黃曲霉素的檢測方法王慧.ppt

黃曲霉素的檢測方法,王慧,由于黃曲霉素在自然界的廣泛存在和對人、畜等生物的巨 大危害性（主要為致癌性，WHO將其列為自然界最強(qiáng)的三大致癌物之一），國際上將其納入到嚴(yán)格控制的有害生物名單之中。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉素含量是國際上食品衛(wèi)生和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的必檢指標(biāo)。在我國加入WTO后，黃曲霉素（Aflatoxin）也常常成為某些國家和組織限制我國農(nóng)副產(chǎn)品出口的綠色壁壘，我國已連續(xù)多次因為黃曲霉素被檢出而遭受農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易損失?；谏鲜鲞@些原因，我們必須加強(qiáng)農(nóng)副產(chǎn)品及飼料產(chǎn)品中各型黃曲霉素檢測的工作。,世界公認(rèn)的三大致癌物：黃曲霉菌、三四苯并芘、亞硝酸鹽,黃曲霉毒主要存在于發(fā)霉的糧、油、花生中，它是黃曲霉及寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，毒性極強(qiáng)，可致肝癌，由于黃曲霉素是一種熱穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)，所以在烹調(diào)過程中不易破壞。預(yù)防措施主要是防霉。但如果食品已霉變產(chǎn)毒，則應(yīng)采取適當(dāng)去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾軋法及水搓法；植物油可用加堿去毒法等。 目前已分離鑒定出18種，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，都是二氫呋喃香豆素的衍生物，主要是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 以及由B1、B2在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物M1、M2 等，B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍,被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)！,難溶于水易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑,中藥材的采收、加工、銷售、直到使用需要一段相當(dāng)長的時間，如果儲存環(huán)境不合理，會造成藥材或飲片發(fā)霉變質(zhì)，特別是含油脂比較豐富的種子類藥材，更容易發(fā)生變質(zhì)，產(chǎn)生大量黃曲霉素。 2010版中國藥典，修改增加了很多項目，尤其是增加了安全性控制指標(biāo)，其中首次增加黃曲霉素控制。,在藥典一部中增加了僵蠶、酸棗仁、桃仁、胖大海、陳皮等五個品種的黃曲霉素檢查。 2010版藥典規(guī)定每1000g含黃曲霉素B1不得過5g，含黃曲霉素G2、黃曲霉素G1、黃曲霉素B2和黃曲霉素B1的總量不得過10g。,測定方法,測定黃曲霉毒素B1的方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、免疫親和層析凈化熒光光度法等,薄層分析法( TLC),最經(jīng)典、最常用，至今仍為一些檢測機(jī)構(gòu)所用，也是一種國標(biāo)方法 原理是用適宜的萃取溶劑將黃曲霉素從試樣中萃取出來，經(jīng)柱層析（它利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附能力的差異，用溶劑將混合物的組分逐一洗脫分離的一種分離方法）凈化后，再在薄板上展開后分離，利用黃曲霉素的熒光特性,根據(jù)熒光斑點(diǎn)的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)比較確定其含量，對于一些組分很復(fù)雜的試樣要雙向展開，才能獲得較高的靈敏度 TLC法設(shè)備簡單，檢測費(fèi)用低，但操作繁瑣費(fèi)時，萃取和凈化效果不理想，靈敏度差，對操作人員的身體健康存在較大程度的危害,原理是根據(jù)抗體和抗原之間特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，最后用測定酶活力的方法來增加測定的靈敏度 ELISA法將已知的待測AFB1抗原(或抗體)吸附于固定載體的免疫吸附劑上，洗滌未吸附的其他抗原和雜質(zhì),加入酶標(biāo)記的AFB1 抗體(或抗原)與樣品中的待測物(抗原或抗體)發(fā)生特異免疫學(xué)反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原一抗體復(fù)合物，洗滌后，加入酶底物，進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過顏色的深淺來測定AFB1抗原或抗體的含量。,酶聯(lián)免疫法(ELISA ),ELISA法具有特異性強(qiáng)、干擾小，樣品的預(yù)處理簡便，且快速、靈敏、高效等特點(diǎn)，而且回收率高，提取方法簡單，可以進(jìn)行定性和定量測定，并且對設(shè)備裝置的投資比HPLC降低了許多，大大節(jié)約了測試的成本，因而ELISA已廣泛用于食品中黃曲霉毒素的測定。,重復(fù)性差，假陽性概率較高,需要配置專門的酶標(biāo)儀,且對一些富含鹽和脂肪的試樣需進(jìn)行額外的處理.,藥典檢測方法(HPLC),柱后衍生：又稱柱后反應(yīng)。利用衍生反應(yīng)使被測物與相應(yīng)的試劑分析反應(yīng)，以改變其物理或化學(xué)性質(zhì)，使其被檢測到。例如將發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)鍵合到樣品中去，多極放大檢測靈敏度,免疫親和層析凈化高效液相色譜法 （IAC/HPLC),試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫-20/PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量。 將免疫親和柱與高效液相色譜法結(jié)合應(yīng)用是目前采用較多的一種方法，這些新方法新手段的快速應(yīng)用，為黃曲霉毒素的檢測提供了更廣泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測目的和要求 免疫親和柱：基于抗原抗體反應(yīng)，特異性抗體連接在柱體內(nèi)，選擇性吸附樣品中的待檢物，雜質(zhì)不被吸附，流出柱外，柱上結(jié)合的目標(biāo)物再被特定的洗脫液洗下來，可以用于液相色譜(HPLC)分析或者ELISA含量測定，是一種高效的前處理柱。,免疫親和層析凈化熒光光度法IAC/SFB,黃曲霉毒素速測儀 農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)檢中心中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所根據(jù) GB/T18979-2003研制成042NYART型黃曲霉毒素速測儀 , 本儀器采用的是免疫親和層析凈化熒光光度法 該方法的原理是利用各種黃曲霉素的熒光特性差異用熒光光度計測定試樣中黃曲霉素的含量。 試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去.以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度。洗脫液通過熒光光度計測定黃曲霉毒素總量。 該方法對檢測人員身體健康無危害