DNA的復(fù)制與重組.ppt

,DNA的復(fù)制與重組,一，DNA的復(fù)制,*,WastonandCrick,1953,現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)在生命有機(jī)體中，基因是唯一能夠復(fù)制，并且能永遠(yuǎn)存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質(zhì)才體現(xiàn)出來。從DNA到蛋白質(zhì)，遺傳信息的流動(dòng)遵循著中心法則。,1中心法則,2DNA的半保留復(fù)制,半保留復(fù)制（semiconservativereplication）即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的。,半保留復(fù)制的意義復(fù)制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性。,半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)1958年M.Messelson等用實(shí)驗(yàn)予以了證實(shí)雙螺旋結(jié)構(gòu)是半保留復(fù)制的分子基礎(chǔ),3DNA的半不連續(xù)復(fù)制,前導(dǎo)鏈（leadingstrain）:為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈?zhǔn)?3鏈。隨從鏈（laggingstrain）：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎(chǔ)上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA是35鏈。,（以原核生物大腸桿菌為例）1.原料：dNTP，Mg+2.雙鏈DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物5.解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（OriC）上解開雙螺旋。,4DNA的復(fù)制過程,4.1與復(fù)制有關(guān)的酶和因子,單鏈結(jié)合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復(fù)性。7.拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)DNA分子中存在打結(jié)，纏繞、連環(huán)的超螺旋現(xiàn)象。I型酶：切開雙鏈中的一股，使DNA不致打結(jié)，切口的3端可通過自由轉(zhuǎn)動(dòng)一周再與5端磷酸連接，不需ATP。II型酶：切斷處于超螺旋狀態(tài)中雙股鏈中的某個(gè)部位，通過切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢復(fù)復(fù)制所要求的負(fù)超螺旋狀態(tài)。(注:拓?fù)湟辉~的含義是指物體或圖象作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。),8.DNA聚合酶（DNApolymerase）,聚合酶III主要的復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯(cuò)的功能有從53延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，將原料dNTP與末端核苷酸游離的3OH以3,5磷酸二酯鍵連接，同時(shí)釋出一個(gè)PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是53有從35外切酶的活性，以切除可能錯(cuò)配的核苷酸,聚合酶I用于切除引物RNA,并填補(bǔ)留下的空隙有從53延伸多核苷酸鏈的聚合酶的活性；有從35外切酶的活性，以切除可能錯(cuò)配的核苷酸；有從53外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用與聚合酶III相似有從53延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性；有從35外切酶的活性,真核的DNA聚合酶真核DNA的復(fù)制至少涉及5種復(fù)制酶、和，其中、參與染色體DNA的復(fù)制。有引物要求；負(fù)責(zé)DNA的修復(fù)；的功能是線粒體DNA的復(fù)制。,9.DNA連接酶（ligase）,將不連續(xù)的DNA片段以3，5磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP,5原核生物DNA的復(fù)制,In1963,JohnCairnsTechnique:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonths.,ReplicationoftheE.colichromosome,WhatCairnsexperiment(1963)showed:,E.colihasacircularchromosome.E.colihasasingleoriginofreplication.InE.coli,replicationandunwindingaresimultaneous.,大腸桿菌(E.coli)的OriC復(fù)制原點(diǎn),大腸桿菌基因組的復(fù)制原點(diǎn)位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操縱子之間，全長245bp,稱為oriC。,復(fù)制的起始,大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟,復(fù)制的延伸,復(fù)制的終止,6真核生物DNA的復(fù)制,真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn),有多處復(fù)制起始點(diǎn)；在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開始；DNA復(fù)制只在S期進(jìn)行。復(fù)制子相對較小，為40-100千堿基對。,真核生物DNA的復(fù)制子被稱為ARS(autonomouslyreplicatingsequences)，長約150bp左右，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必需的保守區(qū)。,真核生物DNA復(fù)制的起始需要起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（originrecognitioncomplex，ORC）參與，ORC結(jié)合于ARS，它是由6種蛋白質(zhì)組成的啟動(dòng)復(fù)合物。,真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp/秒。因此，人類DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。,已發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有15種以上。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶、和。,真核生物DNA聚合酶的特性比較,DNA聚合酶主要參與引物合成。,DNA聚合酶活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。,DNA聚合酶主要負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制。,DNA聚合酶與后隨鏈合成有關(guān)，在DNA合成過程中核苷切除以及堿基的切除修復(fù)中起著重要的作用。,DNA聚合酶在線粒體DNA的復(fù)制中發(fā)揮作用。,免疫學(xué)信息網(wǎng),免疫學(xué)信息網(wǎng),免疫學(xué)信息網(wǎng),免疫學(xué)信息網(wǎng),免疫學(xué)信息網(wǎng),RF-Cisafive-subunitcomplexAllsubunitsarerelatedinsequenceandhaveATPbindingmotifsATPhydrolysisbyRF-CisassociatedwiththeloadingofPCNARF-Cisthefunctionalhomologoftheclamp-loadergcomplex,免疫學(xué)信息網(wǎng),免疫學(xué)信息網(wǎng),Polymeraseswitchingoccursevenonlaggingstrands;polddoesmostofDNAsynthesis,免疫學(xué)信息網(wǎng),免疫學(xué)信息網(wǎng),二，DNA的重組,第一節(jié)概述,一、DNA重組（recombination）1、概念：DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組（geneticrecombination）,或者基因重排(generearrangement)。2、意義：重組是遺傳學(xué)的靈魂，沒有重組就沒有生物的進(jìn)化；沒有重組也就沒有現(xiàn)代的分子克隆技術(shù),二、DNA重組的類型1、同源重組（HomologousRecombination）2、位點(diǎn)特異性重組（Site-specificRecombination）3、DNA的轉(zhuǎn)座（transposition）,第二節(jié)同源重組,一、概述1、定義：兩個(gè)DNA分子同源序列之間進(jìn)行的重組2、條件：（1）兩個(gè)DNA分子有同源序列（相關(guān)的酶可以用任何一對同源序列為底物）（2）兩個(gè)DNA分子必須緊密接觸3、發(fā)生：真核生物:非姐妹染色單體交換相對應(yīng)的區(qū)域。原核生物:依賴recA蛋白，并形成Holliday結(jié)構(gòu)Holiday模型（1964年）,二、大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)（一）RecA1、作用：可促進(jìn)單鏈同化或單鏈吸收RecA具有使DNA單鏈置換雙鏈中同源鏈的能力,特異地識(shí)別單鏈DNA，并能將之與同源DNA中的互補(bǔ)順序“退火”，同時(shí)將另一條鏈排擠出去（取代），形成雜種分子2、單鏈同化發(fā)生的三個(gè)條件（1）其中一個(gè)DNA必須存在單鏈區(qū)（2）其中一個(gè)DNA必須有一個(gè)自由3末端（3）此單鏈區(qū)和3末端必須位于兩分子之間互補(bǔ)的區(qū)域內(nèi),（二）RecBCD復(fù)合體1、酶的活性：（1）核酸外切酶（2）核酸內(nèi)切酶（3）解旋酶2、作用：在Chi位點(diǎn)處產(chǎn)生含3游離未端單鏈.,（三）Chi位點(diǎn)-RecBCD識(shí)別的靶位點(diǎn)5GCTGGTGG33CGACCACC5是重組頻率較高的部位E.coli中每隔約510kb有一個(gè)拷貝，,斷裂和重連產(chǎn)生異源雙鏈DNA1.同源序列排列在一起；2.酶切。通過核酸酶和RecBCD蛋白復(fù)合體的作用在一對同源DNA上產(chǎn)生切口；3.入侵。含有3端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA細(xì)絲；RecA-ssDNA細(xì)絲尋找相對的DNA雙螺旋上的相應(yīng)序列。,三、Holiday重組模型,4.游離端交叉連接，形成Holliday結(jié)構(gòu)5.通過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈DNA。,十字形結(jié)構(gòu),6.空間重排。十字型兩臂旋轉(zhuǎn)180度7.解離(兩種不同方式)8.修補(bǔ)連接,附：基因敲除(Geneknockout),是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)是指對一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測相應(yīng)基因的功能。,基因敲除的技術(shù)路線如下：（1）構(gòu)建重組基因載體（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi),基因敲除的靶細(xì)胞目前最常用的是小鼠ES細(xì)胞（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞（4）轉(zhuǎn)入假孕母鼠使其生長成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。,四細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,3種形式：1）轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)3）接合,1轉(zhuǎn)化（transformation）,定義：細(xì)菌品系由于吸收了外源DNA（轉(zhuǎn)化因子）而發(fā)生遺傳性狀的改變現(xiàn)象。,轉(zhuǎn)化子（transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)化成功的菌落。,目前已知有二十多個(gè)種的G+和G-細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。,（1）轉(zhuǎn)化因子本質(zhì)是離體的DNA片斷或質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞前還會(huì)被酶解成更小的片段，約8kb。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.但不管何種情況，最易與細(xì)胞表面結(jié)合的仍是dsDNA。由于每個(gè)細(xì)胞表面能與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合的位點(diǎn)有限（如肺炎鏈球菌約10個(gè)），因此，從外界加入無關(guān)的dsDNA就可競爭并干擾轉(zhuǎn)化作用。質(zhì)粒DNA也是良好的轉(zhuǎn)化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.11，最高為20。,（2）人工轉(zhuǎn)化,用CaCl2處理細(xì)胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔、基因槍法等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段（使細(xì)胞膜更易于透過DNA）。,在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。,用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高（不像線型DNA那樣易于降解，而且還能在宿主中復(fù)制。任何來源的DNA將其連接到質(zhì)粒上都能進(jìn)入受體細(xì)胞）.,定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒。,（3）轉(zhuǎn)染(transfection)：,現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染,提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入微生物細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。,特點(diǎn)：,2轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。,細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),（1）、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）,通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。,轉(zhuǎn)導(dǎo)模型,（2）.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。媒介：部分缺陷噬菌體（丟失自身一部分基因，并被同等長度的宿主基因所取代）只能轉(zhuǎn)導(dǎo)個(gè)別特定基因,大腸桿菌中噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過程,3、接合(conjugation),通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程,（1）.接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí),1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum細(xì)菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn),中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！,為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)突變的機(jī)會(huì)，采用了雙重或三重營養(yǎng)缺陷型。該實(shí)驗(yàn)是建立在不大可能同時(shí)發(fā)生兩種或三種回復(fù)突變的設(shè)想上的。,證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（BernardDavis，1950）,大腸桿菌的接合型與接合,F菌株,第三節(jié)位點(diǎn)特異性重組,一、定義：不依賴于DNA順序的同源性，而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異的DNA序列的存在。二、噬菌體對E.coliDNA的整合（一）DNA存在兩種形式裂解狀態(tài)溶源狀態(tài)（二）通過位點(diǎn)特異性重組實(shí)現(xiàn)兩種類型間的轉(zhuǎn)換DNA整合到宿主DNA進(jìn)入溶源狀態(tài)DNA從宿主DNA中切離進(jìn)入裂解狀態(tài),（三）催化重組的酶1、整合酶Int(integrase)：有拓?fù)洚悩?gòu)酶活性2、整合宿主因子（IHF，integrationhostfactor）3、切除酶（excisionase）/終止重組（四）重組位點(diǎn)：附著位點(diǎn)（attachmentsite）attP（POP）和attB（BOB）有15bp核心序列配對（五）重組過程：1、整合：POP+BOBBOPPOB2、切離：BOPPOBPOP+BOB,attP,attB,attP,attB,第四節(jié)DNA的轉(zhuǎn)座,一、轉(zhuǎn)座子（transposon）的定義：存在于染色體DNA上可自主轉(zhuǎn)移座位的基本單位二、轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)：McClintockB：1938年，提出轉(zhuǎn)座基因概念1983年，獲