白細(xì)胞介素18、血管內(nèi)皮生長因子-C及其受體3在大腸癌中的表達(dá)和在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的意義.doc

白細(xì)胞介素18、血管內(nèi)皮生長因子-C及其受體3在大腸癌中的表達(dá)和在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的意義作者：陳昊白玲張昶劉毅孟健【摘要】目的探討白細(xì)胞介素18（IL-18）、血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）及其受體3（VEGFR-3）在大腸癌中的表達(dá)意義及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化MaxVision快捷二步法檢測30例大腸癌組織中IL-18、VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)情況，并以10例正常黏膜和10例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織標(biāo)本做對照。結(jié)果IL-18、VEGF-C、VEGFR-3在大腸癌組織中的表達(dá)均明顯高于正常黏膜（P0.05）；IL-18及VEGF-C在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的表達(dá)也高于正常黏膜，且IL-18與VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)（P0.05）；VEGF-C在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組（P0.05）。結(jié)論大腸癌細(xì)胞可表達(dá)IL-18、VEGF-C、VEGFR-3，其表達(dá)與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；VEGF-C表達(dá)與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可作為判斷患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)?！娟P(guān)鍵詞】大腸癌；血管內(nèi)皮生長因子-C；血管內(nèi)皮生長因子受體3；白細(xì)胞介素18；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌Abstract：ObjectiveToinvestigatetheexpressionsofIL-18,VEGF-CandVEGFR-3inhumancolorectalcancerandtheirsignificanceinlymphaticmetastasis.MethodsImmunohistochemicalMaxVisionmethodwasusedtodetecttheexpressionofIL-18,VEGF-CandVEGFR-3in30specimensofcolorectalcancinoma,10normalmucosaand10lymphnodewithmetastaticcancer.ResultsTheexpressionsofIL-18,VEGF-CandVEGFR-3incolorectalcarcinomaweresignificantlyhigherthanthatinnormalmucosa(P<；0.05).IL-18andVEGF-Cwerehigherinmetastaticlymphnodesthaninnormalmucosa,withthetwoexpressionspositivelycorrelated(P0.05).TheexpressionofVEGF-Cwashigherinthelymphnodewithmetastaticcancerthaninthatwithout(P0.05).ConclusionColorectalcarcinomacellscanexpressIL-18,VEGF-CanditsreceptorVEGFR-3,theirhigherexpressionsarecorrelatedwiththecarcinogenesisanddevelopmentofcolorectalcarcinoma.ThehigherexpressionofVEGF-Ciscloselycorrelatedwithlymphaticinvolvement,andthuscouldbeusedasanimportantpredictivemarkerforlymphaticmetastasis.Keywords:colorectalneoplasm；interleukin18；vascularendothelialgrowthfactor-C；vascularendothelialgrowthfactorreceptor3；lymphnode；metastasis淋巴道轉(zhuǎn)移是大腸癌進(jìn)展的重要因素。淋巴管生成（lymphangiogenesis）作為淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機制，近年來越來越受到重視。新近研究表明，血管內(nèi)皮生長因子-C（vascularendothelialgrowthfactor-C,VEGF-C）可通過VEGF-C/VEGFR-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3)信號通路1介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化和淋巴管增生促進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移，被稱為淋巴管生成因子；白細(xì)胞介素18(interleukin-18,IL-18)是新近發(fā)現(xiàn)主要由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起效，具有抗感染、抗腫瘤、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)活性2。IL-18對淋巴管生成的作用，尚未見報道。我們采用免疫組化MaxVision快捷二步法檢測大腸癌組織中IL-18、VEGF-C（VEGFAb-3）和VEGFR-3(fms-liketyrosinekinase-4,Flt-4)的表達(dá)變化規(guī)律，并以正常大腸黏膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大腸癌組織對照，探討其表達(dá)意義及與淋巴道轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，旨在為大腸癌的分子靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料111研究對象選取我院外科2003年2007年間手術(shù)切除大腸癌組織標(biāo)本30例，術(shù)前未經(jīng)過任何放射或化學(xué)治療。患者年齡3081歲，平均（59.2314.77）歲，男23例、女7例。另選正常大腸黏膜10例和10例轉(zhuǎn)移性大腸癌淋巴結(jié)組織為對照。112試劑兔抗人IL-18濃縮型抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，VEGFAb-3及Flt-4為LabVision-NeoMarkers公司產(chǎn)品，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。1.2方法121免疫組化MaxVision檢測方法5m石蠟切片脫蠟和水化后；用PBS（pH7.4）沖洗3次；高壓鍋熱修復(fù)；每張切片加3%的過氧化氫1滴，室溫孵育10min；用PBS沖洗3次；每張切片分別加1滴抗體稀釋度為1100的IL-18、VEGFAb-3或Flt-4；4過夜；用PBS沖洗3次；每張切片加1滴即用型MaxVision試劑，室溫孵育1015min；用PBS（pH7.4）沖洗3次；每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察控制顯色時間；終止顯色后，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染；自來水沖洗返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇脫水干燥；二甲苯透明，中性樹膠封固。PBS代替一抗做陰性對照。122結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡下觀察細(xì)胞，在胞質(zhì)出現(xiàn)定位明確、染色明顯的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。按陽性細(xì)胞比例，組織蛋白表達(dá)強度分為以下幾級：無細(xì)胞著色為（-）；陽性細(xì)胞數(shù)25%為（+）；陽性細(xì)胞數(shù)在25%50%為（+）；陽性細(xì)胞數(shù)50%為（+）。組織染色（+）（+）者定為高表達(dá)組，（+）者定為低表達(dá)組,（-）為陰性。13統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS10.0軟件統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較采用2檢驗之Fisher確切概率法；相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析；P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果21IL-18、VEGF-C、VEGFR3的表達(dá)情況211IL-18表達(dá)情況IL-18陽性顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1），正常大腸黏膜組織的陽性表達(dá)率為40%（4/10），4例均為低表達(dá)，占100%；大腸癌組織中的陽性表達(dá)率為96.67%（29/30），低表達(dá)占30%，高表達(dá)占70%；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的陽性率為100%（10/10），低表達(dá)占40%，高表達(dá)占60%。IL-18在大腸癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（2=0.333,P=1.000），并以高表達(dá)為主；但均高于正常黏膜，且有統(tǒng)計學(xué)意義（2=16.264,P=0.000；2=8.143,P=0.011）。圖1IL-18在大腸癌組織的陽性表達(dá)（免疫組化，200）212VEGF-C表達(dá)情況VEGF-C陽性顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2）。正常大腸黏膜組織的陽性表達(dá)率為30%（3/10），3例均為低表達(dá)，占100%；大腸癌組織中的陽性表達(dá)率為80%（24/30），低表達(dá)組占40%，高表達(dá)占60%；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的陽性率為100%（10/10），均為低表達(dá)。VEGF-C在大腸癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（2=2.294,P=0.307），在大腸癌組以高表達(dá)為主，在后者全部低表達(dá)；但兩者均高于正常黏膜，且有統(tǒng)計學(xué)意義（2=8.333,P=0.006；2=10.231,P=0.003）。213VEGFR-3的表達(dá)情況VEGFR-3陽性顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)（圖3）。正常大腸黏膜組織的陽性表達(dá)率為30%（3/10），3例均為低表達(dá)，占100%；大腸癌組織中的陽性表達(dá)率為96.67%（29/30），低表達(dá)占10%，高表達(dá)占90%；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的陽性率為60%（6/10），低表達(dá)占100%。VEGFR-3在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織和正常黏膜，且有統(tǒng)計學(xué)意義（2=8.989，P=0.010；2=20.312，P=0.000）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的陽性表達(dá)率與正常黏膜差異無統(tǒng)計學(xué)意義（2=1.727，P=0.370）。圖2VEGF-C在大腸癌組織的陽性表達(dá)（免疫組化，200）圖3VEGFR-3在大腸癌組織的陽性表達(dá)（免疫組化，200）22IL-18、VEGF-C及VEGFR3在大腸癌組織表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系鑒于在大腸正常黏膜組織中觀察到三者均有（+）的低表達(dá)，將與臨床病理特征的關(guān)系用高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行統(tǒng)計分析，詳見表1。三者表達(dá)強度與性別、年齡、組織分化、組織類型、組織分期均無關(guān)（P0.05）。IL-18、VEGFR3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)強度雖高于無轉(zhuǎn)移組，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。VEGF-C在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組，且有統(tǒng)計學(xué)意義（2=5.438，P=0.024）。23大腸癌組織中IL-18、VEGF-C及VEGFR-3三者之間表達(dá)的相互關(guān)系在21例IL-18高表達(dá)組織中VEGF-C高表達(dá)16例、低表達(dá)5例；9例IL-18低表達(dá)組織中其高表達(dá)2例，低表達(dá)7例；兩者表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.505，P=0.004）。在18例VEGF-C高表達(dá)組織中VEGFR-3高表達(dá)16例，低表達(dá)2例；12例VEGF-C低表達(dá)組織中其高表達(dá)11例，低表達(dá)1例；兩者表達(dá)無明顯相關(guān)（r=0.045，P=0.812）。在27例VEGFR3高表達(dá)組織中IL-18高表達(dá)19例、低表達(dá)8例；3例VEGFR-3低表達(dá)組織中其高表達(dá)2例，低表達(dá)1例；兩者表達(dá)無明顯相關(guān)（r=0.024，P=0.899）。表1大腸癌組織IL-18、VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（略）注：2值為(-)和(+)與(+)比較,*P<；0.053討論腫瘤轉(zhuǎn)移通常是人類癌癥致死的主要原因，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中血管內(nèi)皮生長因子及其受體家族發(fā)揮了重要的作用。目前認(rèn)為，VEGF家族可通過VEGF/VEGFR-1途徑誘導(dǎo)血管生成，VEGF-C/D與VEGFR-2結(jié)合可誘導(dǎo)血管的生成，而通過VEGFR-3與VEGF-C/D結(jié)合途徑誘導(dǎo)淋巴管生成3。雖然VEGF-C/D在誘導(dǎo)淋巴管或血管生成中的選擇性作用機制還不是十分明確，但阻斷VEGFR-3信號通路可能是抑制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的途徑之一。本實驗結(jié)果顯示大腸癌組織中VEGFR-3的陽性率高于正常黏膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織（P0.05），且處于高表達(dá)狀態(tài)；而VEGF-C在大腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常黏膜（P0.05）；VEGFR-3在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組的表達(dá)強度雖高于無轉(zhuǎn)移組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。VEGF-C在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組，且有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。表明VEGFR-3和VEGF-C均參與了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，VEGF-C在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。提示阻斷VEGF-C/VEGFR-3信號通路，可減緩大腸癌的發(fā)展；VEGF-C可作為大腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子。眾所周知，機體的免疫狀態(tài)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。IL-18是新近發(fā)現(xiàn)的-干擾素誘導(dǎo)因子,可通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起效,并能抑制腫瘤血管的形成,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用4。另有研究報道，IL-18在腫瘤免疫中有可能與IL-2發(fā)揮協(xié)同作用，誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IL-13，促使Th2分化，從而影響機體細(xì)胞免疫狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移5，在胃癌6、結(jié)腸癌7患者術(shù)前血清中IL-18水平明顯高于正常對照組。本實驗結(jié)果顯示，大腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中IL-18陽性表達(dá)率明顯高于正常黏膜（P0.05），癌組織中有70%的高表達(dá)，但與臨床病理特征無關(guān)，與VEGF-C的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（P0.05）；表明大腸癌時細(xì)胞中IL-18的表達(dá)升高，影響機體細(xì)胞免疫功能狀態(tài),參與大腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。本實驗中3種蛋白均可觀察到細(xì)胞核中有表達(dá)的現(xiàn)象,經(jīng)與試劑公司溝通交流后,排除緩沖液pH值的影響，考慮可能為抗體稀釋度較高的原因所致?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1MandriotaSJ,JussilaL,JeltschM,etal.Vascularendothelialgrowthfactor-C-mediatedlymphangiogenesispromotestumormetastasisJ.EMBOJ,2001,20(4):672-682.2UshioS,NambaM,OkuraT,etal.CloningofthecDNAforhumanIFN-inducingfactor,expressioninEscherichiacoli,andstudiesonth