實(shí)驗(yàn)?zāi)c道致病菌分離鑒定.ppt

錄像：球菌 操作：1、化膿性球菌分離鑒定（二） （1）革蘭染色 （2）轉(zhuǎn)種甘露醇或血清肉湯 （3）血漿凝固酶實(shí)驗(yàn) （4）觸酶實(shí)驗(yàn) 2、腸道菌分離鑒定（一） 糞便標(biāo)本接種S.S平板 材料：（1）載玻片 1-2 張/人 （2）甘露醇或血清肉湯 1支/人 （3）新鮮兔血漿、生理鹽水 各1支/6人 （4）S.S平板 1塊/人 （5）糞便標(biāo)本：傷寒、痢疾、副甲、副乙 1套/教室,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,了解：腸道致病菌的血清學(xué)鑒定 觸酶實(shí)驗(yàn)、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的原理 掌握： 1. 腸道致病菌分離鑒定的方法、步驟及生化反應(yīng) 2. 化膿性球菌轉(zhuǎn)種甘露醇或血清肉湯的目的 3. 觸酶、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果觀察,教學(xué)目標(biāo),觀察上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果、進(jìn)行分析,紫外線殺菌實(shí)驗(yàn),抗生素敏感試驗(yàn),抑菌圈直徑,如果細(xì)菌對(duì)藥物敏感，則在藥片周圍有抑菌圈形成，敏感度越高抑菌圈直徑越大： 20mm：極度敏感 5-20mm：中度敏感 10-15mm：輕度敏感 10mm: 不敏感 無(wú)抑菌圈: 耐藥,化膿性球菌分離鑒定（二）,膿汁,血平板,菌落,葡萄狀排列,鏈狀排列,血漿凝固酶實(shí)驗(yàn),甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn),接種,三線法,37,24h,革蘭染色,觸酶實(shí)驗(yàn),排列不典型,2、操作,革蘭染色及鏡檢 觸酶實(shí)驗(yàn) 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)種甘露醇或血清肉湯,涂片：先在玻片上放一滴生理鹽水，然后刮取菌落 在鹽水中乳化，涂成直徑約為1.0 cm的膜。 干燥：最好在室溫中自然干燥，也可在遠(yuǎn)離火焰上 方微微烘干。但切勿靠火焰以免烤焦標(biāo)本。 固定：火焰固定。 革蘭染色過(guò)程： 初染： 結(jié)晶紫 1分鐘 媒染： 碘液 1分鐘 脫色： 95%酒精 半分鐘 復(fù)染： 稀釋復(fù)紅 半分鐘 鏡檢：球陽(yáng)桿陰 陽(yáng)紫陰紅,（1）革蘭染色,葡萄球菌,鏈球菌,（2）觸酶實(shí)驗(yàn),原理：產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫生成水和分子氧出現(xiàn)氣泡。,操作步驟：,在潔凈玻片上滴一滴生理鹽水，用接種環(huán)取少許細(xì)菌培養(yǎng)物與生理鹽水中乳磨均勻，然后加3過(guò)氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3過(guò)氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。,結(jié)果觀察：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。,G+球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗(yàn)常用于G+球菌的初步分群,（3）血漿凝固酶試驗(yàn),1）原理 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，在血漿中激活劑的作用下，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白，導(dǎo)致血漿凝固；而非致病性葡萄球菌由于不產(chǎn)生此酶，故不能凝固血漿，二者可據(jù)此予以區(qū)別。,2）操作：玻片法,取干凈玻片一塊 血漿及生理鹽水各一滴，分別置于玻片兩端 用接種環(huán)取細(xì)菌少許，分別與生理鹽水及血漿充分混勻 結(jié)果觀察：30秒鐘內(nèi)鹽水中的細(xì)菌呈均勻渾濁，而兔血漿則呈塊狀或顆粒狀者為陽(yáng)性。,（4）甘露醇試驗(yàn)或血清肉湯接種,1）甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)： 接種甘露醇單糖管，觀察顏色改變及氣體產(chǎn)生 情況。 發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者，使酸堿指示劑（溴麝香 草酚蘭）在酸性環(huán)境下由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。 2）接種血清肉湯：觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài) 沉淀生長(zhǎng)？ 混濁生長(zhǎng)？ 部分沉淀，上清液混濁生長(zhǎng)？,腸道菌分離鑒定（一）,腸道桿菌是一大群寄居在人類和動(dòng)物的腸道中的生物學(xué)性狀近似的革蘭陰性的桿菌，該類細(xì)菌無(wú)芽胞，多數(shù)有周鞭毛。需氧或兼性厭氧，能分解葡萄糖及其他碳水化合物，產(chǎn)酸、有些產(chǎn)氣。,多數(shù)腸道菌是腸道的正常菌群，當(dāng)宿主免疫力降低或侵入腸道外等部位時(shí)，也可成為條件致病菌引起疾病。有的腸道桿菌例如傷寒沙門菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌等，是腸道致病菌，可導(dǎo)致人類某些腸道傳染病。,腸道菌的種類繁多，為成功地檢出病原菌，通常選用選擇或鑒別培養(yǎng)基。除提供細(xì)菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物外，還含有抑菌劑和指示劑。可有選擇性抑制某些腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)，指示劑則能鑒別細(xì)菌的生化特性。,本次試驗(yàn)以糞便為標(biāo)本進(jìn)行腸道菌的分離鑒定。糞便標(biāo)本中含有傷寒桿菌、副傷寒桿菌、痢疾桿菌以及大腸桿菌等腸道菌，要求從標(biāo)本中分離出單一的致病菌，并通過(guò)后續(xù)的試驗(yàn)鑒定出致病菌。,S.S瓊脂培養(yǎng)基中含有膽鹽、煌綠和枸櫞酸鈉等成分，不僅能抑制G+菌的生長(zhǎng)，也能抑制腸道非致病菌的生長(zhǎng)。,S.S瓊脂培養(yǎng)基,大腸桿菌在此平板上生長(zhǎng)，可分解培養(yǎng)基中乳糖產(chǎn)酸，與膽鹽作用形成膽酸沉淀，使中性紅指示劑變紅，形成紅色渾濁不透明菌落。腸道致病菌則不分解乳糖，形成無(wú)色或淡黃色菌落（因分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)）。,SS瓊脂培養(yǎng)基（Salmonella-Shigella agar）,大腸埃希菌,沙門菌,志賀菌,操作：,糞便,S.S.平板,挑選可疑菌落,培養(yǎng)24h,37,接種,三線法,腸道菌分離鑒定（一）,1、用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量糞便標(biāo)本，用劃線法 接種于S.S平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。 2、放置于37C孵箱內(nèi)培養(yǎng)18-24小時(shí)，觀