免疫學檢驗5凝集反應.ppt

如何鑒定ABO血型？,ABO血型的確認原則是什么？ 如何鑒定RBC上的血型抗原或血清中的血型抗體類型 ？ 采用凝集反應。,第五章 凝集反應 （agglutination）,一、定義 顆粒性抗原（或可溶性抗原與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后）與相應抗體發(fā)生特異性反應，在適當電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集塊。,第一節(jié) 凝集反應概述,二、發(fā)生機制 分兩階段進行。 特異性結(jié)合階段 抗原與相應抗體發(fā)生特異性結(jié)合。 速度快，不可見。 可見反應階段出現(xiàn)肉眼可見特異性凝集。 抗原抗體復合物進一步交聯(lián)聚集所致。 受到多種因素的影響。,二、發(fā)生機制 分兩階段進行。 特異性結(jié)合階段 抗原與相應抗體發(fā)生特異性結(jié)合。 速度快，不可見。 可見反應階段出現(xiàn)肉眼可見特異性凝集。 抗原抗體復合物進一步交聯(lián)聚集所致。 受到多種因素的影響。,抗原顆粒,抗體,NaCl,可見反應,抗原抗體復合物,圖注：,特異性結(jié)合,抗原抗體相對應,抗原顆粒,抗體,NaCl,可見反應,抗原抗體復合物,圖注：,特異性結(jié)合,抗原抗體相對應,三、影響因素 抗原因素： 顆粒性抗原 抗原表位數(shù)目等 抗體因素： 來源（多克隆抗體）、親和力、效價（含量）等。 IgM的凝集作用IgG。 不完全抗體：與相應抗原結(jié)合，但不形成可見的凝集現(xiàn)象。主要為小分子的IgG類抗體。,IgM抗體凝集細胞示意圖,IgG抗體凝集細胞示意圖,IgM,細胞,IgG,細胞,不完全抗體與相應顆?？乖Y(jié)合,RBC,7S的IgG,不凝集,+,三、影響因素,環(huán)境因素： 電解質(zhì)（生理鹽水） 酸堿度：避免酸凝集。 溫度：37。 抗原與抗體的適當比例 易出現(xiàn)抗體過量前帶抑制。,四、凝集反應的應用 抗原（ Ag）或抗體（ Ab ）的定性檢測 未知Ag（或Ab）已知Ab（或Ag）是否出現(xiàn)凝集 若出現(xiàn)凝集，則表明有相應Ag（或Ab）存在； 若不出現(xiàn)凝集，則表明無相應Ag（或Ab）存在。 抗體的半定量檢測 將待檢標本（未知Ab）作一系列倍比稀釋后加入定量抗原（已知Ag）進行反應，以出現(xiàn)凝集反應的最高稀釋度作為Ab的效價或滴度。,應用凝集反應進行檢測，在判定結(jié)果時需考慮： 影響因素存在時會干擾凝集的出現(xiàn)：若抗原與抗體相對應，但因受多種因素影響而不出現(xiàn)特異性凝集可導致假陰性結(jié)果。 非特異性凝集可干擾結(jié)果的判斷：若抗原與抗體并不對應，但存在非特異性凝集可導致假陽性結(jié)果。,應用凝集反應進行檢測，在判定結(jié)果時需考慮： 影響因素存在時會干擾凝集的出現(xiàn)：若抗原與抗體相對應，但因受多種因素影響而不出現(xiàn)特異性凝集可導致假陰性結(jié)果。 非特異性凝集可干擾結(jié)果的判斷：若抗原與抗體并不對應，但存在非特異性凝集可導致假陽性結(jié)果。,凝集反應和沉淀反應的不同點,五、凝集反應的類型,直接凝集反應。 間接凝集反應。 其他凝集技術(shù)。,第二節(jié) 直接凝集反應 （direct agglutination test） 定義： 顆粒性抗原 + 相應抗體 肉眼可見凝集塊 （細菌，RBC等） 參與反應的抗原稱為：凝集原（agglutinogen） ； 抗體稱為：凝集素（agglutinin） 。,NS,NS,第二節(jié) 直接凝集反應 （direct agglutination test）,常用方法： 玻片法 試管法 微量血凝反應板法,一、玻片凝集試驗 （slideagglutination test）,定性試驗，常用已知Ab測定未知Ag(待檢樣本)。 結(jié)果判讀： 已知Ab 未知Ag 凝集，陽性(+)。 不凝集，陰性(-)。 方法評價：特異性強， 簡便、快速；敏感度稍低。 應用： ABO血型鑒定； 細菌的鑒別與分型。,抗 A,抗 B,1. 已知標準血清（已知抗體）,2.受檢者5%RBC懸液 （未知抗原）,3.結(jié)果判斷：,不凝集,4.根據(jù)有無凝集現(xiàn)象來判斷血型,凝集,ABO血型的鑒定,ABO血型鑒定結(jié)果示意圖,抗A標準血清,抗B標準血清,抗A標準血清,抗B標準血清,抗A標準血清,抗B標準血清,抗A標準血清,抗B標準血清,血型判斷：B型,血型判斷：O型,血型判斷：AB型,血型判斷：A型,某檢驗人員在實際工作中，出現(xiàn)了ABO血型的定型錯誤。請你分析造成此錯誤的可能原因有哪些？ 技術(shù)問題： 責任心不強，未按要求操作； ABO標準血清質(zhì)量不高：效價太低、親和力不強，誤判為陰性反應； 紅細胞濃度過淡或過濃：導致抗原抗體比例不適當，誤判為陰性反應； 各種原因引起的紅細胞溶解（溶血），誤判為陰性反應； 操作器材不潔，紅細胞被細菌污染，紅細胞自凝（冷凝集）、假凝集及細菌性凝集等干擾了結(jié)果的判斷，可出現(xiàn)假陽性。 如何避免？ 愛崗敬業(yè)，規(guī)范操作，試劑避免細菌污染。 所用器材必須干燥清潔、防止溶血。 設置對照：陽性對照、陰性對照、自身對照等。,某檢驗人員在實際工作中，出現(xiàn)了ABO血型的定型錯誤。請你分析造成此錯誤的可能原因有哪些？ 被檢RBC問題： 受檢者紅細胞上抗原位點過少，如亞型；或白血病、惡性腫瘤等導致抗原減弱，弱凝集，誤判為陰性反應。 由于細菌感染使紅細胞出現(xiàn)獲得性類B抗原，易誤判為陽性。 如何避免？ 用已知血型的標準紅細胞檢查待檢血清中未知的抗體。 通常采用試管法。,細菌的鑒別,用已知細菌診斷血清檢測待檢細菌 方法： 輕搖玻片，12分鐘后觀察 結(jié)果判定：右側(cè)為陰性對照，不凝集時結(jié)果有效 若左側(cè)出現(xiàn)凝集塊為陽性，反之為陰性 根據(jù)左側(cè)是否出現(xiàn)凝集來判斷待檢菌的種類,NS待檢菌診斷血清,NS待檢菌,二、試管凝集試驗 (tube agglutination test),試管法：半定量試驗。 常用已知Ag，測定未知 Ab(待檢血清)。 方法評價： 特異性易受影響； 敏感性不高。 應用： 多用以測定抗體的含量（效價、滴度）。 肥達氏反應、外斐氏反應、交叉配血試驗。,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,棄掉0.5,試管凝集試驗原理,結(jié)果,1 2 3 4 5 6 7,菌液,結(jié)果觀察：觀察管底是否有凝集現(xiàn)象。 完全凝集（）：凝集塊完全沉于管底，液體澄清。 75%凝集（）：凝集塊沉于管底，液體稍混。 50%凝集（）：凝集塊沉于管底，液體混濁。 以上結(jié)果均為陽性，均出現(xiàn)肉眼明顯可見的凝集。 25%凝集（弱陽性）：液體混濁。 陰性：無變化。 結(jié)果判讀： 以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象（“”）的最高稀釋度作為Ab的效價（含量）。,第三節(jié) 間接凝集反應 (indirect agglutination test),一、載體種類 二、間接凝集反應類型 三、間接血凝試驗 四、膠乳凝集試驗 五、間接凝集試驗的應用,間接凝集試驗：用人工方法將可溶性抗原(或 抗體）吸附或偶聯(lián)于載體上，使之成為致敏 載體顆粒，再與相應抗體（或抗原）作用， 在適宜電解質(zhì)的參與下，出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。,優(yōu)點：敏感度比直接凝集反應高 28倍，亦明顯高于沉淀反應。,間接凝集反應（indirect agglutination test） 可溶性抗原+載體顆粒致敏顆粒+相應抗體凝集塊 （RBC、膠乳顆粒等）,載體,可溶性抗原,致敏,NS,致敏顆粒,凝集,載體(carrier):試驗體系中與免疫無關(guān)的顆粒。,對載體的要求： 不溶于水，在NS中性質(zhì)穩(wěn)定，無化學、血清學活性。 大小均一，短時間內(nèi)不致下沉。 能夠直接吸附或偶聯(lián)抗原或抗體，且不影響其活性。,致敏：抗原(或抗體)偶聯(lián)于顆粒表面的過程。,致敏顆粒（sensitized particle):吸附有已知抗 原或抗體的顆粒。,載體,可溶性抗原,致敏,致敏顆粒,NS,凝集顆粒,間接凝集試驗示意圖,間接凝集試驗示意圖,一、常用載體種類,紅細胞： 新鮮紅細胞吸附蛋白質(zhì)的能力差。一般先醛化后應用。 聚苯乙烯膠乳顆粒： 可物理吸附蛋白質(zhì)；常制備帶有化學活性基團的顆粒。 活性炭： SPA：,二、間接凝集反應類型,根據(jù)致敏用的試劑和反應方式分為：,2.反向間接凝集試驗（reverse indirect agglutination test）,3.間接凝集抑制試驗（indirect agglutination inhibition test）,1.(正向)間接凝集試驗（indirect agglutination test）,4.協(xié)同凝集試驗 （coagglutination test）,載體,可溶性抗原,致敏,致敏顆粒,NS,凝集顆粒,1.（正向）間接凝集試驗,用特異性抗原致敏載體，檢測標本中的相應抗體的方法。,待測抗體,結(jié)果判讀：凝集，陽性(+)。 不凝集，陰性(-)。,2. 反向間接凝集試驗,用特異性抗體致敏載體，檢測標本中的相應抗原的方法。,載體,已知抗體,致敏,致敏顆粒,NS,凝集顆粒,待測抗原,結(jié)果判讀： 凝集，陽性(+)。 不凝集，陰性(-)。,3.間接凝集抑制試驗,待測抗原,已知抗體,特異結(jié)合,抗原抗體復合物,NS,致敏顆粒,用抗原致敏載體及相應抗體作為診斷試劑，用于檢測標本中是否存在與致敏載體相同的抗原。,無凝集顆粒為陽性,間接凝集抑制試驗,待測抗原,已知抗體,無結(jié)合,抗原抗體分散,NS,致敏顆粒,有凝集顆粒為陰性,原理,4.協(xié)同凝集試驗,SPA能與血清中的IgG類抗體的Fc段非特異性結(jié)合，而兩個Fab段暴露在葡萄球菌菌體表面，仍然保持正常的抗體活性，與特異性抗原相遇時，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。,應用,微生物的快速診斷、定種及定型；以協(xié)助傳染病的早期診斷。,原理圖,IgG,SPA,SPA- IgG,待測抗原,SPA- IgG-待測抗原凝集顆粒,混合,加入,原理,三、間接血凝試驗(被動血凝試驗),將可溶性抗原(或抗體）吸附人的“O”型血紅細胞或綿羊或家兔的紅細胞，制成致敏血紅細胞,與相應抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)參與下，出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。,RBC為載體： 動物，或人的“0”型血RBC 醛化紅細胞： 用戊二醛處理，成團，不易搖散；吸附大，耐溫，耐凍融。 致敏紅細胞保存時間短，易變脆、溶血、被污染，因此在致敏前醛化。 致敏醛化紅細胞：用Ag/Ab直接或化學聯(lián)結(jié)，與RBC作用，吸附于RBC的過程。,（indirect hemagglutination test),紅細胞,抗原,致敏,致敏紅細胞,NS,紅細胞凝集,間接血凝試驗,間接血凝試驗原理,待測抗體,結(jié)果示意圖,-,+,+,+,+,+,結(jié)果判斷: 效價？,方法評價： 敏感性較強、簡便、快速、成本低廉,原理,四、膠乳凝集試驗,將可溶性抗原(或抗體）與膠乳結(jié)合后，直接與待測標本中相應抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應。,方法評價： 1.膠乳顆粒的性能比 RBC穩(wěn)定、均一性好 2.與抗原結(jié)合的能力 及凝集性能不如RBC,（indirect hemagglutination test),應用: 類風濕因子檢測等,1. 抗體的檢測 檢測細菌、病毒寄生蟲感染后產(chǎn)生的抗體 自身免疫病患者的抗體的檢測 變態(tài)反應患者的抗體的檢測 2. 抗原的檢測,五、間接凝集試驗的應用,檢測甲胎蛋白（AFP）、HCG等抗原,第四節(jié) 其它凝集技術(shù),一、抗球蛋白試驗 (antiglobulin test) 二、自身紅細胞凝集試驗 (autologous red cell agglutination test) 三、冷凝集試驗 (cold agglutination test),原理,一、抗球蛋白試驗(Coombs試驗),機體受某些抗原刺激后產(chǎn)生“不完全抗體”，其與相應抗原結(jié)合后不出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象，但能封閉抗原決定簇，使其不能再與完全抗體結(jié)合。,類型,(antiglobulin test),1.直接法 2.間接法,方法：將人球蛋白，注入異種動物，獲得抗球蛋白。此種抗體加入表面結(jié)合有不完全抗體的紅細胞的復合物中，就能出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象。,是檢測抗紅細胞不完全抗體的一種非常經(jīng)典的方法。 RBC不完全抗體(IgG) RBC不凝集。 RBC不完全抗體(一抗) 抗球蛋白抗體(二抗) RBC凝集。 常用方法： 直接Coombs試驗：檢測RBC上的不完全抗體。 間接Coombs試驗：檢測游離在血清中的不完全抗體。,直接法,作用：檢測紅細胞表面結(jié)合的不完全抗體。 臨床意義：新生兒溶血癥和自身免疫性溶血性貧血的診斷。,RBC為Rh+,7S的IgG,體內(nèi)發(fā)生,+,抗IgG,體外測試,抽血,間接法,作用：檢測游離在血清中的不完全抗體。 臨床意義：輸血前的交叉配血、不相溶輸血后的抗體檢測。檢測母體 Rh（D）抗體有助于及早發(fā)現(xiàn)及避免新生兒溶血癥。,RBC為Rh+,不完全抗 體試劑,+,抗IgG,體外測試,二、自身紅細胞凝集試驗,原理類似于間接血凝試驗。 區(qū)別點：RBC為受檢者新鮮RBC。 所用抗體為雙功能抗體(即能結(jié)合紅細胞，也能結(jié)合待檢抗原)。 反應特點： 1.受檢標本為全血，不需分離血清。 2.采手指血或耳垂血，立刻檢測出結(jié)果。 3.已成功應用于抗HIV抗體的檢測。,概念,三、冷凝集試驗,冷凝集素是紅細胞某些抗原的自身抗體，只能在低溫時與其相應的抗原結(jié)合。,(cold agglutination test),冷凝集反應在 4時最強烈，紅細胞凝集最明顯；溫度升高后，抗原抗體復合物解離，凝塊消失。,意義,原理,冷凝集素增高常見于：單核細胞增多癥和支原體肺炎。惡性淋巴瘤呈現(xiàn)慢性增高。,冷凝集試驗原理,抗原決定簇隱含，不能與抗體結(jié)合,混 合,暴露的抗原決定簇與抗體結(jié)合,混 合,37,4,37,練習題: 1.下列那種抗原不是顆粒性抗原（ ） A.金黃色葡萄球菌； B.傷寒桿菌； C.紅細胞； D.抗原包被的乳膠微粒； E.細菌外毒素,2.肥達氏反應的原理是（ ） A.直接凝集； B.間接凝集； C.間接凝集抑制試驗； D.沉淀反應； E.補體結(jié)合,3.交叉配血試驗屬于（ ） A.直接