成人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.doc

成人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定作者：李戰(zhàn)強(qiáng),黃友章,彭勤建,汪立川,解永學(xué),廖麗【關(guān)鍵詞】脂肪【關(guān)鍵詞】成人；脂肪；干細(xì)胞；分離；培養(yǎng)1實(shí)驗資料試劑均購自Sigma公司，熒光標(biāo)記單抗購自BD公司，DMEM購自Gibco公司.成年女性48歲行吸脂術(shù)時用無菌針管從臀上方吸取深層脂肪組織20mL.在1h內(nèi)將其移至離心管內(nèi)，加入等量PBS緩沖液，充分振蕩后低速離心800r/min10min.反復(fù)沖洗3次后加入等量15g/LI型膠原酶.37水浴中充分振蕩30min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止.低速離心10min后棄去上清.將下層細(xì)胞用PBS懸浮后加入16mmol/LNH4Cl37水浴中10min以裂解紅細(xì)胞.低速離心10min后再用PBS沖洗3次.最后將瞎胞用含100mL/LFBS+10g/L青霉素的DMEM懸浮后移入培養(yǎng)瓶中，37，50mL/LCO2培養(yǎng)箱中孵育，48h后首次換液，棄去懸浮細(xì)胞.隨后每3d換液，1wk后傳代.將第3代細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測.濃集細(xì)胞到109/L后按文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測.細(xì)胞傳至第3代時將其以2107/L的細(xì)胞數(shù)分別轉(zhuǎn)入各定向培養(yǎng)基（表1）中進(jìn)行培養(yǎng).誘導(dǎo)培養(yǎng)2wk后，對成脂誘導(dǎo)組進(jìn)行油紅脂肪顆粒染色，對成骨誘導(dǎo)組進(jìn)行堿性磷酸酶組化染色，對成軟骨誘導(dǎo)組進(jìn)行II型膠原染色，對成肌誘導(dǎo)組進(jìn)行肌漿球蛋白組化染色.結(jié)果：觀察2d細(xì)胞貼壁.倒置顯微鏡下見細(xì)胞為大而扁平的單層細(xì)胞.有的細(xì)胞體細(xì)長，似成纖維細(xì)胞.流式細(xì)胞儀圖上為單一群體細(xì)胞.免疫表型：CD1069.8%,CD1399.2%,CD2991.0%,CD5581.6%,CD5998.6%,CD10598.0%,CD16632.1%,CD140%,CD450%,CD3485.7%,HLADR0%,與國外文獻(xiàn)一致.油紅染色、堿性磷酸酶染色、II型膠原染色陽性、肌漿球蛋白染色分別呈陽性.表1含10g/L青霉素的定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基DMEM成份（略）2討論脂肪來源的干細(xì)胞（adiposetissuederivedstemcells）雖然具備干細(xì)胞的一些特性，但還不能將其稱為脂肪干細(xì)胞，因為其中可能含有不同分化階段的脂肪前體細(xì)胞（preadipocyte）.從這個意義上講，將其稱為脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adiposetissuederivedstromalcells）更為適合1-3.目前在干細(xì)胞研究領(lǐng)域均公認(rèn)，間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異的表面標(biāo)志.免疫組化染色和流式細(xì)胞儀檢測等免疫表型的結(jié)果對確認(rèn)干細(xì)胞有輔助作用.而鑒定干細(xì)胞的最好方法是進(jìn)行多系定向誘導(dǎo)，并進(jìn)行相應(yīng)檢測以確定誘導(dǎo)成功.而在一些文獻(xiàn)中以偏概全，通過少數(shù)幾個CD分子的免疫組化染色的陽性結(jié)果而下結(jié)論說所分離出的細(xì)胞是干細(xì)胞是不可取的4-5.本研究參照Zuk等1的方法進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)，并通過免疫表型和功能誘導(dǎo)2個方向的實(shí)驗，取得了與文獻(xiàn)相一致的結(jié)果，一方面說明此種方法具備穩(wěn)定的可操作性，另一方面也充分說明所分離培養(yǎng)的脂肪基質(zhì)細(xì)胞中確實(shí)含有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞.【參考文獻(xiàn)】1陳希哲，林云鋒，喬鞠，等.人體脂肪基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及其成骨潛能J.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004,20(1):12-15.2余方圓，盧世璧，袁枚，等.兔脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗觀察J.中國臨床康復(fù)，2004,8(11):2042-2043.3劉桂英，楊立業(yè)，鄭佳坤，等.來源于脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化J.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2003,19(6):554-557.4鞠曉東，婁思權(quán)，田華，等.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性及向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗研究J.中華實(shí)驗外科雜志，2004,