慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者m1R93甲基化異常及其意義.doc

慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者m1R93甲基化異常及其意義 周毅任國(guó)敏楊聰慧任春霞孟慶鵬 【摘要】目的本研究旨在探討microRNA-9-3（miR-9-3）在慢性淋巴細(xì)胞性白血病骨髓細(xì)胞中的甲基化異常及其意義。方法采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）技術(shù)檢測(cè)8例正常骨髓組織、78例新確診的慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者和7種白血病細(xì)胞株甲基化水平。結(jié)果正常對(duì)照組miR-9-3呈未甲基化狀態(tài)；7種白血病細(xì)胞株中有5種呈未甲基化狀態(tài)（71.4%）；78例慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中65例呈miR-9-3甲基化，MSP陽(yáng)性率為83%。5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-AzaDc）處理白血病細(xì)胞株后I83-E95和WAC3CD5+細(xì)胞株miR-9-3呈未甲基化狀態(tài)。結(jié)論慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者存在miR-9-3表達(dá)受抑，可能與其基因甲基化異常有關(guān)。而miR-9-3甲基化在激活慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者NF-B1信號(hào)通路的作用值得進(jìn)一步研究。 【關(guān)鍵詞】慢性淋巴性白血病miR-9-3甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)5-氮雜-2-脫氧胞苷 【Abstract】ObjectiveThisstudyisaimtoexploretheabnormalexpressionofmicroRNA-9-3（miR-9-3）inchroniclymphocyticleukemiaanditssignificanceMethodMethylationofmiR-9-3wasstudiedineightcasesnormalbonemarrowtissue，seventy-eightdiagnosticchroniclymphocyticleukemiasamples，andsevenchroniclymphocyticleukemiacelllinesbymethylation-specificpolymera-sechainreaction（MSP）.ResultmiR-9-3wasunmethylatedinnormalcontrols，butmethylatedinfiveofsevenchroniclymphocyticleukemiacelllines（71.4%）.Amongthe78casewithchroniclymphocyticleukemia，65caseweredetectedmiR-9-3methylationandthepositiverateofMSPis83%.Whereas，miR-9-3showedanunmethylatedstatusinthelymphocyticleukemiacelllines，I83-E95andWAC3CD5+cellswith5-Aza-2-deoxycytidine（5-AzaDc）treatment.ConclusionTheunderexpressedofmiR-9-3mightberelativetoitsabnormalmethylation.TheroleofmiR-9-3methylationintheconstitutiveactivationofNFB1signalingpathwayinchroniclymphocyticleukemianeedstobefurtherstudy. 【Keywords】Chroniclymphocyticleukemia，MiR-9-3，Methylation-specificpolymerasechainreaction（MSP），5-Aza-2-deoxycytidine（5-AzaDc） 【Authorsaddress】DepartmentofClinicalLaboratory，ThePeoplesHospitalofShangZhi，Shangzhi，Heilongjiang，China，150601 doi：10.3969/j.issn.1671-332X.xx.10.005 DNA甲基化是指通過(guò)化學(xué)修飾在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將甲基（-CH3）基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤（CpG）二核昔酸胞嘧啶的5位碳原子上，導(dǎo)致5-甲基胞嘧啶的形成1。腫瘤抑制基因CpG島相關(guān)啟動(dòng)子的基因特異性DNA甲基化是眾多人類(lèi)腫瘤標(biāo)志物2-3。多個(gè)腫瘤抑制基因的甲基化涉及白血病，淋巴瘤和骨髓瘤的信號(hào)通路的失調(diào)，由此表明腫瘤抑制基因的甲基化在血液癌癥發(fā)病機(jī)制中的重要性4-6。值得注意的是，腫瘤抑制基因DNA甲基化在慢性淋巴細(xì)胞性白血病的發(fā)病或預(yù)后中發(fā)揮作用7。慢性淋巴細(xì)胞白血病是歐美成人最常見(jiàn)的白血病類(lèi)型，我國(guó)較少見(jiàn)，為主要源于B淋巴細(xì)胞的單克隆性小淋巴細(xì)胞疾病8。在本實(shí)驗(yàn)中，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）技術(shù)研究了miR-9-3的甲基化，旨在確定其在慢性淋巴細(xì)胞性白血病的致病作用。 1材料與方法 1.1研究對(duì)象 慢性淋巴細(xì)胞性白血病共78例，均內(nèi)蒙古牙克石市人民醫(yī)院。男51例（65.4），女27例（34.6），年齡3791歲，平均年齡65.0歲，經(jīng)診斷符合白血病FAB國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均為新診斷且未接受過(guò)放化療、誘導(dǎo)分化及骨髓移植等特殊治療。采集肝素抗凝骨髓12ml/份，收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞，于-80保存。8例正常供髓者單個(gè)核細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組（取自健康志愿者外周血B細(xì)胞CD19，N=3；取自健康志愿者外周血血漿，N=2；取自健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，N=3）。 1.2細(xì)胞株培養(yǎng) 人類(lèi)白血病細(xì)胞株CLL-AAT、MEC1、MEC2、I83-E95、WAC3CD5+、HG3和232B4由內(nèi)蒙古牙克石市人民醫(yī)院血液病科贈(zèng)送。細(xì)胞分別保存在含有10胎牛血清的RPMll640營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（含青霉素100U/ml和鏈霉素100ug/ml），置于320%O2、5%CO2、37培養(yǎng)箱培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每4872h用含有0.02%EDTA、0.01%胰蛋白酶的消化液消化后，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。 1.3甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP） 按照QIAampDNAMiniKit（QIAGEN，Germany）的操作步驟結(jié)合DNA/RNA提取儀（QIAcube）輸入程序即可快速抽提78例慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者骨髓標(biāo)本和7種慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株DNA，同樣方法提取8例正常對(duì)照提取DNA。每個(gè)樣品用兩組引物，其中一個(gè)針對(duì)修飾的甲基化DNA（M），另一個(gè)是針對(duì)修飾的未甲基化DNA（U）。重亞硫酸氫鹽處理：加入新鮮配制的20mmol/L氫醌12.6ul和4.8mol/L亞硫酸氫鈉（pH=5.0）320ul，PCR儀上進(jìn)行下面循環(huán)：5515min，9530s，一共20個(gè)循環(huán)。以EZDNAMethylationkit對(duì)基因組DNA進(jìn)行修飾。修飾后的DNA溶解于20ul的M-ElutionBuffer，反應(yīng)產(chǎn)物在20g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。 1.4MSP測(cè)序 首先應(yīng)用亞硫酸鈉對(duì)DNA進(jìn)行化學(xué)修飾，并用作模板，MSP檢測(cè)miR-9-3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA序列。將DNA中所有未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成為胸嘧啶（T），但有甲基化修飾的C經(jīng)亞硫酸鈉處理后仍保持為C。該步驟應(yīng)用EpiTectBisulfiteKit（QIAGEN，Germany），按照說(shuō)明書(shū)完成。使用PSQ檢測(cè)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。正向引物：5-GAAGGGGGTTGGGATTTGA-3；反向引物：5-ATTTCTCCCCTACTCCCC-3。 1.55-氮雜-2-脫氧胞苷（5-AzaDc）處理 取細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的I83-E95和WAC3CD5+細(xì)胞株，按照1106個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，5%CO2、37的條件下培養(yǎng)。用終濃度為0.5uM的5-AzaDc處理，每24h更換新鮮的5-AzadC，在第0天和第5天分別收獲細(xì)胞。 1.6Westernblot檢測(cè)NF-B1 I83-E9548細(xì)胞株轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。加入RIPA裂解液（50mM的Tris-HCl，pH=7.4，150mM氯化鈉，0.2SDS，1TritonX-100，2mMEDTA），Bradford法測(cè)定蛋白濃度，取20ug蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳完畢后，PAGE膠上的蛋白用Bio-Rad微型電轉(zhuǎn)移至0.2um的硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜加入NF-B1，4下孵育24h，然后將膜洗滌，加入抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗，室溫下反應(yīng)1h洗膜，曝光，X-膠片經(jīng)顯影、定影后掃描記錄。以Anti-actin為內(nèi)對(duì)照。 2結(jié)果 2.1慢性淋巴細(xì)胞性白血病miR-9-3的MSP結(jié)果 78例慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中65例miR-9-3甲基化，MSP陽(yáng)性率為83%（見(jiàn)圖1）；所有8例正常對(duì)照組（N1至N8）miR-9-3全部呈未甲基化狀態(tài)（見(jiàn)圖2）；7種慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株miR-9-3甲基化表達(dá)譜顯示：I83-E95和WAC3CD5+細(xì)胞株顯示miR-9-3完全甲基化，232B4，CLL-AAT和HG3部分甲基化，而MEC1和MEC2完全未甲基化（見(jiàn)圖3）。miR-9-3MSP產(chǎn)物序列分析顯示，與miR-9-3原序列相比，除了甲基化的C外，所有的C均被轉(zhuǎn)化為T(mén)，而CpG位點(diǎn)中被甲基化的C未被轉(zhuǎn)化。說(shuō)明我們的轉(zhuǎn)化方案不僅是高效的，也是特異的（見(jiàn)圖4）。 2.25-AzaDc對(duì)miR-9-3甲基化程度的影響 結(jié)果表明，處理前I83-E95和WAC3CD5+細(xì)胞株miR -9-3呈甲基化狀態(tài)，而用5-AzaDc處理后，I83-E95和WAC3CD5+細(xì)胞株miR-9-3呈未甲基化狀態(tài)。 2.3轉(zhuǎn)染miR-9-3對(duì)I83-E9548細(xì)胞株NF-B1蛋白水平的影響 I83-E9548細(xì)胞株轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，提取細(xì)泡的蛋白，采用用Westernblot法來(lái)比較各組細(xì)胞內(nèi)NF-B1蛋白P105和P50的含量。轉(zhuǎn)染miR-9-3后NF-B1蛋白P105/50表達(dá)水平降低。如圖6所示，miR-9-3組與對(duì)照組相比NF-B1蛋白水平降低。 3討論 成熟的microRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約21-25nt的真核生物內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，它在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)堿基互補(bǔ)與相應(yīng)的信使RNA（mRNA）的3-非編碼區(qū)（3-URT）結(jié)合，使其降解或抑制其翻譯，在細(xì)胞的分化、增生、凋亡、個(gè)體發(fā)育及機(jī)體代謝中起著重要作用9，其功能是抑制其靶蛋白的表達(dá)10。在癌變過(guò)程中，miRNA可分為致癌基因和抑癌基因的miRNA9。最近研究表明，癌癥患者抑癌基因的miRNA異常DNA甲基化沉默。以往的研究還確定一些抑癌基因的miRNA甲基化參與慢性淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)病，其中包括了miR-203，miR-124-1，miR-181a/b，miR-107和miR-42410。 在人類(lèi)中，有三個(gè)獨(dú)立的miR-9基因（miR-9-1位于1號(hào)染色體上；miR-9-2位于5號(hào)染色體上；miR-9-3也位于5號(hào)染色體上）具有相同的miR-9序列。miR-9即可以是致癌基因的miRNA也可以是抑癌基因的miRNA，取決于癌癥或組織類(lèi)型11。例如，miR-9過(guò)表達(dá)已被證明能提高乳腺癌細(xì)胞或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移或侵襲，表現(xiàn)為致癌作用，反之，miR-9通過(guò)結(jié)合于3非翻譯區(qū)（3非編碼區(qū)）的NF-B1的mRNA，抑制NFB1翻譯卵巢腫瘤細(xì)胞，從而抑制細(xì)胞增殖，因此表現(xiàn)出腫瘤抑制功能。本實(shí)驗(yàn)主要研究miR-9獨(dú)立基因之一miR-9-3的甲基化。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在I83-E95細(xì)胞株miR-9-3完全甲基化導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少并且增強(qiáng)凋亡。 I83-E95和WAC3CD5+細(xì)胞株處理前二者均呈高甲基化狀態(tài)，而5-AzadC處理后都發(fā)生脫甲基化，呈未甲基化狀態(tài)。這些都說(shuō)明5-AzaDc具有誘導(dǎo)miR-9-3去甲基化的能力，這種能力可能與5-AzaD降低了miR-9-3表達(dá)有關(guān)。有人認(rèn)為5-AzaDc作用機(jī)制是先與靶基因結(jié)合，再與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，形成一個(gè)不可逆的復(fù)合體，從而阻斷甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。 有研究表明12，miR-9-3可以通過(guò)調(diào)控NF-B1蛋白抑制慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，miR-9-3在慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞中是低表達(dá)的，而增加miR-9-3可以抑制細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，另外miR-9-3直接作用于NF-B1的3UTR區(qū)，說(shuō)明NF-B1是慢性淋巴細(xì)胞性白血病中miR-9-3的重要的靶點(diǎn)，當(dāng)miR-9-3高表達(dá)時(shí)NF-B1的mRNA和蛋白都被抑制。在慢性淋巴細(xì)胞性白血病中是否也存在這種相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)想通過(guò)減弱或抑制miR-9-3的表達(dá)，觀察其對(duì)慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞NF-B1的表達(dá)，為下一步慢性淋巴細(xì)胞性白血病的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn) 1ESTELLERM.EpigeicsincancerJ.NEnglJMed，xx，358：1148-1159. 2CHIMCS，LIANGR，KWONGYL.HypermethylationofgenepromotersinhematologicalneoplasiaJ.HematolOncol，xx，20：167-176. 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