《DNA重組的操作》PPT課件.ppt

第六章 DNA重組的操作,一、粘性末端的連接 （一）同一種酶產(chǎn)生的黏性末端的連接,DNA連接酶把相互靠近的5端磷酸與3-OH連到一起 單酶切、雙酶切,第一節(jié) DNA的體外重組,DNA的體外重組：將目的基因與載體連接，這種重新組合的DNA稱為重組DNA。,兩段DNA的連接,DNA片斷與載體的連接,不足： 目的基因的正反向插入 載體或目的基因片段會(huì)自身環(huán)化 載體與多個(gè)目的基因片段之間重組,（二）不同種酶產(chǎn)生的黏性末端的連接,（一） 直接連接,T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的110%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,二、平末端（blunt end）的連接,將黏性末端變成平末端的方法：,（1）5突出黏性末端的補(bǔ)平 采用大腸桿菌聚合酶的Klenow大片段 （2）3突出黏性末端的切平 T4噬菌體DNA聚合酶或S1核酸酶,在連接反應(yīng)體系中加入： 高濃度的DNA連接酶 較高濃度的外源DNA和載體DNA 低濃度的ATP 低濃度的聚乙二醇,平末端連接存在一些缺陷： （1）連接效率低； （2）破壞限制性內(nèi)切酶原有的識(shí)別位點(diǎn)； （3） 插入沒有方向性； （4） 高底物濃度下會(huì)產(chǎn)生多拷貝外源片段插 入載體。,（1）同聚物加尾法,（二） 人工加尾形成 “粘性末端”,DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3-OH端加上脫氧核苷酸。, 原理：,分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。, 加尾堿基互補(bǔ),缺點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn)：,能把任何片段連接起來,操作繁瑣； 外源片段難以回收； 同聚物尾巴影響外源基因表達(dá)。,非酶切位點(diǎn),（2）銜接物（linker）連接,Linker：,用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端雙鏈寡核苷酸,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoR I linker：,（1）多核苷酸激酶處理,（2）T4連接酶連接,（3）限制性內(nèi)切酶消化,（4）目的片段與載體連接,（二） 人工加尾形成 “粘性末端”,（3）接頭分子 （adapter）連接法, adapter,一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG- GGCC-,-CCGG -GGCCCTAG-P5,接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接, 優(yōu)點(diǎn)：,連上后就能用。, 缺點(diǎn)：,先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。, 防止自我連接,5p-GATCCCGG- GGCC-,CCGG GGCCCTAG-p5,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-3 GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5HO-GATCCCGG- GGCC,CCGG -GGCCCTAG-OH5,5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5,nick缺口,nick缺口,HO-,-OH,CIP處理,T4 ligase,雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接 T4多核苷酸激酶處理使5磷酸化,三、PCR產(chǎn)物的連接,1.在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn),符合載體的多克隆位點(diǎn)；,（1）設(shè)計(jì)原則,（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu),5端保護(hù)堿基內(nèi)切酶識(shí)別序列 3端1520bp與模板互補(bǔ)；,避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。,引物1,GCAGAATTC,互補(bǔ)序列,模板,EcoRI位點(diǎn),5-,-3,GCAGAATTC,互補(bǔ)序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物,5-,-3,3,復(fù)性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互補(bǔ)序列,模板,BamH I 位點(diǎn),-5,3-,5,復(fù)性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互補(bǔ)序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR產(chǎn)物 互補(bǔ)序列,-5,3-,引物2,帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物,GCAGAATTC,PCR產(chǎn)物,5-,-3,CCTAGGCGC,PCR產(chǎn)物,-5,3-,CGTCTTAAG,GGATCCGCG,EcoR I位點(diǎn),BamH I位點(diǎn),AATTC,PCR產(chǎn)物,5-,-3,CCTAG,PCR產(chǎn)物,-5,3-,G,G,EcoR I,BamH I,兩頭各有一個(gè)粘性末端！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,載體,PCR產(chǎn)物,TA,TA,三、PCR產(chǎn)物的連接,2. 與T載體直接連接,四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng),插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ),相同的粘性末端才能有效地連接。,盡量避免平端連接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。,2. DNA插入的方向正確,用雙酶切,由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3. 插入基因的開放閱讀框（ORF）正確,（1）DNA定向插入,（2）起始密碼,尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。,ATGGAATTC,載體,ATGCGGAATTCT,插入片斷,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTC T,重組,但移碼突變！,4. 防止載體自身環(huán)化連接,（1）提高插入片斷的用量,連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。,（2）用堿性磷酸酶處理載體,載體切口的5磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。,5,3,載體,插入片斷,第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的原理與技術(shù),一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌,（一）轉(zhuǎn)化（transformation）,大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。,（三）轉(zhuǎn)染（transfection）,受體菌直接捕獲重組噬菌體DNA的過程。,（二）感染（transduction）,將以噬菌體DNA為載體的DNA重組分子包裝成病毒顆粒，感染受體菌的過程。,（一）轉(zhuǎn)化（transformation）,（1）Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（heat shock）,（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法（electronporation）,（3）PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,（4）接合轉(zhuǎn)化,制備感受態(tài)細(xì)胞,增加受體菌細(xì)胞膜的通透性,（1） Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法, 目的,感受態(tài)細(xì)胞：處于能吸收外源DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞,使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。,菌種,用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。,制備原理,其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。,制備過程,培養(yǎng)大腸桿菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4離心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重懸,4離心收集菌,4離心收集菌,分裝、-70 凍存,用冰冷的60mMCaCl2重懸,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重懸,1、將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌置于0的CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，處于感受態(tài)； 2、將感受態(tài)細(xì)胞與DNA混合，Ca2+與DNA結(jié)合形成抗DNase的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面； 3、經(jīng)42短時(shí)間熱激處理，細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物； 4、在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)之后，球形細(xì)胞復(fù)原并增殖。, CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA的原理,10ng 載體DNA,100L 感受態(tài)細(xì)胞,冰浴30min,42 12min,加入1mL LB培養(yǎng)基 （Amp-）,37 振蕩培養(yǎng)1h,10-100L轉(zhuǎn)化液涂Amp平板,吸附DNA,攝入DNA,操作步驟： （p140）,轉(zhuǎn)化率：106-108/g DNA,（2）電轉(zhuǎn)化法,原理：在高壓脈沖下，細(xì)菌細(xì)胞表面形成暫時(shí)性微孔，重組DNA通過微孔進(jìn)入細(xì)胞后，脈沖結(jié)束，細(xì)胞恢復(fù)原狀。 實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，不需要制備特殊的感受態(tài)細(xì)胞,“感受態(tài)”：清洗處理，在低溫下使細(xì)胞處于無離子區(qū)且有甘油或蔗糖等保護(hù)劑的懸液中，保證電擊過程中細(xì)胞不被擊穿而死亡。,轉(zhuǎn)化率：1091010/ g DNA,LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分鐘，2C離心集菌,冰冷的10%甘油重懸菌體,2C離心集菌,冰冷的10%甘油重懸菌體,2C離心收集菌體,少量冰冷10%甘油重懸,分裝成 50-300L,電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F,脈沖控制器200-400,0.5g質(zhì)粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培養(yǎng)液,37C中速震蕩60分鐘,10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板,轉(zhuǎn)化,電轉(zhuǎn)化法,3.PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 原理：PEG為細(xì)胞融合劑，可使細(xì)胞膜間或DNA與膜之間形成分子橋，從而有利于DNA分子的進(jìn)入。 步驟： （1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌細(xì)胞，用含有適量溶菌酶的等滲緩沖液剝除細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體； （2）加入待轉(zhuǎn)化的DNA和PEG等滲溶液，均勻混合，促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞； （3）離心除去PEG，將菌體涂布在特殊的固體培養(yǎng)基上，再生細(xì)胞壁，最終得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。,4. 接合轉(zhuǎn)化,接合：指通過細(xì)菌細(xì)胞之間的直接接觸導(dǎo)致DNA從 一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞的過程。 原理：非接合型質(zhì)粒由于缺少編碼接合轉(zhuǎn)移基因，不能直接通過細(xì)胞接合轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，但當(dāng)同一細(xì)胞中共存一個(gè)含有接合功能的輔助質(zhì)粒，則這些非接合型質(zhì)粒通常也會(huì)被轉(zhuǎn)移。 接合轉(zhuǎn)化法（三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法）：待轉(zhuǎn)化的受體菌、含重組質(zhì)粒DNA的供體菌、含有接合質(zhì)粒的輔助菌。,（二） 感染,將以噬菌體DNA為載體的DNA重組分子包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌的過程稱為感染；,體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。,體外包裝過程,受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。 （每g DNA能形成106噬菌斑）。,形成噬菌斑,通過受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptor site)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。,（三） 轉(zhuǎn) 染,噬菌體DNA不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，用DNA連接酶使噬菌體環(huán)化，再通過質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入受體菌的過程。,是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式,二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化 PEG1000轉(zhuǎn)化法 電擊法,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,1. 利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,酵母,原生質(zhì)體,感受態(tài),酶去壁,CaCl2 PEG,插入外源基因的載體,共轉(zhuǎn)化：將兩個(gè)以上的基因同時(shí)導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞的方法,轉(zhuǎn)化,特點(diǎn)：操作周期長(zhǎng)；轉(zhuǎn)化率受再生率影響；共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%33%。,再生,PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。 CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。,酵母,0.1mol/L LiCl處理,感受態(tài),2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化,熱激,涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子,特點(diǎn)：吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍 轉(zhuǎn)化率：103個(gè) / g DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少,3. PEG1000轉(zhuǎn)化,PEG處理酵母細(xì)胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化,畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法 （1）試劑 緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 緩沖液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 DMSO，-70保存 （2）待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備 接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30培養(yǎng)2d; 挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30振蕩培養(yǎng)過夜； 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.50.8； 室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次； 重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍， -70保存 （3）畢氏酵母的轉(zhuǎn)化 將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細(xì)胞中；加入擔(dān)體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA）以獲得最大轉(zhuǎn)化率； 37水浴孵育5min，中間混合樣品12次； 取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻； 30水浴孵育1h； 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中； 離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中； 將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30孵育34天后，鑒定；,4. 電擊轉(zhuǎn)化,（1）適于原生質(zhì)體和完整細(xì)胞 （2）轉(zhuǎn)化率高，105個(gè) / g DNA （3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈,二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞,載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)） DNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等） 種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細(xì)胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株,在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天,葉盤法的具體操作,優(yōu)點(diǎn)： 轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)單有效 轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)完整、整合位點(diǎn)穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化效率高,2、植物病毒介導(dǎo)的感染 植物細(xì)胞原生質(zhì)體感染： 以雙鏈DNA病毒-花椰菜花斑病毒作為載體，除去有關(guān)的致病基因，換上外源基因，體外包裝成病毒顆粒，感染植物細(xì)胞原生質(zhì)體，并由此再生成植株。,植物組織感染： 植物雙生病毒（Geminiviruses）為一單鏈DNA病毒。,病毒載有的外源基因易被排斥出來或被消滅掉，插入外源基因的病毒容易失去感染力及宿主范圍狹窄等問題有待解決，至今還沒有真正可使用的載體病毒。,又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。,金屬微粒加速，進(jìn)入受體細(xì)胞,3. 基因槍法（gene gun）,CaCl2、亞精胺、PEG,混合,具體操作,缺點(diǎn)： 整合效率極低。,植物細(xì)胞,原生質(zhì)體,纖維素酶和果膠酶,DNA,混合入 電擊緩沖液,電擊處理,愈傷組織,幼苗,分化,4. 電擊法（電穿孔法）,選擇培養(yǎng),5、顯微注射法 利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體（游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、分生組織）的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。 顯微注射中的一個(gè)重要問題是必須把受體細(xì)胞進(jìn)行固定。目前有三種方法： 瓊脂糖包埋法: 多聚-L-賴氨酸粘連法： 吸管支持法：,優(yōu)點(diǎn)： 方法簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高； 適用于各種植物和各種材料，無局限性； 整個(gè)操作過程對(duì)受體細(xì)胞無藥物等毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育； 缺點(diǎn)： 工作效率低，需要精細(xì)操作和精密儀器，難以進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)化。,6、花粉管通道法 主要原理：授粉后，將外源DNA注入柱頭，外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。 這一技術(shù)原理可以應(yīng)用于任何顯花植物。 簡(jiǎn)便、快捷。,二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞,1. 磷酸鈣沉淀法 2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 3. 顯微注射法 4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,原理：,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,1. 磷酸鈣沉淀法,通過磷酸鈣-DNA共沉淀，將顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣局部溶解膜結(jié)構(gòu)，將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)