作用下， 發(fā)生特異性的斷裂以及s y b rg r e e ni ( s g ) 與雙鏈d n a 雜交體間的嵌入作用，使 得互補(bǔ)配對的雙鏈與單鏈d n a 產(chǎn)生不同的熒光信號，對p b 2 + 進(jìn)行檢測。體系的響 應(yīng)信號在p b 2 + 濃度為1i t m 至8l x m 的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限可以達(dá)到 0 6l x m 。 關(guān)鍵詞：核酸探針；汞離子；鉛離子；熒光；吸收 、 碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t h e a v ym e t a li o n sa r eo n ek i n do fm a i np o l l u t a n t si nt h ee n v i r o n m e n t ，w h i c hh a v e c a u s e dg r e a tt h r e a tt oh u m a nl i v i n gc o n d i t i o n s h e a v ym e t a li o n si nt h ee n v i r o n m e n t a r ed i f f i c u l tt od e g r a d e ，w h i c hc a nb ea c c u m u l a t e di n t ot h eh u m a nb o d yt h r o u g ht h e f o o dc h a i n ，l e a d i n gas e r i o u st h r e a tt op e o p l e sh e a l t ha n dl i f e t h e r e f o r e ，i ti so fg r e a t s i g n i f i c a n c et oe s t a b l i s has i m p l e ，f a s t ，s e n s i t i v em e t h o dt od e t e c tt h e ma st ot h e c o n t r o lo fe n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n dt h ep r o t e c t i o no fh u m a nh e a l t h p r o b e sb a s e d o nn u c l e i ca c i d s ( d n ap r o b e ) w i t ha d v a n t a g e so f r e a l - t i m e ，q u i c k ，s t a b l e ，s e l e c t i v ea n d v i s u a li n s p e c t i o nm a k ei t sb r o a ds p a c et ou s e di np h a r m a c e u t i c a l ，e n v i r o n m e n t ，f o o d a n dm e t a la r e a s i nt h i sr e s e a r c hp a p e r ，w ec o n s t r u c tt h r e ed n ap r o b e st od e t e c t m e r c u r ya n dl e a di o n s ，t h ed e t a i l sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： ( 1 ) ap r o b eb a s e d o nt h e t h y m i n e h 9 2 + - t h y m i n e ( t h 9 2 + t ) c o o r d i n a t i o n c h e m i s t r y a n dt h ei n c l u s i o ni n t e r a c t i o n o f 丫一c y c l o d e x t r i n w a s d e v e l o p e d a b i s p y r e n e - l a b e l e dt h y m i n e r i c hd n a s t r a n dw a su s e da st h ed e t e c t i o np r o b e i nt h e p r e s e n c eo fh g 計，t h es t e m c l o s e s h a p e dd n as t r a n dc a nb ef o r m e du n d e rt h e c o o p e r a t i o no f1 - c y c l o d e x t r i na n dp r e d o m i n a n t l ye m i tt h ee x c i m e rf l u o r e s c e n c ei d e a l l y w i t ht h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h es y s t e me x h i b i t sad y n a m i cr e s p o n s er a n g ef o rh g z 十 f r o mo 5t o3p mw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 3 l x m t h i ss t r a t e g ya f f o r d e de x q u i s i t e s e l e c t i v i t yf o rh g 什a g a i n s to t h e re n v i r o n m e n t a l l yr e l a t e dm e t a li o n s a tt h es a m et i m e ， p y r e n e e x e i m e rh a sal o n g e rf l u o r e s c e n c el i f e t i m e ，c o m b i n e dw i t hl i f e t i m e - b a s e d m e a s u r e m e n t s ，t h ep r o b eh o l dp o t e n t i a la p p l i e di nc o m p l e xb i o l o g i c a ls a m p l e s ( 2 ) ap r o b eb a s e do nl a b e l f r e ed n a z y m ec o l o r i m e t r i cm o l e c u l a rs w i t c hf o r d e t e c t i o no fp b 計w a sd e v e l o p e d t h es y s t e mi n c l u d i n gd n a z y m ea n dg u a n i n e ( g ) 一r i c h d n as t r a n d i nt h ep r e s e n c eo fp b 2 + ，t h es u b s t r a t es t r a n d sw a sr e l e a s e dt os o l u t i o na n d f o r m e dg - q u a d r u p l e x ，r e s u l t i n ga b s o r b a n c ec h a n g et od e t e c tp b 計t h es y s t e me x h i b i t s ad y n a m i cr e s p o n s er a n g ef o rp b 什f r o m5t o10 0n mw i t had e t e c t i o nl i m i to f3n m i n a d d i t i o n ，t h es e l e c t i v i t yo ft h es e n s o rf o rp b z + a g a i n s to t h e re n v i r o n m e n t a l l yr e l a t e d m e t a li o n si so u t s t a n d i n g ( 3 ) ap r o b eb a s e do nl a b e l f r e ed n a z y m ef l u o r e s c i n gm o l e c u l a r s w i t c hf o r d e t e c t i o no fp b “w a sd e v e l o p e d i nt h ep r e s e n c eo fp b ”，d n a z y m ew a sf r a c t u r e ，a n d t h eo b v i o u sf l u o r e s c e n tc h a n g eo ft h es y b rg r e e ni ( s g ) ，a f t e rb i n d i n gt od o u b l es t r a n d o rs i n g l es t r a n dd n aw a so b s e r v e d t h es y s t e me x h i b i t sad y n a m i cr e s p o n s er a n g ef o r i i i ， i v ， 碩士學(xué)位論文 目錄 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明和版權(quán)使用授權(quán)巷i 摘要i i a b s t r a c t ：i i i 第1 章緒論1 1 1 重金屬離子污染1 1 1 1 重金屬離子污染分類2 1 1 2 重金屬離子污染現(xiàn)狀。3 1 1 3 重金屬離子檢測的方法及意義3 1 2 核酸探針簡介4 1 3 用于p b 2 + 、h 9 2 + 檢測的核酸探針設(shè)計6 1 3 1 基于胸腺嘧啶h 9 2 + 熒光核酸探針設(shè)計6 1 3 2 基于g 四鏈體比色核酸探針設(shè)計9 1 3 3 基于金屬離子特異性d n a z y m e 核酸探針設(shè)計9 1 4 本論文的選題依據(jù)及研究內(nèi)容1 0 第2 章基于環(huán)糊精芘協(xié)同作用熒光檢測汞離子1 1 2 1 引言1 1 2 2 實驗部分1 2 2 2 1 主要試劑和儀器1 2 2 2 2 溶液中h 9 2 + 檢測1 3 2 3 結(jié)果與討論1 3 2 3 1 汞離子對芘二聚體熒光影響1 3 2 3 2 設(shè)計機(jī)理1 4 2 3 3 實驗條件優(yōu)化1 6 2 3 4 響應(yīng)曲線1 9 2 3 5 選擇性2 0 2 3 6 檢測應(yīng)用2 0 2 4 小結(jié)2 1 第3 章基于脫氧核酶免標(biāo)記比色檢測鉛離子2 2 3 1 引言2 2 3 2 實驗部分2 3 3 2 1 主要試劑：2 3 v ， 4 2 1 主要試劑3 3 4 2 2 主要儀器3 3 4 2 3 光譜測量3 4 4 3 結(jié)果與討論3 4 4 3 1 設(shè)計機(jī)理3 4 4 3 2 溫度影響3 5 4 3 3 鹽濃度影響3 6 4 3 4 響應(yīng)曲線3 7 4 3 5 選擇性3 8 4 4 小結(jié)3 8 結(jié)論4 0 參考文獻(xiàn)4 l 附 錄攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文4 9 致訪 5 0 v i 碩士學(xué)位論文 第1 章緒論 隨著科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們的生活水平有了很大的提高。與此同時，由于對自 然資源的過度開發(fā)及利用，人類為此付出了慘重的代價。礦業(yè)的開發(fā)以及工業(yè)“三廢”、 機(jī)動車尾氣的排放、污水灌溉和農(nóng)藥、除草劑等的使用，嚴(yán)重地污染了大氣、土壤和水 質(zhì)。近年來，“砷毒”、“血鉛”、“鎘米”等事件的頻頻發(fā)生，也讓重金屬污染成為最受關(guān) 注的公共事件之一。通常環(huán)境介質(zhì)中的重金屬離子有其自然存在的量或濃度，稱為本底 值，一般情況下本底值是比較低的，不會對人體及環(huán)境產(chǎn)生任何影響。但是近年來受人 類活動影響，重金屬在環(huán)境介質(zhì)中的存在形式和濃度發(fā)生了很大變化，使其對人類生態(tài) 環(huán)境的影響不斷加劇。重金屬污染的初期一般不易察覺，進(jìn)入人體后，可在人體的某些 器官積累，造成慢性中毒。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確靈敏的重金屬檢測技術(shù)，對于控制環(huán) 境污染、保護(hù)人類健康，都具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。 1 1 重金屬離子污染 化學(xué)上根據(jù)金屬的密度，通常把密度大于4 5 c m 3 的金屬稱為重金屬【l j 。如金、銀、 銅、鉛、鋅、汞、鎳、鎘和錳等大約4 5 種。從毒性角度一般把金屬錫、砷和鋁等也包 括在內(nèi)。盡管重金屬鋅、銅和錳等是生命活動所必需的微量元素，但是大部分重金屬如 鉛、汞、鎘等并非生命活動所必需，而且所有重金屬超過一定濃度時都會對人體的某些 機(jī)能造成損傷。這些重金屬在環(huán)境中不能被降解，與其他毒素結(jié)合可以生成毒性更大的 有機(jī)物或無機(jī)物，進(jìn)入人體后毒性更大，它們被稱為有害重金屬。在環(huán)境污染中研究最 多的一般是汞、鎘、鉛和類金屬砷等。 重金屬離子污染指由重金屬或其化合物所造成的環(huán)境污染。主要來源是工業(yè)污染， 其次是交通污染和生活垃圾污染。工業(yè)污染大多由廢渣、廢水、廢氣等排入環(huán)境，然后 在人和動植物中富集，從而對環(huán)境和人類健康造成極大危害。 重金屬離子污染與其他有機(jī)化合物的污染不同，許多有機(jī)化合物可以通過自然界本 身的物理、化學(xué)或生物的降解，使有害性得以降低或消除。而重金屬離子污染具有富集 性，很難在環(huán)境中被微生物降解。重金屬離子污染主要表現(xiàn)在水污染中，還有一部分是 在大氣以及固體廢棄物中。水體中金屬離子有利或有害不僅取決于金屬的種類和性質(zhì)， 而且還取決于金屬離子的濃度以及其存在形態(tài)及價態(tài)，即使是有益的金屬元素，當(dāng)其濃 度超過一定數(shù)值時也會具有很強(qiáng)的毒性，可以引起動植物中毒，甚至死亡。金屬有機(jī)化 合物( 如有機(jī)汞、有機(jī)鉛、有機(jī)錫、有機(jī)砷等) 比相應(yīng)的金屬無機(jī)化合物毒性要強(qiáng)得多； 可溶態(tài)的金屬又比固體顆粒態(tài)金屬的毒性要大；六價鉻比三價鉻毒性要大等。重金屬在 人體內(nèi)能和蛋白質(zhì)及各種酶發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使它們失去活性，也可能在人體的某 基于核酸探針的汞離子和鉛離子檢測 中富集，如果超過人體所能承受的限度，就會造成人體急性中毒、亞急性中毒以 中毒等，對人體造成極大的危害。 重金屬離子污染分類 ) 汞污染。汞及其化合物都屬于劇毒物質(zhì)，可以在人體內(nèi)蓄積。汞離子污染主要 于貴金屬的冶煉、化妝品、照明用燈、齒科材料、水生生物等。血液中的汞離子 組織后，可以逐漸在腦組織中積累，達(dá)到一定量時就會對腦組織造成損害，另外 汞離子轉(zhuǎn)移到腎臟，引起腎臟一些機(jī)能的損傷；進(jìn)入水體的無機(jī)汞離子可轉(zhuǎn)變?yōu)?大的有機(jī)汞，由食物鏈進(jìn)入人體，引起全身中毒，如果是急性汞中毒，會誘發(fā)肝 尿；易受汞污染危害的人群主要是女性，尤其是準(zhǔn)媽媽。天然水中一般含汞極少， 超過o 1 嵋兒，正常人血液中的汞濃度小于5 1 0p g l ，尿液中的汞濃度小于2 0 ) 鉛污染。鉛是可在人體和動物組織中蓄積的有毒金屬。主要來源于各種油漆、 蓄電池、冶煉、機(jī)械、五金、化妝品、染發(fā)劑、電鍍、自來水管等。通過皮膚、 、呼吸道等方式進(jìn)入體內(nèi)與多種器官有親和作用，主要毒性效應(yīng)是貧血癥、神經(jīng) 調(diào)和腎損傷，易受害的主要有兒童、老人、免疫低的人群。鉛對水生生物的安全 0 1 6m g l ，人體內(nèi)正常的鉛含量應(yīng)該低于0 1m g l ，如果含量超標(biāo)，容易引起 損害神經(jīng)系統(tǒng)。而幼兒大腦受鉛的損害要比成人敏感得多。 ) 鎘污染。鎘不是人體的必需元素。鎘的毒性很大，進(jìn)入人體后可在人體內(nèi)蓄積， 在腎臟，然后引起泌尿系統(tǒng)的功能失調(diào)；鎘污染主要來源有電鍍、采礦、冶煉、 燃料、電池和化學(xué)工業(yè)等排放的廢水；廢舊電池中鎘含量也比較高、在一些水果和蔬菜 中，尤其是蘑菇中也有一定量鎘。鎘能夠取代骨頭中的鈣，使骨骼嚴(yán)重軟化，骨頭寸斷， 如果長期攝入微量鎘容易引起骨痛病，也會引起胃臟功能紊亂，干擾人體內(nèi)的酶系統(tǒng)， 導(dǎo)致血壓上升。易受害的人群主要是礦業(yè)工作者、免疫力低下人群。正常人血液中的鎘 濃度小于5 “g l ，尿中小于1 嶇皿。 ( 4 ) 砷污染。砷是人體的非必需元素，元素砷的毒性極低，而砷的化合物均有劇毒， 三價砷的化合物比其它價態(tài)的砷化合物毒性更強(qiáng)。砷可以通過呼吸道、消化道和皮膚接 觸進(jìn)入人體，如果攝入量超過排泄量，會在人體的肝、肺、腎、骨骼、子宮、肌肉等部 位蓄積，然后與細(xì)胞中的酶結(jié)合，使酶的生物活性受到抑制，特別是在毛發(fā)、指甲中的 蓄積，容易引起慢性砷中毒。砷還有致癌作用，能引起皮膚癌，通常情況下，土壤、水、 空氣、植物和人體中的砷都是微量的，不足以對人體造成危害。 ( 5 ) 鉻污染。主要來源于劣質(zhì)化妝品原料、皮革制劑、金屬部件鍍鉻部分。如誤食 飲用，可致腹部不適及腹瀉等中毒癥狀，引起過敏性皮炎或濕疹。鉻呼吸進(jìn)入人體后， 對呼吸道有刺激和腐蝕作用，容易引起咽炎、支氣管炎等癥狀。水污染嚴(yán)重地區(qū)的居民， 經(jīng)常接觸或過量攝入鉻，易得結(jié)核病、腹瀉、支氣管炎、鼻炎、皮炎等。 碩士學(xué)位論文 1 1 2 重金屬離子污染現(xiàn)狀 重金屬離子污染已經(jīng)成為我國一個不可忽視的問題。隨著我國工業(yè)的飛速發(fā)展，尤 其是鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)，大量未經(jīng)處理的含有重金屬離子的工業(yè)廢水及廢棄物直接排入水體，造 成江、河、湖、海、地下水等水源的污染。其直接影響是：水產(chǎn)品的食用安全質(zhì)量受到 嚴(yán)重威脅，目前全國有2 7 條主要河流已受到不同程度的含汞工業(yè)廢水污染，其水產(chǎn)品 也對人們的身體健康存在著潛在的威脅。同時，由于我國很多地區(qū)尤其是北方地區(qū)農(nóng)業(yè) 灌溉水資源緊張，存在著大片的污灌區(qū)，造成了重金屬離子在一些污灌區(qū)的農(nóng)田中長期 積累，重金屬離子污染事件頻發(fā)。據(jù)不完全統(tǒng)計，由于鎘的開采和冶煉排放的廢水，我 國目前遭受鎘污染的農(nóng)田大約有1 8 萬畝，很多地區(qū)出現(xiàn)“鎘米”事件，這些受污染的農(nóng) 作物嚴(yán)重威脅到眾多食用者的身體健康，也嚴(yán)重影響到我國農(nóng)產(chǎn)品國內(nèi)外市場未來發(fā)展 前景。 所以，政府有關(guān)部門對重金屬離子的污染防治也采取了一些措施。2 0 1 1 年即將出臺 的重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃顯示，中國將對汞、鉻、鉛、鎘等重金屬進(jìn)行 重點防控。按照規(guī)劃要求，到2 0 1 5 年，“重點區(qū)域”鉛、汞、鎘、鉻和類金屬砷等 重金屬污染物的排放，要比2 0 0 7 年削減1 5 ；“非重點區(qū)域”的重金屬污染物排放量不 超過2 0 0 7 年水平。目前重金屬的污染已相當(dāng)嚴(yán)重，對環(huán)境和生物造成了極大危害，同 時，其易通過食物鏈而富集，因此，已經(jīng)引起了世喬各國科學(xué)家的高度重視，解決這個 問題也迫在眉睫。 1 1 3 重金屬離子檢測的方法及意義 鑒于重金屬離子在生物體內(nèi)易積累、毒性大等特點，所以建立痕量、超痕量重金屬 離子分析檢測技術(shù)極為重要。對于痕量重金屬離子的檢測，傳統(tǒng)儀器分析方法有原子發(fā) 射光譜法、原子吸收光譜法、等離子體質(zhì)譜法、熒光譜法和溶出伏安法等。 原子發(fā)射光譜分析法( a t o m i ce m i s s i o ns p e c t r o s c o p y ，a e s ) 是化學(xué)元素的原子和 離子在熱激發(fā)或電激發(fā)下，利用發(fā)射特征的光波輻射而進(jìn)行定性以及定量分析的方法。 該方法的特點是分析速度快、選擇性好、靈敏度高和易操作等，可同時進(jìn)行多元素的分 析。但該方法所需的成套設(shè)備昂貴，分析非金屬元素硒、硫和鹵素等的靈敏度較低，它 的準(zhǔn)確度隨待測元素含量的多少而有所不同，只限于元素分析，不能確定這些元素在樣 品中存在的化合物狀態(tài)，且對于含量高的元素定量分析誤差較大，對于超微量元素的定 量分析靈敏度不夠。 原子吸收光譜法( a t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ，a a s ) 又稱為原子吸收分光光 度，簡稱原子吸收法。是2 0 世紀(jì)5 0 年代發(fā)展起來一種基于待測元素的基態(tài)原子蒸汽對 該元素的原子特征譜線的吸收程度進(jìn)行定量分析的一種方法1 2 j 。也是目前應(yīng)用最為廣泛 的對元素進(jìn)行定性定量分析的方法，主要特點有： ( 1 ) 能測定幾乎所有的金屬元素，是現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)、石油、化工、地質(zhì)、大氣和 基于核酸探針的汞離子和鉛離子檢測 環(huán)保等行業(yè)不可缺少的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。 ( 2 ) 選擇性高，分析干擾少。 ( 3 ) 檢出限低，檢測靈敏度高。 ( 4 ) 儀器具有較高的精密度。 ( 5 ) 分析速度快，對處理好的待測試樣，每樣次的測定只需數(shù)秒到數(shù)十秒。 ( 6 ) 測定每種元素都需要相應(yīng)的空心陰極燈，不能進(jìn)行多元素同時分析。 原子熒光光譜分析法( a t o 面cf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ，a f s ) 又稱原子光致光譜 分析法，是一種通過待測元素的原子蒸氣在輻射能激發(fā)下所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來確定其含 量的一種分析方法。該方法具有靈敏度高、線性工作范圍寬和分析譜線簡單等優(yōu)點。光 譜分析是一種相對分析方法，一般需要與標(biāo)準(zhǔn)樣品作對照，由于樣品的組成和結(jié)構(gòu)變化 對測定結(jié)果的影響較大，因此對標(biāo)樣的要求較為嚴(yán)格。 溶出伏安法是電化學(xué)方法中一種重要的痕量分析方法，包括電解富集和電解溶出兩 個過程。通過適當(dāng)?shù)年帢O或陽極過程，恒電位預(yù)電解一定時間之后，使痕量被測組分在 電極上沉積，即電極富集；再將富集后的溶液靜置0 5 1 分鐘后，用與預(yù)電解相反的電 極過程，使富集在電極上的被測物質(zhì)在短時間內(nèi)重新溶解下來，即電解溶出過程。通過 溶出過程的極化曲線獲得溶出峰，而溶出峰的電流大小與被測物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系。 該方法對一些物質(zhì)的測定有很高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，儀器設(shè)備簡單，操作費用 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于光譜法，所以實用性較高。 2 0 世紀(jì)8 0 年代以來，電感耦合等離子體質(zhì)譜法( i c p m s ) 3 1 逐漸成為元素分析中 最重要的技術(shù)之一，它以i c p 炬作為原子化器和離子化器。與傳統(tǒng)的電感耦合等離子體 原子發(fā)射光譜法( i c p a e s ) 相比，i c p m s 得到的譜線非常簡單，僅由各個元素的同 位素組成。該技術(shù)對絕大多數(shù)元素都具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度以及選擇性。另外，此 方法還具有線性范圍寬、可進(jìn)行多元素同時檢測等優(yōu)點，已廣泛用于環(huán)境、石油、冶金 以及生物學(xué)等領(lǐng)域。上述這些傳統(tǒng)技術(shù)雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但同時也存在著樣品 預(yù)處理過程復(fù)雜、操作耗時、儀器昂貴和運行費用高等缺點，且不能提供連續(xù)的分析， 難以滿足實際環(huán)境中方便快速、實時檢測的需要。 1 2 核酸探針簡介 核酸是染色體的主要化學(xué)成分，是遺傳信息的主要載體，是生物物種延續(xù)、物種進(jìn) 化的決定因素；有時被稱為“遺傳微?！薄：塑账崾呛怂岬幕窘Y(jié)構(gòu)重復(fù)單元，核苷酸 又是由堿基( b a s e ) ，磷酸和戊糖組成，其中堿基和戊糖的結(jié)合產(chǎn)物稱為核苷。根據(jù)核酸 所含戊糖種類的不同而分為脫氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ，d n a ) 和核糖核酸 ( r i b o n u c l e i c a c i d ，i a ) 兩大類。d n a 是生物體內(nèi)一種由很多單體組成的線性大分子( 長 鏈聚合物) ，它的基本結(jié)構(gòu)重復(fù)單元是脫氧核苷酸，而糖類與磷酸分子借由酯鍵相連， 組成其長鏈骨架。核酸序列的異常，可以引起各種疾病以及生命活動異常，所以分析核 碩士學(xué)位論文 酸序列，探測核酸結(jié)構(gòu)與功能具有非常重大的意義。早在1 9 8 8 年，b a i n s 等人就將短的 d n a 片段固定到支持物上，以反向雜交的方式對核酸序列進(jìn)行測定。如今，隨著生命 科學(xué)與眾多相關(guān)學(xué)科( 如材料科學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、微加工技術(shù)、有機(jī)合成技術(shù)等) 的迅猛 發(fā)展，為核酸探針的實現(xiàn)提供了可能。 生物體都含有相對穩(wěn)定的d n a 序列，不易受外界環(huán)境因素的影響而改變。一般來 說，同種生物體具有相同的d n a 序列，不同種生物體的不同，每個生物個體都有自己 獨特的d n a 序列。根據(jù)中心法則，d n a 雙鏈的核苷酸分子是通過堿基之間的氫鍵作用 專一性互補(bǔ)配對而結(jié)合在一起的，每個基因的r n a 和對應(yīng)的模板d n a 鏈也可以通過堿 基配對而結(jié)合在一起。核酸探針就是根據(jù)核酸分子之間的互補(bǔ)配對原則設(shè)計的一種檢測 目標(biāo)d n a 序列的一段核酸序列。一般先將探針核酸分子用某種可檢測信號的物質(zhì)標(biāo)記， 然后用探針去和待檢測的序列雜交。如果探針與被檢測的核酸分子之間存在互補(bǔ)性，則 探針就會與目標(biāo)序列形成雜交分子，通過檢測標(biāo)記物信號表達(dá)就可以檢測目標(biāo)序列。 h 圖1 1 腺嘌呤( a ) 和胸腺嘧啶( t ) 以及胞嘧啶( c ) 和鳥嘌呤( g ) 之間通過w a t s o n - c r i c k 氫鍵 雜交配對 4 1 上世紀(jì)5 0 年代w a t s o n 和c r i c k 闡明了脫氧核糖核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)【4 】，核酸堿基的互 補(bǔ)配對作用( 如圖1 1 所示) 開始為人們所熟知。隨著人們對核酸結(jié)構(gòu)和功能的深入研 究以及組合化學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的功能化核酸分子，如分子信標(biāo)( m o l e c u l a r b e a c o n s ，m b s ) 、脫氧核酶( d n a z y m e ) 、核酸適體( a p t a m e r ) 等，使利用核酸探針的 檢測分析拓展到了更為廣泛的領(lǐng)域【5 罐】。并以此設(shè)計了許多新型的核酸探針體系( 圖1 2 ) 。 分子信標(biāo)是人為設(shè)計的一段具有莖環(huán)( s t e m 1 0 0 p ) 結(jié)構(gòu)的發(fā)夾型d n a 探針，莖部 一般由5 6 對互補(bǔ)堿基形成，而環(huán)部則與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)。在核酸分子末端分別標(biāo)記 熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。當(dāng)莖部序列雜交時，由于共振能量轉(zhuǎn)移作用，熒光分子的熒光被 猝滅；如果存在目標(biāo)d n a 鏈與環(huán)部雜交，則莖部被打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離， 熒光恢復(fù)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f l i g a n d sb y e x p o n e n t i me n r i c h m e n t ，s e l e x ) 技術(shù)，經(jīng)體外篩選出的對于配體具有特異性結(jié)合作用的 寡聚核苷酸片段 9 1 。d n a z y m e 也是一類通過s e l e x 技術(shù)篩選出來的具有催化活性的 核酸序列【1 0 1 。作為酶和抗體的核酸等價物，功能化的d n a z y m e 和核酸適體，除了對配 體有相當(dāng)?shù)挠H和作用外，還表現(xiàn)出比蛋白等傳統(tǒng)識別單元更多的優(yōu)越性：由于功能化核 定的t - h 9 2 + t 結(jié)構(gòu)，所以將胸腺嘧啶堿基作為識別基團(tuán)，通過一定的連接體將其與信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)基團(tuán)連接起來就可以構(gòu)建基于分子化學(xué)的h 9 2 + 熒光核酸探針體系。o n o 等【2 0 】在一條 莖部富胸腺嘧啶堿基的單鏈寡核苷酸( o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e ，o d n ) 鏈兩端分別標(biāo)記 4 一( 4 二甲基氨基苯偶氮基) 苯甲酸( 4 ( ( 4 ( d i m e t h y l a m i n o ) p h e n y l ) a z o ) b e n z o i ca c i d ， d a b c y l ) 和熒光素( f l u o r e s e e i n ，f a m ) ，作為猝滅基團(tuán)以及熒光基團(tuán)，基于熒光共振能 量轉(zhuǎn)移，設(shè)計了一種新型h 9 2 + 熒光核酸探針，其響應(yīng)機(jī)理見圖1 3 。當(dāng)h 9 2 + 不存在時， 該寡聚核苷酸鏈為一線性單鏈結(jié)構(gòu)，所以d a b c y l 和f a m 相距較遠(yuǎn)，不能發(fā)生有效的熒 碩士學(xué)位論文 光共振能量轉(zhuǎn)移( f r e t ) ，在激發(fā)光激發(fā)下，體系有很強(qiáng)熒光；當(dāng)h 9 2 + 存在時，由于t 堿基對與h 9 2 + 的特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的t o h 9 2 + t 結(jié)構(gòu)，該單鏈寡聚核苷酸鏈折疊成類 似發(fā)夾型( h a i r p i n ) 結(jié)構(gòu)的雜合體，使其兩端標(biāo)記的d a b c y l 和f a m 距離靠近，發(fā)生有 效地?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移，f a m 的熒光被d a b e y l 猝滅，根據(jù)此信號變化來測定溶液中的 h 礦+ ，檢出限可以達(dá)到4 0n m ，并且有很好的選擇性。 h 薹，l 婦d i a g魄粕確喵 ，腳 刪睡船刪i - 二= 丫、二= k a 辨加 l | 辨礦o 叛糊呵愀 嘲( 譬 分崔劃 鼻p 圖1 3h 9 2 + 與t 堿基配位示意圖及 1 9 2 + 熒光核酸探針的響應(yīng)機(jī)理【2 0 】 金納米顆粒作為一種新材料，在單鏈d n a 溶液中分散性好，溶液呈紅色，而在雙 鏈d n a 溶液中分散性較差，發(fā)生聚集現(xiàn)象，溶液呈藍(lán)色，引起吸收信號的變化?？茖W(xué) 家根據(jù)此也設(shè)計了很多d n a 探針用于目標(biāo)物檢測。y a n g 2 l 】等利用金納米顆粒對f a m 的猝滅效應(yīng)及富t 單鏈d n a ( t - r i c hd n a ) 對h 9 2 + 的識別作用，設(shè)計了一種比色和熒 光增強(qiáng)法檢測h 孑+ ，響應(yīng)機(jī)理見圖1 4 。不存在h 9 2 + 時，金納米顆粒分散較好，溶液呈 紅色，同時由于f a m 標(biāo)記的單鏈d n a 吸附在金納米顆粒表面，使兩者距離靠近造成 f a m 的熒光猝滅，當(dāng)h 9 2 + 存在的時候，由于錯配t 堿基對h 9 2 + 的特異性親和作用形成 懿 罐憨 長。逸 = a u - n p o = 妒、20 1 5 9 0 n u c 刪d e 圖1 4 基于金納米顆粒的h 9 2 + 傳感體系的響應(yīng)機(jī)理【2 1 1 成類似發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，這樣可以使短鏈d n a 解離下來，即標(biāo)記b l a c kh o l eq u e n c h e r - 1 鏈 掉下來，與f a m 距離較遠(yuǎn)，無法發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，f a m 熒光恢復(fù)，而且其熒光 強(qiáng)度與h 9 2 + 濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，據(jù)此測定溶液中的h 9 2 + 。s h a n g g u a n 2 4 】等報 道了一種金屬酞菁為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基團(tuán)，t 堿基為識別基團(tuán)的可逆性的h 9 2 + 熒光核酸探針 ( 4 t - z n p e ) ，該探針結(jié)合了酞菁優(yōu)良的光學(xué)性能和t 堿基對h 9 2 + 的特異性地識別作用。 不存在h 9 2 + 時，表現(xiàn)出游離態(tài)的4 t - z n p c 的熒光性質(zhì)；當(dāng)h 9 2 + 存在時，由于t 堿基與 h 9 2 + 的特異性作用引起分子4 t - z n p c 發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致其熒光猝滅，而且其熒光猝滅 程度與h 9 2 + 濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，據(jù)此測定溶液中的h 9 2 + 。z h a n g t 2 5 】等以四苯 乙烯( t p e ) 為信號報告單元，t 堿基為識別基團(tuán)設(shè)計了新型h 9 2 + 熒光核酸探針，在 加入h 9 2 + 之前，游離態(tài)的t p e 熒光很弱；加入h 9 2 + 之后，由于t 堿基與h 9 2 + 的作用引 碩士學(xué)位論文 起分子t p e 聚集，從而導(dǎo)致t p e 分子的熒光增強(qiáng)，而且其熒光增強(qiáng)程度與h 9 2 + 濃度在 一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，據(jù)此測定溶液中的h 9 2 + 。到目前為止，利用t 堿基對與h 9 2 + 特異性結(jié)合作用已經(jīng)發(fā)展設(shè)計了許多新型的核酸探針體系，并各有其優(yōu)勢。 1 3 2 基于g 四鏈體比色核酸探針設(shè)計 具有特殊序列的單鏈d n a 可以在金屬離子誘導(dǎo)下折疊成g 四鏈體( g q u a d r u p l e x ) 結(jié)構(gòu)【2 6 】，許多科學(xué)工作者基于這一原理設(shè)計了性能優(yōu)良的核酸探針體系。w a n g 2 7 】等利 用一條特殊的同時富含g 堿基及t 堿基的單鏈d n a ( a r g o l 0 0 ) ，利用比色信號變化 來檢測溶液中的h 9 2 + 。當(dāng)不存在h 9 2 + 時，a r g 0 1 0 0 折疊形成g 四鏈體，與血晶素結(jié)合 后具有過氧化物酶催化活性引起吸收信號的表達(dá)；當(dāng)有h 9 2 + 存在時，a r g 0 1 0 0 中t 堿 基與h 9 2 + 的特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的t - h 9 2 + t 結(jié)構(gòu)，阻止了g 四鏈體形成，吸收信號很 弱。同時，該研究小組研究了一條富g 鏈( p s 2 m ) 分別在k + 及p f f + 存在下形成g 四 鏈體后的過氧化物酶活性【2 8 】。該鏈在k + 存在時形成g - 四鏈體，具有過氧化物酶活性， 加入p b 2 + 后，p b 2 + 可以將g 四鏈體中的k + 競爭下來，使g 四鏈體失去過氧化物酶活性。 基于此原理，該研究小組發(fā)展了一種利用比色以及化學(xué)發(fā)光同時檢測p b 2 + 的方法【2 9 j 。 1 3 3 基于金屬離子特異性d n a z y m e 核酸探針設(shè)計 核酶是一類具有催化功能的核酸分子。早在2 0 世紀(jì)8 0 年代，科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn)r n a 催 化酶反應(yīng)，將其命名為核酶1 3 0 - 3 1 1 ，之后又發(fā)現(xiàn)d n a 也具有酶的特性，稱為脫氧核酶 ( d e o x y r i b o z y m e 或d n a z y m e ) 3 2 揶】，其發(fā)現(xiàn)是人類對于酶認(rèn)識的又一次飛躍。d n a z y m e 的活性與某些金屬離子密切相關(guān)，通過體外篩選技術(shù)可以得到對一些金屬離子有特異性 結(jié)合的d n a r n a 核酸適體或核酶，所以可以利用這些酶來構(gòu)建金屬離子熒光核酸探 針，用于環(huán)境中金屬離子的檢測。t a n 3 7 1 等也利用p b 2 + 依賴性的d n a z y m e 設(shè)計了p b 2 + 圖1 6 基- - r rd n a z y m e 設(shè)計的p b 2 + 熒光傳感體系的機(jī)理【3 7 】 熒光傳感體系，傳感機(jī)理見圖1 6 。通過在d n a z y m e 兩端分別標(biāo)記猝滅基團(tuán)和熒光基 團(tuán)，其部分互補(bǔ)的d n a 鏈通過多個t 堿基( p o l y t ) 連接起來，兩端發(fā)生分子內(nèi)雜交將 熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)拉近，由于f r e t 使熒光基團(tuán)熒光被猝滅。當(dāng)p b 2 + 存在時，d n a z y m e 中熒光標(biāo)記的d n a 鏈被切斷，使其遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)，造成熒光恢復(fù)。 基于核酸探針的汞離子和鉛離子檢測 1 4 本論文的選題依據(jù)及研究內(nèi)容 隨著重金屬離子及其化合物的廣泛應(yīng)用，其對環(huán)境的污染也越來越嚴(yán)重，研究環(huán)境 中重金屬離子的含量就顯得尤為重要，目前已經(jīng)報道了許多高靈敏、快速、準(zhǔn)確、低成 本并能選擇性地分析檢測重金屬離子的方法。但是在研究和實際應(yīng)用中還存在著一些不 足：首先，信號表達(dá)問題。由于重金屬離子對一些常見熒光體的猝滅作用，容易“產(chǎn)生。 假陽性信號”；其次，需要標(biāo)記。許多核酸探針都需要標(biāo)記來產(chǎn)生信號表達(dá)，不僅費時 費力，還可能會對探針的活性造成一定程度的損害。本論文在上述的一些重金屬離子檢 測方法的基礎(chǔ)上，對于重金屬離子h 9 2 + 以及p b 2 + 的檢測方法做了一些探索和嘗試，希望 對以后的研究提供一些參考及借鑒。本論文的主要研究內(nèi)容如下： ( 1 ) 基于錯配的胸腺嘧啶堿基對( t ) 與h 9 2 + 的特異性親和作用所形成的穩(wěn)定的 t _ h 9 2 + _ t 結(jié)構(gòu)以及丫環(huán)糊精與芘分子的包絡(luò)作用，兩者協(xié)同使探針鏈折疊成類似發(fā)夾型 ( h a i r p i n ) 結(jié)構(gòu)的雜合體，造成探針兩端標(biāo)記的芘分子距離靠近，產(chǎn)生二聚體的熒光， 設(shè)計了基于熒光增強(qiáng)型h 9 2 + 核酸探針。 ( 2 ) 基于d n a z y m e 與g 四鏈體設(shè)計了一種發(fā)夾型結(jié)構(gòu)的核酸探針，當(dāng)不存在p b 2 + 時，富g 鏈通過與堿基互補(bǔ)配對被封閉，不能形成g 四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)生顯色反應(yīng)，吸收 信號較低；通過p b 2 + 作用后，將底物鏈上連接的富g 鏈釋放出來，形成g 四鏈體引發(fā) 顯色反應(yīng)，通過吸收信號的響應(yīng)來達(dá)到檢測p b 2 + 的目的。 ( 3 ) 基于d n a z y m e 可以在p b 2 + 的作用下，能夠發(fā)生特異性的斷裂以及s y b rg r e e n i ( s g ) 與單雙鏈d n a 作用不同，設(shè)計了一種p b 2 + 熒光核酸探針。體系中不存在p b 2 + 時，d n a z y m e 更多的以雙鏈形式存在，s g 嵌入雙鏈d n a 中，熒光信號很強(qiáng)；當(dāng)體系 加入p b 2 + 時，d n a z y m e 中的雙鏈結(jié)構(gòu)被切斷后釋放，引起溶液中單鏈濃度增加使s g 熒光降低，以此信號變化來檢測p b 2 + 。 - l o 碩士學(xué)位論文 第2 章基于環(huán)糊精芘協(xié)同作用熒光檢測汞離子 2 1 引言 汞是常溫下唯一以液態(tài)存在的金屬，通常