實(shí)驗(yàn)二α-淀粉酶的初步純化.ppt

實(shí)驗(yàn)二 -淀粉酶的初步純化,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握酶制劑提取工藝流程。 掌握淀粉酶的分離方法、純化方法、濃縮方法和干燥方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理,發(fā)酵液,預(yù)處理（細(xì)菌絮凝）,固液分離（離心、過濾）,菌體（胞內(nèi)酶） 動(dòng)植物源酶,液體（胞外酶）,細(xì)胞破碎,提取,固液分離,液體,工業(yè)、食品、飼料,濃縮 （蒸發(fā)、超濾、沉淀）,濃縮液,配方,干燥,醫(yī)藥、分析、科研,液體酶,固體酶,濃縮,分離純化 （離心、沉淀、膜分離、 層析、電泳、萃取、結(jié)晶）,配方、制劑,干燥,液體酶,固體酶,二、實(shí)驗(yàn)原理,-淀粉酶是一種胞外酶，胞外酶的初步分離純化通常是將發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后采用過濾或離心的方法將酶液與菌體分離，然后在酶液中加入(NH4)2SO4 鹽析沉淀獲得酶泥，最后干燥即可。,二、實(shí)驗(yàn)原理,在酶的分離純化過程中，每步都需要測(cè)定酶活力、體積，以計(jì)算酶的總活力和比活力，進(jìn)而計(jì)算酶活力回收率和純化倍數(shù)，以監(jiān)測(cè)每步純化步驟中酶的回收和純化效果，從而可以判斷每步所使用的純化手段是否適宜目的酶的分離。,二、實(shí)驗(yàn)原理,鹽析法是蛋白質(zhì)溶液中加入鹽到一定限度后繼續(xù)加鹽，蛋白質(zhì)從溶液中析出。其原理主要是蛋白質(zhì)在高鹽離子濃度下表面電荷被中和，水膜被破壞，蛋白質(zhì)分子間疏水部分吸引力增加，以致沉淀析出。 Ks分段鹽析 、分段鹽析,二、實(shí)驗(yàn)原理,有機(jī)溶劑沉淀法是利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。 有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。從而使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集。 有機(jī)溶劑與水相互作用，破壞溶質(zhì)分子表面的水膜，使其溶解度降低而沉淀析出。,三、儀器和試劑,儀器： 分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋（控溫精度0. 1）、干燥箱、離心機(jī)、移液管、試管、燒杯、容量瓶、玻璃棒、三角瓶、秒表、標(biāo)簽、培養(yǎng)皿、量筒、漏斗、中速濾紙。 試劑： 碘、碘化鉀、 -淀粉酶制劑、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鹽酸、可溶性淀粉（湖州展望化學(xué)藥業(yè)有限公司）、氯化鈣、磷酸氫二鈉、硫酸銨、乙醇。,四、實(shí)驗(yàn)方法,發(fā)酵液的預(yù)處理 將發(fā)酵液收集起來，過濾濾去菌體，收集濾液，測(cè)量其體積。取5 mL出來留作淀粉酶的活力測(cè)定，剩余發(fā)酵液則進(jìn)行初步純化。在剩余發(fā)酵液中加入CaCl2 和Na2HPO4 各0.8%-1%進(jìn)行絮凝作用，并加熱到5560 處理30 min，以破壞蛋白酶，促使膠體凝聚后再過濾，收集濾液，測(cè)量其體積，并測(cè)酶活力(留樣下次實(shí)驗(yàn)時(shí)候測(cè)定）。,四、實(shí)驗(yàn)方法,硫酸銨鹽析沉淀-淀粉酶 取100ml濾液，按硫酸銨的飽和度為55的比例，將硫酸銨緩慢加入到收集的濾液中，一邊加(NH4)2SO4，一邊輕輕攪拌。盡量避免液面泛起白色泡沫。完全溶解后在4下沉淀過夜，使上清液中的蛋白質(zhì)沉淀下來。次日將三角瓶取出，將溶液以4 000 rmin-1 轉(zhuǎn)速離心15 min，收集沉淀，然后在烘箱中于5060 干燥（損失率應(yīng)不高于30），即得粗酶制劑。,四、實(shí)驗(yàn)方法,有機(jī)溶劑沉淀-淀粉酶 在50ml濾液中，一邊緩慢加入冰凍乙醇，一邊輕輕攪拌，至乙醇終濃度為70%，觀察有無沉淀析出。亦可在4下沉淀過夜，使上清液中的蛋白質(zhì)沉淀下來。次日將三角瓶取出，將溶液以4 000 rmin-1 轉(zhuǎn)速離心15 min，收集沉淀，室溫風(fēng)干，即得粗酶制劑。,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果,酶的總活力（即酶產(chǎn)量） 酶液總體積酶的比活力 酶的純化倍數(shù) 某純化步驟的比活力/第