DB33T624-2006動(dòng)物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法.docVIP

GB/T DB33浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2007-01-14實(shí)施2006-12-14發(fā)布動(dòng)物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法Determination of the residues of terbutaline, clenbuterol, salbutamoland ractopamine in animal tissuesGas chromatography-mass spectrometry methodDB33/T 6242006浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 67.120C 536DB33/T 6242006前 言本標(biāo)準(zhǔn)是在參閱了國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)我國技術(shù)發(fā)展水平研究制定的，建立了氣相色譜-質(zhì)譜法測定動(dòng)物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等4種2-興奮劑殘留的方法。本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心、浙江省疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳慧華、應(yīng)永飛、吳平谷、任玉琴、陸春波、陳勇、周文海、林仙軍、趙永信。I動(dòng)物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）法測定動(dòng)物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等4種2-興奮劑殘留量的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于畜禽肌肉、肝臟、肺、腎等組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等4種2-興奮劑殘留量的測定。本方法檢測限為：特布他林1.0g/kg、克倫特羅2.0g/kg、沙丁胺醇1.0g/kg、萊克多巴胺2.0g/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 方法原理試樣加入內(nèi)標(biāo)物后，用甲醇提取和離子交換固相萃取柱凈化，氮?dú)獯蹈桑cN，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）進(jìn)行衍生化反應(yīng)，于氣相色譜質(zhì)譜儀上進(jìn)行測定。內(nèi)標(biāo)法定量。 4 試劑和溶液所有試劑，如未注明規(guī)格，均指分析純；所有實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水，應(yīng)符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定。4.1 甲醇4.2 乙酸乙酯：色譜純4.3 氨水4.4 鹽酸4.5 0.2mol/L鹽酸溶液：取鹽酸（4.4）9mL，加水至500mL，搖勻，即得。4.6 30mmol/L鹽酸溶液：取0.2mol/L鹽酸溶液（4.5）15mL，加水至100mL，搖勻，即得。4.7 無水硫酸鈉：450干燥12h，備用。4.8 正己烷4.9 甲苯：色譜純4.10 衍生劑：N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）4.11 4氨水/乙酸乙酯溶液：取氨水（4.3）4mL加乙酸乙酯（4.2）至100mL，超聲15min，充分混勻，即配即用。4.12 SLS陽離子交換固相萃取柱1)：每根柱填料量為400mg，柱體積5mL。4.13 標(biāo)準(zhǔn)品：特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，純度98%。4.14 同位素內(nèi)標(biāo)物：D9-克倫特羅100g/mL，D3-沙丁胺醇100g/mL。4.15 2-興奮劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（4.13）10mg，1)SLS陽離子交換固相萃取柱是由杭州富裕科技服務(wù)有限公司提供的產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了給本標(biāo)準(zhǔn)的使用者提供方便，而不是主管部門對這一產(chǎn)品的認(rèn)可。精密稱定，分別置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，其濃度均為0.1mg/mL，置-20以下冰箱中保存，有效期為6個(gè)月。4.16 2-興奮劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取適量的2-興奮劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（4.15）于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成含特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺均為1.0g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置48冰箱中保存，有效期為1個(gè)月。4.17 2-興奮劑內(nèi)標(biāo)工作液：分別準(zhǔn)確吸取適量的2-興奮劑同位素內(nèi)標(biāo)物（4.14）于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成含D9-克倫特羅、D3-沙丁胺醇均為1.0g/mL混合內(nèi)標(biāo)工作液，置48冰箱中保存，有效期為1個(gè)月。5 儀器設(shè)備5.1 氣相色譜-質(zhì)譜儀：配有電子轟擊（EI）源。5.2 離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速9000r/min或以上。5.3 組織絞碎機(jī)。5.4 組織勻漿機(jī)：最大轉(zhuǎn)速10000r/min或以上。5.5 分液漏斗：125 mL。5.6 具塞玻璃試管：5mL，10mL。5.7 渦旋混合器。5.8 分析天平：感量0.00001g，0.01g。5.9 超聲波清洗器。5.10 離心管：50mL，10mL。5.11 氮吹儀。5.12 移液器：量程20L200L，100L1000L。6 分析步驟6.1 試樣制備取有代表性的樣品，經(jīng)絞碎后，保存于-20冰箱中，備用。6.2 試樣提取稱取試樣5g（精確到0.01g），置于50mL離心管中，加2-興奮劑內(nèi)標(biāo)工作液（4.17）50L；加甲醇20mL，10000r/min以上均質(zhì)60s，加蓋，于60超聲波清洗器中超聲20min；取出離心管，冷卻后8000r/min離心10min，傾出上清液至分液漏斗中，另取甲醇10mL重復(fù)提取一次，合并上清液；加正己烷20mL脫脂一次，分離甲醇相，在60下氮?dú)獯抵?mL以下；加0.2mol/L鹽酸（4.5）3mL，充分混勻后，在9000r/min離心10min，分出上清液，備用。6.3 試樣凈化依次用甲醇5mL、水5mL、30mmoL/L鹽酸溶液（4.6）5mL潤洗陽離子交換固相萃取柱（4.12），取6.2上清液過柱，棄去流出液，并依次用水5mL和甲醇5mL淋洗柱子，抽干；用4氨水/乙酸乙酯溶液（4.11）10mL洗脫，收集洗脫液，經(jīng)無水硫酸鈉（4.7）脫水，50氮?dú)獯蹈?；殘余物中加乙酸乙?mL，置于超聲波清洗器中超聲5min，5000r/min離心5min，分出上清液至5mL具塞玻璃試管中，50氮吹至干，吹干物備用。6.4 衍生化 吹干物加入甲苯（4.9）100L和衍生劑（4.10）100L，加塞后于渦旋混合器充分混勻，在805的烘箱中恒溫衍生60min，氮?dú)獯蹈?，加甲?.5mL溶解供GC-MS分析。另取2-興奮劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.16）適量，加2-興奮劑內(nèi)標(biāo)工作液（4.17）50L，加乙酸乙酯5mL后，氮?dú)獯蹈?，與樣品同步進(jìn)行衍生化。6.5 儀器測定6.5.1色譜條件 色譜柱：5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30 m0.25 mm0.25m)，或具同等性能的色譜柱；進(jìn)樣口溫度：280；柱溫程序：初溫120，保持3 min，然后以10min升至230，保持5min，再以10min升至280保持3min； 載氣：高純氦氣（99.999%）；流速：1.0mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：2.0L。6.5.2質(zhì)譜條件 EI源：源溫230； 電子能量：70eV； 接口溫度：280； 電子倍增器電壓：高于調(diào)諧電壓200V； 質(zhì)量掃描范圍：30550U；溶劑延遲：10min ；選擇離子監(jiān)測方式（SIM）。監(jiān)測離子（m/z）：特布他林86、356*、426；克倫特羅86*、262、243；沙丁胺醇369*、440、207；萊克多巴胺179、250*、502；D9-克倫特羅95*、262；D3-沙丁胺醇372*、443；其中帶*離子為定量離子，分三段進(jìn)行采集，特布他林、克倫特羅、D9-克倫特羅為第階段，沙丁胺醇、D3-沙丁胺醇為第階段萊克多巴胺第階段，詳見表1。在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流圖參見附錄A；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖參見附錄B。表1 4種2-興奮劑和2種內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜條件藥物名稱采集階段選擇離子（m/z）定量離子（m/z）特布他林356，86，426356克倫特羅86, 243, 26286D9-克倫特羅95，26295沙丁胺醇369，207，440369D3-沙丁胺醇372，443372萊克多巴胺250, 179, 5022506.5.3 氣相色譜-質(zhì)譜測定6.5.3.1 定性方法在相同試驗(yàn)條件下，樣品中待測物與同時(shí)檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間之差在2s之內(nèi)，并且所選擇的離子相對豐度比符合表2要求，可判定為樣品中存在該藥物殘留。表2 試樣離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)離子豐度比的允許偏差范圍占基峰相對豐度（）最大允許偏差（）501020501510202010506.5.3.2 定量方法以峰面積按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)定量，標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品液中藥物響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。以D9-克倫特羅（m/z 95）作為計(jì)算克倫特羅（m/z 86）和萊克多巴胺（m/z 250）濃度的內(nèi)標(biāo)物，以D3-沙丁胺醇（m/z 372）作為計(jì)算特布他林（m/z 356）和沙丁胺醇（m/z 369）濃度的內(nèi)標(biāo)物。7 結(jié)果計(jì)算按內(nèi)標(biāo)法單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)計(jì)算試樣中4種2-興奮劑的含量。試樣中4種2-興奮劑的含量按下式計(jì)算： AX D M式中：X試樣中2-興奮劑各組分的含量，g/kg；A試樣色譜峰對應(yīng)的2-興奮劑各組分的質(zhì)量，ng； M試樣質(zhì)量，g；D稀釋倍數(shù)；計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。8 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值與算術(shù)平均值之比應(yīng)不大于20。9 回收率本方法回收率在60130之間。124,563附錄A(資料性附錄) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流圖圖A.1 2-興奮劑和內(nèi)標(biāo)物衍生物的總離子流（TIC）圖1. 特布他林（