基因組序列組裝的理論與方法簡介.ppt

基因組序列組裝-理論與方法,北京大學(xué)生物信息中心科學(xué)院北京基因組研究所李松崗ls兩種測序策略,分級鳥槍法(BACTOBAC)基因組DNA切成大片段構(gòu)建BAC文庫挑選構(gòu)建小片段shotgun文庫測序組裝BAC序列組裝基因組序列全基因組鳥槍法基因組DNA構(gòu)建不同長度shotgun文庫測序組裝基因組序列,基因組測序與組裝示意圖,基于BAC方法的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：組裝被局限在BAC的范圍內(nèi)，受重復(fù)序列影響小，對計(jì)算能力要求不高；缺點(diǎn)：需要大量前期生物學(xué)研究工作，效率低，成本高。,全基因組鳥槍法優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：不需要生物學(xué)前期準(zhǔn)備，速度快，成本低；缺點(diǎn)：組裝是在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行，數(shù)據(jù)量大，易產(chǎn)生錯(cuò)拼；對計(jì)算機(jī)軟硬件要求均高。,對拼接軟件的要求,能充分利用正反向測序的配對信息,避免重復(fù)序列造成的錯(cuò)誤拼接能處理數(shù)以百萬甚至千萬計(jì)的數(shù)據(jù)程序并行化高效率比對,能夠采用全基因組鳥槍法的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)步：毛細(xì)管測序儀的普遍使用計(jì)算機(jī)能力的迅速提高,HierarchicalShotgun(HS),WholeGenomeShotgun(WGS),thesequencingofthehumangenomeislikelytobetheonlylargesequencingprojectcarriedtocompletionbythemethodsdescribedinthisissue.MaynardV.Olson,Themaps:Clonebyclonebyclone,Nature409,816-818(2001),Shotgun法序列拼接,Consensus,Mis-Assembly(Inverted),術(shù)語鳥槍法測序數(shù)據(jù)的組裝鳥槍法文庫：目標(biāo)基因組一定長度隨機(jī)片段克隆的集合。正反向測序?qū)Γ簭耐粋€(gè)克隆片段兩端分別測序所得到的一對序列。.插入片段長度：克隆載體中插入的外源DNA片段長度。片段連接群(contig)：用識別互相重疊的方法對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接的結(jié)果。.Scaffold:用正反向測序?qū)B接的非重疊片段連接群。LW-洞：由于沒有測序數(shù)據(jù)覆蓋而在組裝結(jié)果中留下的洞。,重復(fù)序列分析覆蓋度：基因組被測序數(shù)據(jù)覆蓋的次數(shù)。重復(fù)數(shù)：一段DNA序列在基因組中出現(xiàn)的次數(shù)。深度：一段DNA序列在鳥槍法測序數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)次數(shù)。例如一個(gè)轉(zhuǎn)座子在基因組中出現(xiàn)N次，測序數(shù)據(jù)集的覆蓋度為C,則這個(gè)轉(zhuǎn)座子的平均深度為NC。20-mer重復(fù)序列：任何深度超過為該數(shù)據(jù)集確定的重復(fù)序列標(biāo)準(zhǔn)的20-bpDNA片段。是數(shù)學(xué)定義的重復(fù)序列。重復(fù)序列洞：由于屏蔽重復(fù)序列而在組裝結(jié)果中留下的洞。,組裝結(jié)果的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)N50大?。喊呀M裝出的contigs或scaffolds從大到小排列，當(dāng)其累計(jì)長度剛剛超過全部組裝序列總長度一半時(shí)，最后一個(gè)contig或scaffold的大小。單堿基錯(cuò)誤率：與參考序列比較后發(fā)現(xiàn)的小尺度上的不同所占的比例。所謂小尺度，在這里通常指小于標(biāo)準(zhǔn)測序長度，即500bp。實(shí)際上常常只是幾個(gè)堿基。錯(cuò)誤組裝的Contig：測序數(shù)據(jù)組裝中出現(xiàn)的錯(cuò)誤。由定義，它涉及的片段一般大于500-bp。包括與參考序列相比，插入、刪除，以及在方向和次序上不同的片段。錯(cuò)誤組裝的Scaffold：把非重疊contig連接在一起時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)誤。包括嵌套，錯(cuò)誤的方向和順序等。,ShotgunSequencingAssemblerConcepts,RePS:全基因組鳥槍法測序數(shù)據(jù)組裝軟件包,特點(diǎn)：通過屏蔽在鳥槍法測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)序列來完成組裝。,RePS的流程圖,RePS2的新流程圖,識別重復(fù)序列的數(shù)學(xué)模型,重復(fù)序列識別：,若repeat有m個(gè)拷貝，且已知隨機(jī)序列覆蓋深度為0，1，2的概率：g0，g1，g2，則一次抽樣repeat覆蓋深度為0，1，2，的概率P0，P1，P2，為：,n次抽樣，其中i次以上深度在j以上的概率Pij,設(shè)一次抽樣深度在j以上和以下的概率分別為：Pj，Pj+；,n次抽樣，其中i次以上深度在j以上則認(rèn)為是repeat，此時(shí)犯兩類錯(cuò)誤的概率為：,設(shè)repeat在基因組中的比例為b，出現(xiàn)概率為P，非repeat出現(xiàn)概率為P*，則：,Tradeoffbetweencontigsizeandaccuracyofassembly,重復(fù)序列識別效率,MDR(數(shù)學(xué)定義的重復(fù)序列)與BDR(生物定義的重復(fù)序列),BDR(25%),BDR(50%?),MDR(42.2%),重復(fù)序列的檢測與處理,插入片段大小引起的錯(cuò)誤組裝,人與水稻基因組中重復(fù)序列分布的差別,Contigs:127,550(N50=6,688bp),Scaffolds:102,444(N50=11,764bp),Quality:546bpatQ20,插入片段長度的搭配,一般情況下，可采用如下設(shè)計(jì)：,CAP3（1999）,特點(diǎn)：刪去read兩端低質(zhì)量部分；利用質(zhì)量數(shù)據(jù)，識別重疊序列；進(jìn)行多序列比對，得到一致序列；利用正反向數(shù)據(jù)糾正組裝錯(cuò)誤，構(gòu)建scaffold。使用情況：僅使用數(shù)個(gè)BAC進(jìn)行了測試。,果蠅組裝軟件（2000）,特點(diǎn)：組裝前數(shù)據(jù)預(yù)處理；用數(shù)據(jù)庫屏蔽重復(fù)序列；采用類似BLAST的方法找出重疊部分；選擇不沖突的重疊構(gòu)建contigs，識別重復(fù)序列邊界；用正反向信息構(gòu)建scaffolds，填洞。使用情況：用于果蠅基因組組裝。,用于人類基因組組裝時(shí)的改進(jìn)（2001）,構(gòu)建contigs后，利用一個(gè)統(tǒng)計(jì)模型識別低拷貝重復(fù)序列；采用兩種方式利用已公布的人類基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)，即1.把人類基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)分解成“人工reads”，進(jìn)行組裝；2.利用人類基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)的定位對shotgun數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，然后組裝。,ARACHNE（2002）,特點(diǎn)：組裝前通過多序列比對糾正測序錯(cuò)誤；考慮質(zhì)量數(shù)據(jù)，對每對重疊reads打分；通過分析reads重疊情況識別重復(fù)序列的邊界，組裝的contigs避免越過邊界；識別重復(fù)序列contigs；構(gòu)建scaffolds，填補(bǔ)空洞。使用情況：使用數(shù)個(gè)物種，包括人21、22染色體數(shù)據(jù)進(jìn)行了檢驗(yàn)。,ThePhusionAssembler（2003）,特點(diǎn)：輸入數(shù)據(jù)包括正反向信息，插入片段長度在2-200kb之間；組裝前先對數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，然后并行處理；使用phrap進(jìn)行組裝，組裝過程中利用正反向信息對contig進(jìn)行延伸或打斷；根據(jù)重疊合并contigs；利用正反向信息構(gòu)建scaffolds。使用情況：用于小鼠基因組，7.5x，2.6Gb，479scaffolds,Table2.InsertSizes,NumberofReadsandEffectiveCloneCoveragefortheMouseWGSDataSet,歐拉圖方法（2001）,特點(diǎn)：放棄傳統(tǒng)方法，用圖論解決序列組裝問題；每個(gè)read作為一個(gè)頂點(diǎn)，兩個(gè)reads之間有重疊則有邊連接。組裝問題就化為找一條僅通過每個(gè)頂點(diǎn)一次的通路Hamilton問題。把重復(fù)序列視為粘在一起的邊，可把上述圖簡化，問題變?yōu)檎覂H通過每條邊一次的通路Euler問題。,具體步驟,糾正測序錯(cuò)誤把read分為長為L的字。如果一個(gè)字屬于M個(gè)以上reads，稱為堅(jiān)固的；否則稱為弱的。糾正錯(cuò)誤的算法，就是要通過最少的改變，使弱的字變?yōu)閳?jiān)固的。通過這種方法，糾正了97.7%的測序錯(cuò)誤，