中藥微生物轉(zhuǎn)化的研究.doc

中藥微生物轉(zhuǎn)化的研究 吳思 （湖北職業(yè)技術(shù)學院，湖北孝感432100） 基金項目：湖北職業(yè)技術(shù)學院校級課題（xxB06）。 微生物轉(zhuǎn)化中藥是指利用微生物產(chǎn)生的酶系作用于中藥底物,以期產(chǎn)生新的活性成分,提高中藥藥效,降低中藥不良反應(yīng),去除中藥中的大分子雜質(zhì)和將其作為研究藥物代謝機制的輔助手段。由于其具有周期短、成本低、區(qū)域和立體選擇性強、反應(yīng)條件容易控制、對周圍環(huán)境影響小等特點,且能夠產(chǎn)生一些化學法難以生成的產(chǎn)物,因此近年來,微生物轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)受到研究者的廣泛重視,并正迅速地發(fā)展。通過先導化合物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化方法尋找新的高活性、低毒性的藥物已成為有效開發(fā)新藥的一條途徑。 微生物轉(zhuǎn)化中藥的本質(zhì)是利用微生物體系產(chǎn)生的酶對外源性中藥底物進行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的生物化學過程1。微生物轉(zhuǎn)化中藥具有以下特點:(1)微生物轉(zhuǎn)化酶系廣泛。微生物在生長過程中會產(chǎn)生多樣的酶系,如纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等,目前已發(fā)現(xiàn)了3000余種能催化各種化學反應(yīng)的酶2。微生物豐富而強大的酶系構(gòu)成了高效生物催化體系的核心,且微生物的酶系所催化的反應(yīng)很多是一些化學合成難以進行的反應(yīng)。(2)反應(yīng)選擇性強。具體來講主要包括化學選擇性、非對映異構(gòu)體選擇性、區(qū)域選擇性、面選擇性、對映異構(gòu)體選擇性以及立體選擇性3,同時微生物轉(zhuǎn)化修飾中藥底物某一基團時對不需要轉(zhuǎn)化的基團無需保護,顯示出極高的選擇性。(3)反應(yīng)條件溫和。由微生物所介導的轉(zhuǎn)化反應(yīng)一般都在常溫、常壓下進行,運行操作的設(shè)備也比較簡便,產(chǎn)生的公害少,一般不造成環(huán)境污染,后處理也很簡單。中藥底物在轉(zhuǎn)化過程中可以最大限度地保護中藥中活性成分免遭破壞,可有效解決中藥在煎、煮、蒸、浸等傳統(tǒng)工藝中活性成分難以最大限度提取的難題。(4)優(yōu)化條件可使轉(zhuǎn)化率提高。微生物轉(zhuǎn)化中藥底物的過程中易受到底物溶解度低,底物和產(chǎn)物抑制微生物酶活性和產(chǎn)物進一步降解等影響。為了提高轉(zhuǎn)化率,可以從誘導物和底物的添加,表面活性劑的添加,碳源、氮源、無機鹽,微量元素和酶的抑制劑以及微生物細胞和酶的固定化,反應(yīng)體系等方面進行選擇優(yōu)化。此外,微生物轉(zhuǎn)化中藥的反應(yīng)可以被看作微生物發(fā)酵過程,所以可以連續(xù)進行。同時由于設(shè)備和原料簡單易得,生產(chǎn)成本較低,可進行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。 很多菌種都能使多種化合物發(fā)生不同的反應(yīng),這些菌種主要是霉菌、酵母菌和細菌,其中又以霉菌在文獻中特別常見。微生物轉(zhuǎn)化主要涉及了羥基化、環(huán)氧化、脫氫、加氫、水解、酯化、脫水等各類化學反應(yīng),還有些代謝產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生了很復(fù)雜的化學反應(yīng),人們可以通過這些反應(yīng)尋找新的有藥用價值的衍生物,也可以尋找使這些反應(yīng)發(fā)生的微生物的酶,進而用于工業(yè)化生產(chǎn)。本文將從微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)類型展開討論，闡述微生物對中藥的生物轉(zhuǎn)化作用。 1羥基化 20世紀50年代首次用黑根霉(Rhizopusnigricans)將黃體酮轉(zhuǎn)化為11-羥基黃體酮,使人們開始意識到微生物轉(zhuǎn)化在制藥工業(yè)中的重要性,從此微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥物工業(yè)生產(chǎn)中成為不可或缺的一種方法。羥基化是微生物轉(zhuǎn)化中最常見也最重要的一種反應(yīng),羥基化反應(yīng)可以發(fā)生在多個位置,生成多種有意義的衍生物。尤其是甾體藥物,特別是位的羥基化產(chǎn)物,在甾體制藥工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。比如甾體的7-羥基化衍生物可以用于利尿劑的生產(chǎn),但用化學方法合成很困難,文獻4報道利用菌種Botrytiscinerea使睪丸激素等幾種甾體化合物生成7-羥基衍生物,研究發(fā)現(xiàn)在不同孵化期轉(zhuǎn)化的甾體化合物不同，經(jīng)過5天的孵化主要代謝物是第7-hydroxytestosterone（76收益率），經(jīng)過6天的孵化主要代謝物是7-羥基-17-甲基睪酮（82收益率），經(jīng)過6天（以及孵化后10天）的主要代謝產(chǎn)物是10-羥基-19-去甲雄基-4-烯-3,17-二酮（78收益率），經(jīng)過10天的孵化轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)品是14-羥基-1-脫氫睪酮（68收益率），經(jīng)過11天的孵化轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)品是7-羥基-1-脫氫-17-甲睪酮（52收益率），可以看出，菌種Botrytiscinerea能夠非常有效地使睪丸激素等幾種甾體化合物生成7-羥基衍生物，而且產(chǎn)量很高。 不僅是甾體化合物,其他化合物的羥基化代謝產(chǎn)物同樣具有重要的應(yīng)用意義。如ent-kaur16-en-19-oicacid,一種二萜類化合物,具有刺激植物生長的活性。利用菌種Rhizopusstolonifer轉(zhuǎn)化此化合物,7d后產(chǎn)生2種代謝產(chǎn)物,其中一種產(chǎn)物也是7位發(fā)生羥基化,該產(chǎn)物可以作為赤霉素生物合成和一種植物生長激素的中間體。 2脫氫反應(yīng) 脫氫反應(yīng),一般主要是指化合物脫氫生成雙鍵。氯化孕酮醋酸酯(chlormadinoneacetate),一種治療前列腺疾病的抗雄性激素藥品,文獻5用Arthrobactersimplex和Bacillussphaericus這2種菌使其發(fā)生了脫氫反應(yīng)生成雙鍵,反應(yīng)所得產(chǎn)物為脫氫氯化孕酮醋酸酯(delmadinoneacetate),這種產(chǎn)物不但和氯化孕酮醋酸酯一樣,是治療前列腺疾病的抗雄性激素藥品,還是合成乙酰環(huán)丙氯地孕酮(cyproteroneacetate)的前體,而乙酰環(huán)丙氯地孕酮因為有抗雄性激素的活性而被廣泛的用作孕激素藥品,它可以避孕和治療前列腺癌。文中研究了利用單節(jié)桿菌ATCC6946和球形芽孢桿菌ATCC13805自由和固定化細胞在液液兩相體系和脂質(zhì)體中對氯地孕酮醋酸酯的微生物轉(zhuǎn)化。對于液液兩相體系，正癸烷，正辛醇，氯仿和醋酸丁酯作為有機溶劑。脂質(zhì)體由氯地孕酮醋酸包埋在磷脂和膽固醇的脂質(zhì)體組成。對于這兩種生物催化劑固定化和自由懸浮，產(chǎn)量在水溶液中高于在液液兩相媒體。在所有情況下，水系統(tǒng)獲得的產(chǎn)量最高。在水介質(zhì)中，從單節(jié)桿菌懸浮液中3小時可以獲得48%的產(chǎn)率，從球形芽孢桿菌懸浮液中48小時可以獲得47%的產(chǎn)率。除了脫氫生成雙鍵,還有實驗發(fā)現(xiàn)6,利用RhodocouserythropolisDCL14可以使香芹醇脫氫生成香芹酮。 3支鏈的降解 利用微生物選擇性的使支鏈降解,可以得到有用的化合物中間體,這也是生物轉(zhuǎn)化在制藥及其他化工工業(yè)生產(chǎn)中的一大用處,具有非常廣闊的應(yīng)用前景。雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)和雄甾1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)就是生產(chǎn)性激素等甾體藥物的重要中間體,利用菌種Mycobacteriumsp.NRRLB-36837即可將膽固醇側(cè)鏈降解生成這2種化合物。文獻8同樣都以氫化可的松作底物,用不同菌種卻得到相似的結(jié)果,2個實驗都出現(xiàn)了支鏈降解產(chǎn)物。文獻9的實驗中得到的2種支鏈降解產(chǎn)物,一種與文獻8得到的產(chǎn)物相同,而另一種則是前者產(chǎn)物的17位羥基變成了酮基。如果這2個菌種都可以選擇性的降解氫化可的松類似物的支鏈,將可能找到更多的所需的中間體。 4酯化反應(yīng)和水解反應(yīng) 桉烷型化合物大部分都含有乙酸酯結(jié)構(gòu),在代謝過程中,雖然所用的菌種不同,但幾乎所有的底物都產(chǎn)生了酯基水解的代謝產(chǎn)物。而與水解反應(yīng)相對,作者也同樣發(fā)現(xiàn)乙酸酯化反應(yīng)也比較容易出現(xiàn)在代謝產(chǎn)物中10。在酯化反應(yīng)中,作者發(fā)現(xiàn)密葉辛木素(confertifolin),經(jīng)過轉(zhuǎn)化后生成2種代謝產(chǎn)物,其中主產(chǎn)物是3-羥基化密葉辛木素,而另一種代謝產(chǎn)物則是3-乙酸酯化密葉辛木素。很有可能這兩個產(chǎn)物是由一條代謝途徑來完成的,這一推測可能為合成有用的酯類化合物提供了捷徑。 5環(huán)氧化 環(huán)氧化反應(yīng)在轉(zhuǎn)化的過程中也很普遍,多發(fā)生在化合物的雙鍵部位,尤其在萜類中常見,除環(huán)氧化反應(yīng),雙鍵部位也很容易形成鄰二醇結(jié)構(gòu),沒藥醇11(-)-bisabolol一種單環(huán)倍半萜類化合物,它在Glomerellacingulata作用下生成的幾種代謝產(chǎn)物就是這一類反應(yīng)的典型代表。還有前面提到的ent-kaur-16-en-19-oicacid,其在培養(yǎng)15d后又出現(xiàn)一種代謝產(chǎn)物ent-16,17-dihydroxy-kauran-19-oicacid,這個代謝過程發(fā)生的化學反應(yīng)使16,17位雙鍵生成為（下轉(zhuǎn)第91頁）（上接第84頁）鄰二醇結(jié)構(gòu)。 參考文獻 RUANXiaodong,ZHANGHuiwen,CAIYingzhui,etal.ApplicationinbiotransformationofChinesemateriamedicabymicroorganismsJ.ChineseTraditionalandHerbalDrugs,xx,1(40). 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