TNP┐470對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用.doc

TNP470對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用【關(guān)鍵詞】結(jié)腸腫瘤關(guān)鍵詞:TNP-470；Lovo細(xì)胞；脫噬作用；結(jié)腸腫瘤摘要:目的探討TNP-470對(duì)體內(nèi)外人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.方法采用MTT法檢測(cè)TNP-470對(duì)體外培養(yǎng)的Lovo細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用.建立結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，16只裸鼠平均分為治療組（TNP-47030mgkg-1）和對(duì)照組（相同體積的生理鹽水），4wk后處死裸鼠，測(cè)量腫瘤體積.腫瘤組織行病理學(xué)檢查，采用HE染色和TUNEL原位末端標(biāo)記術(shù)檢測(cè)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況.結(jié)果TNP-470作用72h，明顯抑制體外培養(yǎng)的Lovo細(xì)胞的生長(zhǎng)，IC50為55.8gL-1.TNP-470顯著抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，治療組腫瘤體積為（73140）mm3，對(duì)照組為（134538）mm3，（P<；0.01）.治療組Lovo細(xì)胞凋亡率為（21.42.1）%，對(duì)照組為（7.51.5）%，（P<；0.001）.結(jié)論TNP-470能夠抑制結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān).Keywords:TNP-470；Lovocells；apoptosis；colonicneo-plasmsAbstract:AIMTostudytheeffectofTNP-470onthegrowthofhumancoloncancercellline，Lovocells，invitroandinvivo.METHODSGrowthinhibitoryeffectofTNP-470onLovocellswasexaminedbyanMTTassay.Humancoloncancerxenograftswastransplantedinto16nudemice.TNP-470（30mg/kg）orthesamevolumeofsalinesolutionwasadministeredonalternativedaystarting1daysaftertu-morimplantation.Miceweresacrificedafter4weeksandtu-morswereprocessedforhistologicalexamination.Inboththetreatmentandcontrolgroups，tumorvolumeswerecountedandapoptosesofLovocellsweremeasuredusingHEstainingandTdT-mediatedbiotinyated-dUTPnickendlabeling（TUNEL）method.RESULTSInvitro，TNP-470inhibitedthegrowthofLovocells，withitsIC50at55.8gL-1.Invivo，tumorvolumes（134538）mm3vs（73140）mm3，P<；0.01）weresignificantlyreducedintheTNP-470groupcomparedwiththecontrolgroup.Apoptosisindexes（AI）ofLovocellswerestatisticallydifferentbetweenthetwogroups（21.42.1）%vs（7.51.5）%，P<；0.001）.CONCLUSIONTNP-470isapotentagenttoinhibittumorgrowthofcoloncancerinvitroandinvivoandthisinhibitoryeffectmaybeassociatedwithapoptosis.0引言血管生成抑制劑TNP-470通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，進(jìn)而抑制腫瘤新生血管形成.TNP-470還能抑制體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)于TNP-470抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，研究結(jié)果不盡相同.我們通過(guò)MTT法檢測(cè)TNP-470對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，采用裸鼠皮下移植瘤模型，觀察TNP-470對(duì)移植瘤生長(zhǎng)及Lovo細(xì)胞的凋亡的影響，探討TNP-470抗瘤作用的機(jī)制.1材料和方法1.1材料雌性4wk齡BABL/c裸鼠，體質(zhì)量1722g，第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供.結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株由第一軍醫(yī)大學(xué)消化研究所傳代保存.RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、新生小牛血清等均購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購(gòu)自基因公司.TNP-470由日本大阪Takeda化學(xué)公司HiroshiFukui博士惠贈(zèng).1.2方法1.2.1Lovo細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)TNP-470對(duì)LOVO細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率.將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lovo細(xì)胞置96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，48h后實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的TNP-470（510-45105gL-1），每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照孔加入相同體積不含TNP-470的RPMI1640培養(yǎng)基，并設(shè)空白對(duì)照孔（無(wú)細(xì)胞，僅含RPMI1640培養(yǎng)基）.培養(yǎng)72h后，每孔加入MTT（5gL-1）20L，37反應(yīng)4h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入150L二甲亞砜（DMSO），充分溶解后在Bio-Rad550型酶標(biāo)儀570nm下測(cè)吸光度（A）值.按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組平均A-實(shí)驗(yàn)組平均A）/（細(xì)胞對(duì)照組A-空白對(duì)照組A）100%.1.2.2皮下移植瘤抑制實(shí)驗(yàn)收集培養(yǎng)3d的Lovo細(xì)胞，生理鹽水制成懸液，用1.0mL微量注射器將0.2mL細(xì)胞懸液（51065107）注入2只裸鼠頸部皮下.注射前注射部位消毒，4d后重復(fù)接種1次.當(dāng)接種部位腫瘤長(zhǎng)至1520mm時(shí)，無(wú)菌條件下取材.將腫瘤組織剪成1.52.0mm小塊，置于生理鹽水中備用.裸鼠以20gL-1氯胺酮0.20.3mL麻醉成功后，乙醇消毒接種部位皮膚，將切好的腫瘤組織塊置于18號(hào)套管針口，分批接種于裸鼠背部皮下.16只裸鼠隨機(jī)分成2組，兩組裸鼠體質(zhì)量差異無(wú)顯著性.手術(shù)當(dāng)天給藥，TNP-47030mgkg-1，sc，qod，對(duì)照組給相同體積的生理鹽水.接種30d后斷頸處死裸鼠，測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率.將腫瘤組織于40gL-1中性甲醛固定24h，石蠟包埋，連續(xù)切片（4m），常規(guī)HE染色及TUNEL標(biāo)記染色.抑瘤率（%）=（對(duì)照組腫瘤體積-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積）/對(duì)照組腫瘤體積100%.1.2.3TUNEL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞TUNEL染色具體步驟如下:切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水至水化，滴加20mgL-1蛋白酶K，室溫消化15min，去離子水洗5min2，30mLL-1過(guò)氧化侵氫甲醇液中室溫下封閉10min，0.05molL-1PBS洗5min2，向組織片滴加平衡緩沖液，室溫下孵育60min，濾紙吸取標(biāo)本周?chē)后w，迅速滴加TdT酶，置濕盒中37孵育60min，室溫下切片入終止緩沖液中振蕩孵育10min，0.05molL-1PBS洗2min3，滴加過(guò)氧化物酶，室溫下濕盒中孵育30min，0.05molL-1PBS洗2min4，DAB顯色510min，甲基綠復(fù)染10min，脫水、透明、封片.以0.05molL-1PBS替代TdT酶作為陰性對(duì)照.結(jié)果判定:以細(xì)胞核陽(yáng)性為標(biāo)準(zhǔn)，凋亡細(xì)胞呈棕黃色細(xì)顆粒狀或彌散性，散在或簇狀分布于腫瘤組織中，個(gè)別者核膜增厚，呈棕黃色染色.結(jié)合HE染色，選擇無(wú)細(xì)胞壞死的5個(gè)視野或HE染色證實(shí)為壞死的細(xì)胞不計(jì)數(shù)，采用德國(guó)KontronIBAS2.5型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)1000個(gè)以上細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率作為凋亡指數(shù)（apoptosisindex，AI），取5個(gè)視野AI均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，采用Spss10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析.2結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)及MTT檢測(cè)隨著TNP-470濃度的增加，梭形Lovo細(xì)胞逐漸變小變園，間隙增寬，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，折光度下降，培養(yǎng)48h后未見(jiàn)細(xì)胞密度明顯增加，大部分細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng)，少部分漂浮于培養(yǎng)液中.從Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線可以看出，TNP-470的抑制作用存在量效倚賴(lài)關(guān)系，回歸分析得出72h的IC50為55.8gL-1（Fig1）.圖1略2.2腫瘤體積兩組裸鼠皮下移植瘤在移植12d后生長(zhǎng)明顯，但TNP-470組腫瘤在20d后生長(zhǎng)幾乎處于停滯狀態(tài)，體積未見(jiàn)明顯增加.最終對(duì)照組皮下瘤體積為（134538）mm3，TNP-470組為（73140）mm3，兩組腫瘤體積差異有顯著意義（P<；0.01），抑瘤率達(dá)45.6%（Fig2）.2.3TUNEL染色結(jié)果對(duì)照連續(xù)切片HE染色（Fig3A），鏡下凋亡細(xì)胞TUNEL染色表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色染色.陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在凋亡細(xì)胞內(nèi)呈不均勻分布，近核膜處著色較深，核中央著色較淺，核固縮則染色質(zhì)呈塊狀集聚.有的細(xì)胞核固縮不明顯，整個(gè)細(xì)胞呈淺棕黃色，可能是細(xì)胞處于凋亡早期，未凋亡細(xì)胞的胞核為藍(lán)綠色（Fig3B）.治療組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（21.42.1）%，對(duì)照組為（7.51.5）%，差異有顯著意義（P<；0.001）.圖2略3討論目前研究表明，血管生成是惡性腫瘤迅速生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散的主要條件之一1.惡性腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的血管依賴(lài)性也提示:通過(guò)抑制腫瘤的血管生成可以有效的防治腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移2.結(jié)直腸癌是消化道常見(jiàn)腫瘤，自20世紀(jì)70年代以來(lái)，結(jié)直腸癌發(fā)病率在我國(guó)逐漸上升3.我們利用血管抑制劑TNP-470觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸癌的治療效應(yīng).實(shí)驗(yàn)表明，TNP-470對(duì)體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用，抑制作用呈量效依賴(lài)關(guān)系.Yakmamoto等4觀察到TNP-470可誘導(dǎo)5種乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231，T-47D，MCF-7，KPL-1，MKL-F）凋亡，并檢測(cè)到促凋亡蛋白Bax，Bcl-xS表達(dá)明顯增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2，Bcl-xL的表達(dá)顯著下降.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，TNP-470抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，腫瘤細(xì)胞凋亡顯著增加5，6.因此TNP-470的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)是通過(guò)抑制腫瘤血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡雙重作用實(shí)現(xiàn)的.我們采用TUNEL染色法檢測(cè)腫瘤組織中Lovo細(xì)胞的凋亡情況，鏡下觀察到TNP-470組有大量的腫瘤細(xì)胞核被染成棕黃色，凋亡細(xì)胞在腫瘤組織中彌散分布，而HE對(duì)照染色典型凋亡細(xì)胞較少，可能是部分細(xì)胞處于凋亡早期.我們結(jié)果表明，TNP-470對(duì)體內(nèi)外結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，該作用可能與TNP-470誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡有關(guān).實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示:對(duì)于血管形成期的腫瘤，TNP-470可通過(guò)抗血管生成作用抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移.圖3略參考文獻(xiàn):1LiuDH，ZhangXY，HuangXY，F(xiàn)anDM.Constructionofeu-karyoticexpressionvectorofVEGF165geneanditseffectononcogenesisofhumangastriccarcinomaJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2001；22（9）:813-816.2LiuDH，ZhangXY，HuangXY，F(xiàn)anDM.VEGF165antisensegeneandbiologicalcharacteristicsofhumangastriccancercellsJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2001；22（9）:821-824.3ShaoLN，LaiMD.MutagensensitivityincolorectalcancerJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；21（1）:72-75.4YamamotoD，KiyozukaY，AdachiY，TakadaH，HiokiK，TsuburaA.Synergisticactionofapoptosisinducedbyeicos-apentaenoicacidandTNP-470onhumanbreastcancercellsJ.BreastCancerResTreat，1999；55（2）:149-160.5TakeiH，LeeES，CisnerosA，JordanVC.Effectsofangiogen-esisinhibitorTNP-470ontamoxife