大腸桿菌質粒轉化實驗.ppt

質粒提取實驗回顧,三大步、七小步、四離心,三溶液及三合一,兩注意,大腸桿菌感受態(tài)的制備及質粒的轉化,2015.06.20,一、什么是感受態(tài)細胞（Competentcell）,細胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性改變,成為能允許外源DNA分子進入的狀態(tài)，處于這種狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。,Naturestate,Competentstate,載體（vector),病毒,質粒,噬菌體,二、什么是轉化及與其相似的概念,轉導（Transduction),轉化（Transformation),轉染（Transfection),/users/chagedor/biol_4684/Methods/genes.html,PEI,脂質體，磷酸鈣等,載體（vector),病毒,質粒,噬菌體,轉化、轉染及轉導之間的相同及不同,轉導（Transduction),/kroberts/Lecture/Chapter%207/horizontal.html,三、如何篩選轉化成功的細胞（發(fā)揚個性）,抗性篩選,藍白斑篩選,四、制備感受態(tài)細胞的方法,通常制備感受態(tài)細胞的方法有兩種：電擊法和化學法,兩種方法比較,電擊法制備感受態(tài)及轉化的原理,+,-,1970年M.Mandel和A.Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣處理的生長期大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。,CaCl2方法的歷史,CaCl2方法的歷史,赫伯特波伊爾,斯坦利柯恩,StanleyCohen,HerbertBoyer,1973年實現(xiàn)了質粒DNA轉化大腸桿菌的感受態(tài)細胞。,感受態(tài)制備及質粒轉化,（1）實驗材料,E.ColiDH5（無質粒）,（2）實驗試劑,p32質粒,（實驗五提取得到的質粒）,液體培養(yǎng)基,低滲MgCl2和CaCl2溶液,（1）CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)過程,(大冷),0.5,(小冷),（2）質粒轉化（Heatshock),100ul,5,5,（熱激+復蘇）,（共冷）,100,(0.5ul),10分鐘,冰上放置10分鐘,加入200微升含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37攝氏度，復蘇30min.,100,（3）質粒轉化后的培養(yǎng)及篩選,液培中，將上述液體加到含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)皿中，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻，放置30分鐘。,氨卞霉素,(ug/ml),（個/ug）,CaCl2方法制備感受態(tài)的原理,1、在“小冷”條件下發(fā)生了什么改變？,（1）處于生長對數(shù)期的大腸桿菌細胞膜上存在大量的Adhensionzones,（2）低溫使得細胞膜的膦脂雙分子層的流動性變慢,2、在“大冷”條件下發(fā)生了什么改變？,（1）低滲的CaCl2和MgCl2溶液使得細胞發(fā)生膨脹,（2）Ca+2離子與細胞膜上的磷酸根離子結合,（3）低溫條件下Ca+2會使細胞膜膦脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域。,（4）Mg+2對于Ca+2具有協(xié)同作用,質粒轉化的原理,3、感受態(tài)細胞和質粒共同冰浴時發(fā)生什么改變？,（1）質粒DNA可以圍繞在感受態(tài)細胞周圍,（2）Ca+2又與質粒DNA結合形成抗脫氧核糖核酸酶（DNase）的羥基-磷酸鈣復合物，并粘附在感受態(tài)細胞膜的外表面上,4、在熱休克時發(fā)生什么改變？,短暫的42熱脈沖處理，感受態(tài)細胞膜的液晶結構發(fā)生劇烈擾動，致使細胞膜的通透性增加，質粒DNA分子便進入細胞內，完成轉化。,總結,（1）在制備感受態(tài)細胞時一定要在低溫進行（溫度的要求）,（2）在熱休克質粒轉化的過程中一定要注意快速（時間的要求）,“四步冷、一步熱”,重點及思考題,重點：,CaCl2方法制備大腸感受態(tài)細胞的原理；質粒轉化過程的步驟及關