牛SPAG11D基因的原核表達及其抑菌活性研究.doc

牛SPAG11D基因的原核表達及其抑菌活性研究 胡修忠，凌明湖，王定發(fā)，程蕾，向敏，劉曉華，夏瑜 （武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢） 摘要：為了檢測重組蛋白的抑菌活性，提取牛睪丸組織總，經(jīng)擴增了基因，將該基因插入（）融合表達載體，并轉(zhuǎn)入（）進行原核表達，通過改變濃度和誘導(dǎo)時間優(yōu)化表達條件，并用瓊脂擴散法測定重組蛋白體外抑菌活性。結(jié)果顯示，成功擴增牛基因，產(chǎn)物大小為，其序列與公布序列相一致；正確構(gòu)建了原核表達載體（），重組蛋白最佳表達條件為終濃度、誘導(dǎo)時間為；表達產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為；該重組蛋白對霍亂弧菌具有明顯的體外抑菌活性。本研究成功構(gòu)建了?；虻脑吮磉_載體，并獲得了具有抑菌活性的重組蛋白。 關(guān)鍵詞：牛；原核表達；基因；抑菌作用 ：A：0439114（15）051135-04 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.027 ： 基金項目：武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院創(chuàng)新基金項目（） 作者簡介：胡修忠（），男，山東曹縣人，畜牧師，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作，（電話）（電子信箱）。 精子相關(guān)抗原（aa，）是精子膜上的一種蛋白，也是防御素的一種，由個相互獨立的防御素基因通過通讀轉(zhuǎn)錄連接到一起，主要在哺乳動物的睪丸、附睪和雄性生殖道中表達。被認為在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明帶的識別和精卵結(jié)合等事件中起到重要的作用。 雄性生殖系統(tǒng)的病原感染嚴重威脅其生殖和內(nèi)分泌功能，如沙眼衣原體可以引起附睪炎并阻礙附睪內(nèi)精子的運動。而蛋白能夠抵御病原微生物對機體生殖道的侵害。對人的各蛋白亞型研究表明，其端都具有抗菌活性，而且人的蛋白抗大腸桿菌活性遠大于該亞型端的抗菌活性，。此外還發(fā)現(xiàn)，獼猴的蛋白也具有抗菌活性。 目前認為在精子通過附睪的過程中參與精子的成熟。等發(fā)現(xiàn)大鼠附睪頭部的蛋白結(jié)合在精子的頭部，在附睪尾部的蛋白結(jié)合在精子頂體后部，這表明蛋白在精子通過附睪時對精子起一定的修飾作用，此外蛋白能夠提高未成熟精子的運動能力。 在牛體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)種蛋白亞型：、，它們存在于睪丸、附睪、輸精管上皮以及非生殖道組織中。余樹民等在牦牛生殖器官中也檢測到了這個亞型的表達。 材料與方法 試劑 試劑購自公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶、和限制性內(nèi)切酶均購自公司；連接酶購于公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；購自公司；異丙基硫代半乳糖苷（）購自公司；氨芐青霉素（）購自公司；丙烯酰胺、過硫酸銨、乙二胺四乙酸（）、十二烷基硫酸鈉（）等均為國產(chǎn)分析純試劑。 菌種和質(zhì)粒 、（）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；（）、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、大腸桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌為本實驗室保存。 試驗動物 剛出生的小公牛。 引物設(shè)計 根據(jù)上公布的?？咕涌贵w（）基因的核苷酸序列設(shè)計特異引物：，： 基因的克隆和測序 取小公牛睪丸和附睪組織，于液氮中保存。提取參照文獻的方法提取組織的總，以（）為引物反轉(zhuǎn)錄生成第鏈。以、為引物擴增基因。反應(yīng)體系（）如下：，模板，和（）各，聚合酶。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性；變性，退火，延伸，個循環(huán)；延伸；保存。產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳檢測。 用凝膠回收試劑盒回收基因的產(chǎn)物，連接于克隆載體，構(gòu)建質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司測序。 原核表達載體的構(gòu)建 用和雙酶切，再克隆到原核表達載體（）的和位點之間，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒（），轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，經(jīng)雙酶切鑒定篩選得到陽性克隆。 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及表達條件的優(yōu)化 將鑒定好的重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒（）分別轉(zhuǎn)化到（）感受態(tài)細胞中。挑取單菌落，接種到含的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜。取活化后的菌液加入到液體培養(yǎng)基中，、振蕩培養(yǎng)，當菌液為時，加入至終濃度，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別取誘導(dǎo)、和的菌液，離心，收集菌體，加入滅菌，再加入等體積加樣緩沖液，混勻，煮沸，電泳檢測重組蛋白的表達情況。 分別用不同的劑量（終濃度為、）和誘導(dǎo)時間（、）進行表達條件的優(yōu)化。優(yōu)化表達條件后，進行分離，經(jīng)考馬斯亮藍染色、數(shù)次脫色后拍照觀察結(jié)果。 抑菌活性測定 收集誘導(dǎo)表達的細菌，壓力破碎后離心收集上清液。利用瓊脂擴散法檢測重組蛋白的體外抑菌活性：金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、大腸桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌于液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)。調(diào)整菌液濃度為；再將菌液稀釋適當倍數(shù)。將稀釋后的菌液均勻涂布于平板上。待瓊脂表面水分干燥后，用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，吸取上清液至牛津杯中。平皿放置冰箱擴散，轉(zhuǎn)入溫箱中后觀察并測定抑菌圈的大小。 結(jié)果與分析 基因的擴增 基因的的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示大小約左右的片段，與預(yù)計的片段大小相符（圖）。 克隆載體的構(gòu)建及鑒定 將基因的產(chǎn)物連接于克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)雙酶切鑒定后測序。雙酶切結(jié)果如圖所示，測序結(jié)果與上發(fā)表的序列相一致。 表達載體的雙酶切鑒定 經(jīng)測序鑒定正確的克隆載體經(jīng)和雙酶切，克隆至原核表達載體（）上，構(gòu)建表達載體（），轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，經(jīng)雙酶切鑒定篩選得到陽性克?。▓D）。 原核表達產(chǎn)物的檢測及條件優(yōu)化 將含有質(zhì)粒（）陽性克隆菌分別在條件下經(jīng)誘導(dǎo)后，用對表達產(chǎn)物進行分析。誘導(dǎo)后在左右處有一明顯蛋白帶，與預(yù)期的大小相符，而未誘導(dǎo)菌沒有同樣大小的特征帶，說明目的基因成功表達（圖、圖）。誘導(dǎo)最佳時間為，誘導(dǎo)最佳濃度為。 重組蛋白抑菌活性測定 檢測了表達的重組蛋白在體外對霍亂弧菌、大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌性。結(jié)果顯示，重組蛋白對霍亂弧菌的生長有抑制作用（圖）。 討論 睪丸、附睪和精囊等生殖道的感染嚴重威脅雄性的生殖和內(nèi)分泌功能。泌尿生殖道微生物大多數(shù)為表皮葡萄球菌和棒狀桿菌，少數(shù)為革蘭陰性桿菌、大腸桿菌、支原體、衣原體等。其中大腸桿菌可引起的精子活動凝聚，使精子活力下降，從而影響生育。防御素是存在于哺乳類動物體中的抗微生物肽，在天然免疫過程中起到重要的作用，而且對機體無毒副作用。蛋白是防御素的一種，對人、猴的研究表明一些蛋白亞型對大腸桿菌、奈瑟菌、腸球菌和葡球菌具有很好的殺傷能力。本研究表達的融合蛋白對霍亂弧菌具有明顯的生長抑制現(xiàn)象，表明牛蛋白具有抗菌活性，與其他物種具有類似的抗菌功能。牛蛋白可能在抵御病原菌侵害雄性生殖道方面發(fā)揮重要的作用。 在精子成熟過程中可能起到重要的作用，未成熟精子不具有運動能力，等發(fā)現(xiàn)大鼠附睪中未成熟精子與附睪上皮細胞或能表達（）的小腸上皮細胞共同培養(yǎng)后具有了運動能力，而加入抗體后，未成熟精子不具有運動能力；此外還發(fā)現(xiàn)，精子的運動能力隨表達量的降低而下降。牛的存在于發(fā)育后期的精子細胞中，且在精子細胞的尾部，與大鼠相類似，可能與精子的運動能力相關(guān)。 鑒于牛在抵御微生物對機體的侵害和生殖功能方面起到重要作用，本研究表達了牛融合蛋白，且具有很強的抑菌生物活性，而在生殖方面的功能將進一步分析研究。 參考文獻： ？魻，（）： 劉新顏，李建斌，仲躋峰，等精子相關(guān)抗原（）基因研究進展畜牧與獸醫(yī)，（）： ，：P，（）： ，（）： ，？魧，（）： ，（）：I，（）： ，（）： ，（）（），（）： 余樹民，李計尚，張