色譜分析在藥物分析中的運(yùn)用.ppt

1,色譜分析 在藥物分析中的運(yùn)用,2005年1月,2,一、概述,色譜學(xué)已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科 醫(yī)藥領(lǐng)域是色譜應(yīng)用的重要領(lǐng)域之一 液相色譜目前在常規(guī)分析儀器中的排列,3,色譜學(xué)已發(fā)展成為 一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科,色譜作為分離分析學(xué)科，已有近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展過(guò)程。進(jìn)入20世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)技術(shù)有了飛速發(fā)展，色譜學(xué)已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立學(xué)科，形成了薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、離子色譜、超臨界流體色譜、親合色譜、疏水色譜、毛細(xì)管電泳和電色譜等許多分支。 各種色譜儀與質(zhì)譜，紅外核磁等技術(shù)聯(lián)用儀器已成為令人矚目的高新技術(shù)產(chǎn)品。,4,醫(yī)藥領(lǐng)域是色譜應(yīng)用的 重要領(lǐng)域之一,在藥物分析中，利用色譜分析方法顯得更為重要，尤其是高效液相色譜法（HPLC）是目前藥物分析中最常用的分析手段。它主要用于復(fù)雜成分、混合物的分離，即可用來(lái)作藥物的定性、定量及雜質(zhì)檢查。 由于高效液相色譜法分析樣品的范圍不受沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、相對(duì)分子質(zhì)量大小及有機(jī)物與無(wú)機(jī)物的限制，使其應(yīng)用范圍極廣。 一般說(shuō)來(lái)，只要能將樣品制成溶液，就可分析。且分離速度快，靈敏度高，色譜柱可反復(fù)使用，可選擇的流動(dòng)相比氣相色譜法多。流出組分不被破壞，且容易收集，可在室溫下操作，絕大部分藥物均可用高效液相色譜法來(lái)作。,5,液相色譜目前在常規(guī)分析 儀器中的排列,在2000年版一、二部藥典中，用高效液相色譜法測(cè)定的品種比1995年版藥典成倍地增加，2005年版一、二部藥典又增加幾倍。而高效液相色譜法在幾種儀器分析方法中，其分析數(shù)量的排列為第二，因其分離效率高，又能準(zhǔn)確地反映所測(cè)成分的真實(shí)含量。中國(guó)藥典應(yīng)用高效液相色譜法的情況，目前僅次于美國(guó)藥典，而優(yōu)于英國(guó)藥典和日本藥局方。,6,二、共同探討高效液相色譜 在實(shí)際操作中的部分問(wèn)題,高效液相色譜方法的建立 色譜分離類型的選擇 溶劑的選擇 溶劑純化 溶劑的脫氣 樣品溶劑的選擇 檢測(cè)器的選擇 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 無(wú)參比標(biāo)準(zhǔn)的純度評(píng)價(jià) HPLC在藥物分析中的應(yīng)用范圍,7,高效液相色譜方法的建立,應(yīng)用HPLC對(duì)樣品進(jìn)行分離、分析，主要根據(jù)樣品的性質(zhì)，選擇合適的分離類型及所用的色譜柱和流動(dòng)相、檢測(cè)器等。 （一）樣品的性質(zhì) 樣品中待測(cè)組分的分子量大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解性等化學(xué)、物理性質(zhì)決定著色譜分離類型的選擇。,8,色譜分離類型的選擇,高效液相色譜的各種方法有其各自的特點(diǎn)和應(yīng)用范圍，應(yīng)根據(jù)分離分析的目的，樣品的性質(zhì)和含量、現(xiàn)有的設(shè)備條件等選擇合適的方法。通常分離類型應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)（如相對(duì)分子質(zhì)量的大小，化學(xué)結(jié)構(gòu)，溶解性及極性等）來(lái)選擇，并根據(jù)此條件選擇色譜柱和流動(dòng)相。,9,溶劑的選擇,在高效液相色譜分析中，流動(dòng)相的種類、配比，對(duì)色譜分離效果影響很大，可供選擇的固定相填料種類較少。因此，流動(dòng)相的選擇顯得自關(guān)重要。 （1）溶劑純度要高 （2）不能引起柱效損失或保留特性變化 （3）常用固定相與流動(dòng)相的選擇 （4）溶劑系統(tǒng)的選擇常用 （5）緩沖系統(tǒng)及緩沖溶液的處理,10,溶劑純化,在HPLC分離測(cè)定中，溶劑的純度是很關(guān)鍵的。溶劑足夠純才不至于產(chǎn)生問(wèn)題，對(duì)溶劑純度的要求依應(yīng)用情況而定。,11,溶劑的脫氣,液相色譜儀的檢測(cè)器常被溶劑中的氣泡干擾，氣泡的形成是由于被空氣飽和的溶劑從高壓流向低壓，如柱出口，這些氣泡形成干擾檢測(cè)器光學(xué)道路的折射表面。因此，限制氣泡和伴隨的噪音的常用辦法是在用前從溶劑中除去氣泡。常用的脫氣方法有真空泵脫氣法和煮沸脫氣法。 1真空泵脫氣 2煮沸脫氣法 3溶劑的濾過(guò),12,樣品溶劑的選擇,樣品的溶劑應(yīng)對(duì)樣品溶解性大，且對(duì)樣品穩(wěn)定并與檢測(cè)器相匹配，最好與流動(dòng)相相同，這樣可允許大量的進(jìn)樣量，但待測(cè)物的洗脫不應(yīng)受影響，當(dāng)樣品溶劑與流動(dòng)相不同時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)樣品溶劑的峰。,13,14,緩沖溶劑的注意事項(xiàng),色譜柱使用的流動(dòng)相pH值范圍為2.57.5為宜。酸性太強(qiáng)會(huì)使鍵合的烷基脫落，堿性太強(qiáng)會(huì)使硅膠溶解，通常用緩沖液維持一定的pH值。緩沖液濃度范圍為0.0050.5mol/L，盡量用稀溶液為好，在用水和有機(jī)溶劑系統(tǒng)中，應(yīng)注意鹽的存在會(huì)改變?nèi)軇┑目苫旌闲?，在色譜分離過(guò)程中，絕不能發(fā)生相的分離和鹽的沉淀。在HPLC中，最常用的緩沖溶液是醋酸鹽和磷酸鹽緩沖液。,15,檢測(cè)器的選擇,HPLC檢測(cè)中，當(dāng)樣品有紫外吸收時(shí)，常選用紫外檢測(cè)器，在藥物分析文獻(xiàn)中，用紫外檢測(cè)器的占95%以上，使用時(shí)要注意溶劑的使用波長(zhǎng)，即溶劑的極限波長(zhǎng)必須低于檢測(cè)波長(zhǎng)。若使用熒光檢測(cè)器或電化學(xué)檢測(cè)器，可使靈敏度提高23個(gè)數(shù)量級(jí)，但不是所有化合物都有熒光，無(wú)熒光的物質(zhì)可經(jīng)衍生化作用形成熒光的化合物。電化學(xué)檢測(cè)適用于有氧化還原性的藥物。,16,系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn),當(dāng)選用HPLC方法后，不同操作者各實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性應(yīng)引起注意。在HPLC中，很難實(shí)現(xiàn)很好的重現(xiàn)性，因有許多具有相同名稱的填料，由于生產(chǎn)廠家不同，性質(zhì)也不盡相同。有許多HPLC填料或柱隨著使用而變壞，其原因是填料的水解或柱死體積因填料溶解而增加，因此面臨著色譜柱是否與建立方法時(shí)的柱效相同的問(wèn)題。 當(dāng)用HPLC方法時(shí)，系統(tǒng)要有合適的性能，系統(tǒng)性能受所用的色譜柱和溶劑的影響，通常用分離度，理論板數(shù)和峰拖尾因子等幾個(gè)基本參數(shù)來(lái)測(cè)定系統(tǒng)性能。,17,峰形狀是用于控制系統(tǒng)適用性的另一色譜參數(shù)，監(jiān)測(cè)峰形的重要方法之一是測(cè)定理論板數(shù)，但因用峰寬或半峰寬的計(jì)算不能表示峰是否拖尾，所以用于測(cè)量理論板數(shù)的方法并不標(biāo)準(zhǔn)，而在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，峰拖尾程度可以作為衡量柱效的另一指標(biāo)，峰拖尾程度用拖尾因子表示。拖尾因子（T）定義為： 式中W0.05h為0.05倍峰高處的峰寬；d1為峰的前沿到峰出現(xiàn)極大值時(shí)的水平距離，如圖。,18,中國(guó)藥典2000年版和usp(24) 均規(guī)定在峰高5%處測(cè)定峰寬。 由于噪音及其他因素影響基線的 穩(wěn)定性峰高5%處的峰寬值易受 其影響，從而干擾測(cè)定結(jié)果，有 人在峰高10%處測(cè)定，重現(xiàn)性較 好。峰拖尾程度對(duì)柱死體積和柱填料的變化很敏感，因此可作為衡量柱能否再用的標(biāo)準(zhǔn)。總之，柱性能是否處于良好水平，可使用關(guān)鍵的參數(shù)（如校正線的斜率，理論板數(shù)和峰拖尾程度來(lái)衡量。當(dāng)這些參數(shù)超過(guò)允許范圍時(shí)，就不應(yīng)再用此柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。,19,無(wú)參比標(biāo)準(zhǔn)的純度評(píng)價(jià),HPLC已成為鑒定藥物純度的主要工具，用于鑒別和檢查樣品中的雜質(zhì)，首先要求分離完全，為此要選擇合適的色譜條件將雜質(zhì)、降解產(chǎn)物與主分分離，評(píng)價(jià)雜質(zhì)的主要問(wèn)題是雜質(zhì)的定量，可在相同的色譜條件下將雜質(zhì)的峰面積與已知濃度的對(duì)照品的峰面積進(jìn)行比較，但通常雜質(zhì)是未知的，因此為測(cè)定樣品中未知雜質(zhì)的濃度，就需要做一些假設(shè)。,20,HPLC在藥物分析中的應(yīng)用范圍,HPLC法在藥物分析中常用于藥物的鑒別和檢查 1、利用已知物對(duì)照法定性 2、色譜法與其他方法結(jié)合定性 （1）利用化學(xué)反應(yīng)定性 （2）利用二極管陣列檢測(cè)器來(lái)測(cè)定各組分的紫外吸收光譜。 （3）收集峰的流出物，經(jīng)濃縮蒸除溶劑，進(jìn)行IR.MS和NMR鑒別。 （4）液-質(zhì)聯(lián)用儀 3、定性分析,21,定性分析,1、利用已知物對(duì)照法定性 2、利用保留特性 3、色譜法與其他方法結(jié)合定性 （1）利用化學(xué)反應(yīng)定性 （2）利用二極管陣列檢測(cè)器來(lái)測(cè)定各組分的紫外吸收光譜。 （3）收集峰的流出物，經(jīng)濃縮蒸除溶劑，進(jìn)行IR.MS和NMR鑒別。 （4）液-質(zhì)聯(lián)用儀,22,定量分析,1、校正因子 2、定量分析方法的種類 （1）峰面積歸一化法 （2）外標(biāo)法 （3）內(nèi)標(biāo)法,23,三、微柱色譜實(shí)用性進(jìn)展,微柱液相色譜法與普通液相色譜法的比較 微柱液相色譜的應(yīng)用范圍,24,微柱液相色譜法的實(shí)用性進(jìn)展,微柱液相色譜法與普通液相色譜的比較 分類 應(yīng)用 快速藥物分析 在藥物分析中，復(fù)方制劑分析和治療藥物監(jiān)測(cè)非常適合用微柱，進(jìn)行快速分析。分析APC片中的3種主藥，用100mm1mm微柱，填充3m的ODS，用乙腈-5mmol/L辛基磺酸鈉溶液（18:20）為流動(dòng)相，20s內(nèi)分離即完畢，50個(gè)樣品15min內(nèi)即完成。流動(dòng)相只需14ml，為常規(guī)柱的1/21。,25,微柱液相色譜法的實(shí)用性進(jìn)展,微柱液相色譜法與普